朱新術(shù),趙文慧,張曉蕾,林 波,劉 超,張 苗,陳 菲

(1.江蘇護理職業(yè)學(xué)院醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院,江蘇淮安 223005;2.江蘇護理職業(yè)學(xué)院醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)部,江蘇淮安 223005)

木聚糖酶是一類能夠特異降解木聚糖的酶類,在造紙、動物飼料、廢水處理和食品工業(yè)等領(lǐng)域都有重要應(yīng)用[1-3]。在食品工業(yè)領(lǐng)域,主要用于改善面包品質(zhì)、澄清果汁、液化蔬果。酶解產(chǎn)物木寡糖還能以益生元的形式作為食品添加劑使用[3],例如添加木聚糖酶酶解黑小麥不溶性膳食纖維的酶解產(chǎn)物,可對谷物擠壓膨化產(chǎn)品品質(zhì)提升具有較好的改善作用[4]。

木聚糖酶已在畢赤酵母GS115中實現(xiàn)高效表達[5-6],但是其常用的BMGY和BMMY等復(fù)合培養(yǎng)基含有昂貴的酵母粉和蛋白胨,成分復(fù)雜且不明確,目標蛋白純化困難,不利于產(chǎn)業(yè)類似化生產(chǎn)[6]。當(dāng)前重組畢赤酵母最常用的合成培養(yǎng)基是基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基BSM。FM22是在BSM基礎(chǔ)上改進后的另一種常用合成培養(yǎng)基,具有氮源豐富、適應(yīng)性強[7]、縮短發(fā)酵延遲期和發(fā)酵時間等優(yōu)點[8]。當(dāng)pH高于5.5時,BSM和FM22培養(yǎng)基就會出現(xiàn)乳白色渾濁,特別是添加微量元素溶液PTM1/PTM4[7-8]時,沉淀增加明顯,原因是形成了不溶性的銅、鈷、亞鐵、鋅等磷酸鹽,而大部分畢赤酵母重組蛋白的發(fā)酵過程中pH在5.5和7.0之間變化[9]。發(fā)酵過程大量生成金屬鹽類沉淀會嚴重阻礙細胞生長及增加下游蛋白分離純化的難度[9-11]。Zhang等研究表明,甘油磷酸鈉可以代替BSM和FM22培養(yǎng)基中的磷酸/磷酸鹽,作為高效的磷源用于較高pH情況下細胞的生長和外源蛋白的表達(新型培養(yǎng)基命名為FMG)[11-13]。

本文首先通過單因素實驗與t檢驗[14]分析重組畢赤酵母在多種培養(yǎng)基中的生物量、酶活力與比酶活,并確定FMG為最適初始培養(yǎng)基。然后通過Plackett-Burman試驗[14-15]和逐步回歸[16-17],篩選出影響重組畢赤酵母表達木聚糖酶酶活力誘導(dǎo)培養(yǎng)基的關(guān)鍵培養(yǎng)基成分,并利用皮爾遜相關(guān)性分析[18],對非關(guān)鍵培養(yǎng)基成分高低濃度做出合理取舍,從而為進一步的優(yōu)化分析提供實踐基礎(chǔ)與理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

pET-28a-xynZF-2重組載體 由新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院微生物實驗室饋贈;畢赤酵母(Pichiapastoris)、GS115、pPIC9K表達質(zhì)粒 購自Invitrogen公司;樺木木聚糖(Birch wood xylan) 分析純,Sigma公司;酵母粉 分析純,英國OXOID公司;蛋白胨 分析純,美國BD公司;甘油磷酸鈉 分析純,國藥集團化學(xué)試劑有限公司;甘油和甲醇 均為分析純,天津市德恩化學(xué)試劑有限公司;其他試劑 均為市售國產(chǎn)或進口分析純級。

HZQ-F160A恒溫振蕩器 上海一恒科學(xué)儀器有限公司;DC-0506低溫恒溫槽 上海比朗儀器有限公司;Neofuge 23R高速離心機 上海力申科學(xué)儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 培養(yǎng)基配制 YPD種子培養(yǎng)基:酵母粉10.0 g/L,蛋白胨20.0 g/L,葡萄糖20.0 g/L,瓊脂20.0 g/L。搖瓶生長培養(yǎng)基和誘導(dǎo)培養(yǎng)基:見表1所示。其中PTM1微量元素溶液配方[8]:CuSO4·5H2O 6.0 g,NaI 0.08 g,MnSO4·H2O 3.0 g,Na2MoO4·2H2O 0.2 g,H3BO30.02 g,CoCl20.5 g,ZnCl220.0 g,FeSO4·7H2O 65.0 g,Biotin 0.2 g,H2SO45.0 mL和蒸餾水 1000 mL。PTM4微量元素溶液配方[5]:CuSO4·5H2O 2.0 g,NaI 0.08 g,MnSO4·H2O 3.0 g,Na2MoO4·2H2O 0.2 g,H3BO30.02 g,CaSO4·2H2O 0.5 g,CoCl20.5 g,ZnCl27.0 g,FeSO4·7H2O 22.0 g,Biotin 0.2 g,H2SO41.0 mL和蒸餾水1000 mL。

表1 搖瓶生長和誘導(dǎo)合成培養(yǎng)基成分Table 1 Components of flask shaking growth and induced medium

1.2.2 菌種活化培養(yǎng) 將-80 ℃凍存的表達木聚糖酶的畢赤酵母甘油管劃線接種到Y(jié)PD活化平板培養(yǎng)基[6]中,30 ℃靜置培養(yǎng)3 d。

1.2.3 種子搖瓶培養(yǎng) 從菌種活化平板中挑取生長良好的單菌落接種到裝有25 mL YPD種子培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中,30 ℃、250 r/min培養(yǎng)20 h。

1.2.4 搖瓶生長發(fā)酵 將種子液按4%(V/V)的接種量接入裝有25 mL搖瓶生長培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中,30 ℃、250 r/min培養(yǎng)24 h。

1.2.5 搖瓶誘導(dǎo)發(fā)酵 將搖瓶生長培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h所得發(fā)酵液置于50 mL無菌離心管中,室溫,5000 r/min離心5.0 min,去上清,菌體用0.01 mmoL/L pH6.0的無菌PBS緩沖液洗滌三次并重懸,然后接種到裝有25 mL搖瓶誘導(dǎo)培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中,加入0.22 μm濾膜過濾的微量元素溶液,每24 h按0.5%(V/V)的比例加入甲醇誘導(dǎo)培養(yǎng),30 ℃、250 r/min培養(yǎng)5 d,并取樣分析。

1.2.6 測試方法

1.2.6.1 生物量檢測 細胞濃度(OD600):發(fā)酵液經(jīng)適當(dāng)稀釋后于波長600 nm可見光波長下測定吸光度[10]。OD600=600 nm吸光度值×n(n為稀釋倍數(shù))。且1 OD600=0.371 g/LDCW(細胞干重)。

1.2.6.2 木聚糖酶酶活力測定 采用改進的DNS法[19-20]測定木聚糖酶酶活力(U/mL)。酶活力單位的定義:在45 ℃和pH4.6條件下,以0.5%樺木木聚糖作為底物,以每分鐘產(chǎn)生1 μmol木糖所需的酶量為1個酶活力單位。

1.2.6.3 木聚糖酶比酶活分析 用Bradford法[21-22]測定蛋白質(zhì)濃度(mg/mL),以牛血清白蛋白作為標準蛋白。木聚糖酶的比活用下式計算:

酶的比活性(U/mg)=酶活力(U/mL)/蛋白質(zhì)質(zhì)量(mg/mL)

1.2.7 試驗設(shè)計

1.2.7.1 最適初始誘導(dǎo)培養(yǎng)基的單因素篩選 單因素實驗逐次比較重組畢赤酵母在BSM誘導(dǎo)培養(yǎng)基(PTM1)與FM22誘導(dǎo)培養(yǎng)基Ⅰ(PTM1)、FM22誘導(dǎo)培養(yǎng)基Ⅰ(PTM1)與FM22誘導(dǎo)培養(yǎng)基Ⅱ(PTM4)、FM22誘導(dǎo)培養(yǎng)基Ⅰ(PTM1)與FM22誘導(dǎo)培養(yǎng)基Ⅲ(PTM1+吐溫80)以及FM22誘導(dǎo)培養(yǎng)基Ⅲ(PTM1+吐溫80)與FMG誘導(dǎo)培養(yǎng)基(PTM1+吐溫80)培養(yǎng)基中生物量、木聚糖酶酶活力與比酶活,并以酶活力為主要指標,通過t檢驗等統(tǒng)計學(xué)方法篩選最適初始培養(yǎng)基。

1.2.7.2 Plackett-Burman試驗設(shè)計 在篩選出最適初始誘導(dǎo)培養(yǎng)基FMG誘導(dǎo)培養(yǎng)基Ⅲ(PTM1)+吐溫80的基礎(chǔ)上,利用MATLAB v8.3軟件包統(tǒng)計學(xué)工具箱中的hadamard函數(shù)實施N=12的Plackett-Burman實驗設(shè)計,即對FMG誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的7個成分(甘油磷酸鈉、(NH4)2SO4、CaSO4·2H2O、K2SO4、MgSO4·7H2O、PTM1和甲醇)實施高和低二水平的實驗研究,其中高水平用“+1”表示,低水平用“-1”表示,水平設(shè)置狀況依據(jù)是根據(jù)單因素實驗結(jié)果。實驗設(shè)計因素水平及編碼見表2與表3(其中D1-D4列為空列,用于估計誤差),評價指標為畢赤酵母生物量、木聚糖酶酶活力及其比酶活。

表2 Plackett Burman試驗設(shè)計因素水平及編碼Table 2 Factors and levels as well as codes of Plackett-Burman design

表3 Plackett-Burman試驗設(shè)計(n=3)Table 3 Design of Plackett-Burman design(n=3)

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有配方均進行三個平行實驗,結(jié)果以均值±標準誤為準。篩選最適初始誘導(dǎo)培養(yǎng)基涉及的單因素t-檢驗利用MATLAB v8.3軟件包ttest函數(shù)實施;Plackett-Burman實驗中培養(yǎng)基成分和生物量、木聚糖酶酶活力及比酶活間的多元線性模型通過MATLAB v8.3軟件包逐步回歸函數(shù)stepwise實施;Plackett-Burman實驗中培養(yǎng)基成分與三個響應(yīng)之間及三個響應(yīng)之間的相關(guān)系數(shù)通過MATLAB v8.3軟件包corrcoef函數(shù)實施。

2 結(jié)果與分析

2.1 最適初始培養(yǎng)基的單因素篩選

2.1.1 BSM誘導(dǎo)培養(yǎng)基與FM22誘導(dǎo)培養(yǎng)基Ⅰ培養(yǎng)效果對比分析 重組畢赤酵母在兩種最常見合成培養(yǎng)基的木聚糖酶表達結(jié)果見圖1。FM22培養(yǎng)基產(chǎn)酶效果好于BSM培養(yǎng)基,表現(xiàn)在前者木聚糖酶酶活力和比酶活極顯著高于后者(P<0.01),而生物量在兩種培養(yǎng)基中沒有顯著差異(P>0.05),這可能與FM22培養(yǎng)基氮源豐富、適應(yīng)性強[6]、發(fā)酵延遲期短等性狀有關(guān),所以后續(xù)實驗使用FM22培養(yǎng)基。

圖1 BSM和FM22培養(yǎng)基對菌體生長和產(chǎn)木聚糖酶的影響Fig.1 Effect of BSM and FM22 medium on cell growth and expression of xylanase注:*表示差異顯著(P<0.05);**表示差異極顯著(P<0.01),且均為兩種培養(yǎng)基相同優(yōu)化指標間的比較;圖2～圖4,同。

2.1.2 FM22誘導(dǎo)培養(yǎng)基Ⅰ(PTM1)與FM22誘導(dǎo)培養(yǎng)基Ⅱ(PTM4)培養(yǎng)效果對比分析 FM22誘導(dǎo)培養(yǎng)基添加微量元素溶液PTM1/PTM4時木聚糖酶的表達結(jié)果見圖2。FM22培養(yǎng)基添加PTM1微量元素的產(chǎn)酶效果好于添加PTM4的結(jié)果,表現(xiàn)在前者的三種測定指標均優(yōu)于后者(P=0.0367、0.0368和0.0318,均<0.05)。PTM1和PTM4包含F(xiàn)e2+、Zn2+、Cu2+、Mn2+、Na+、Co+等金屬離子及生物素等,主要用于提供畢赤酵母生長和外源蛋白表達所需的各種微量元素[23]。PTM1與PTM4的最大區(qū)別是前者Fe2+、Zn2+含量明顯高于后者,這與文獻報道這兩種離子對BMMY培養(yǎng)基情況下木聚糖酶酶活力有激活作用相一致[6],所以后續(xù)實驗使用PTM1微量元素展開研究。

圖2 微量元素溶液PTM1和PTM4對菌體生長和產(chǎn)木聚糖酶的影響Fig.2 Effect of PTM1 and PTM4 on cell growth and expression of xylanase

2.1.3 FM22誘導(dǎo)培養(yǎng)基Ⅰ(PTM1)與FM22誘導(dǎo)培養(yǎng)基Ⅲ(PTM1+吐溫80)培養(yǎng)效果對比分析 FM22(PTM1)誘導(dǎo)培養(yǎng)基添加表面活性劑吐溫80對木聚糖酶的表達見圖3。FM22誘導(dǎo)培養(yǎng)基添加吐溫80的木聚糖酶酶活力顯著高于未添加(P=0.0123<0.05),但是生物量和比酶活沒有顯著差異(P>0.05),這應(yīng)該與吐溫80等表面活性劑能夠改善細胞膜的通透性、提高酶的穩(wěn)定性和催化能力有關(guān)聯(lián)[24-25]。所以在后續(xù)培養(yǎng)基中添加吐溫80進行研究。

圖3 吐溫80對菌體生長和產(chǎn)木聚糖酶的影響Fig.3 Effect of Tween 80 on cell growth and expression of xylanase

2.1.4 FM22誘導(dǎo)培養(yǎng)基Ⅲ(PTM1+吐溫80)與FMG誘導(dǎo)培養(yǎng)基(PTM1+吐溫80)培養(yǎng)效果對比分析 FM22和FMG兩種誘導(dǎo)培養(yǎng)基的主要差別是FMG利用甘油磷酸鈉代替FM22中的KH2PO4[8](表1)。由圖4可知,重組畢赤酵母在FMG誘導(dǎo)培養(yǎng)基中木聚糖酶酶活力和比酶活極顯著高于FM22誘導(dǎo)培養(yǎng)基Ⅲ(P分別為3.81e-05和5.952e-04,均<0.01),且前者分別是后者的2.126倍和3.114倍,而生物量大小并沒有顯著差異(P>0.05)。這可能與FMG誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)初始pH較高,及文獻報道的大部分畢赤酵母重組蛋白的發(fā)酵過程中pH在5.5和7.0之間變化有直接關(guān)系[11]。此外,也說明甘油磷酸鈉可以作為更好的磷源及緩沖劑用于重組畢赤酵母表達木聚糖酶研究。

圖4 FM22和FMG培養(yǎng)基對菌體生長和產(chǎn)木聚糖酶的影響Fig.4 Effect of FM22 and FMG on cell growth and expression of xylanase

經(jīng)過以上單因素分析,最終篩選出生物量、酶活力和比酶活分別為43.9、(752.4±43.4) U/mL和(2552.4±197.2) U/mg的FMG誘導(dǎo)培養(yǎng)基作為培養(yǎng)基優(yōu)化的最適初始誘導(dǎo)培養(yǎng)基。

2.2 Plackett-Burman試驗結(jié)果分析

Plackett-Burman設(shè)計實驗結(jié)果見表4,可知酶活力與比酶活的最高值均由3號實驗(其培養(yǎng)基配方為甘油磷酸鈉 20 g/L,(NH4)2SO42g/L,CaSO4·2H2O 2 g/L,K2SO420 g/L,MgSO4·7H2O 6.0 g/L,PTM1 8.0 mL/L,甲醇10 mL/L,吐溫80 2.0 g/L)獲得,酶活力和酶比活分別為(2298.4±77.8) U/mL和(9926.3±312.2) U/mg,比優(yōu)化前的(752.4±43.4) U/mL和(2552.4±197.2) U/mg(FMG誘導(dǎo)培養(yǎng)基),分別提高了2.055倍和2.889倍。

表4 Plackett-Burman設(shè)計實驗結(jié)果Table 4 Result of Plackett-Burman design

利用MATLAB v8.3軟件包逐步回歸函數(shù)stepwise建立培養(yǎng)基成分與生物量、木聚糖酶酶活力及比酶活的多元線性回歸模型(表5)。

表5 逐步回歸模型分析Table 5 Analysis of the stepwise regressions

由表5知,所得三個回歸模型均達到極顯著(P<0.01),修正后的決定系數(shù)R2分別為0.724、0.9727和0.9515。這表明木聚糖酶酶活力和比酶活的實驗值和預(yù)測值之間具有較好的擬合度,95%以上的實驗數(shù)據(jù)變異均可通過回歸模型來解釋。而回歸方程系數(shù)的顯著性檢驗表明,這兩種響應(yīng)值均包含多個顯著因子,其中相同的極顯著因子為甘油磷酸鈉(A)、硫酸銨(B)、二水硫酸鈣(C)和PTM1(F)(P<0.01),且由其回歸系數(shù)的符號,進一步優(yōu)化需要在高水平(+1)的基礎(chǔ)上提高甘油磷酸鈉和硫酸鈣的濃度,在低水平(-1)的基礎(chǔ)上降低硫酸銨和PTM1的含量,這與文獻報道相一致[7]。甲醇作為誘導(dǎo)培養(yǎng)階段的誘導(dǎo)劑和重要碳源及能量來源,對于比酶活有顯著作用(P<0.05)。但生物量的修正回歸系數(shù)則偏低,僅為0.724,這與其回歸模型顯著性系數(shù)偏少相關(guān)聯(lián),也與前述篩選最適初始誘導(dǎo)培養(yǎng)基的單因素優(yōu)化分析中生物量的差異總是不顯著有關(guān)。綜上所述,通過Plackett-Burman設(shè)計篩選的顯著因子作為進一步實驗的優(yōu)化目標。

利用MATLAB軟件包的corrcoef函數(shù)分析培養(yǎng)基成分與響應(yīng)及響應(yīng)之間的相關(guān)系數(shù)r,結(jié)果如表6所示。可知相關(guān)系數(shù)的正負號大致與表5中回歸方程系數(shù)的正負號相同,僅酶活力與K2SO4(D)和MgSO4·7H2O(E)的正負號相反,但這兩種成分對酶活力影響均不顯著(P>0.05)。綜合考慮后,后續(xù)實驗將把它們的水平設(shè)置為中間值。此外,對于生物量來說,僅甘油(G)和甘油磷酸鈉(A)的相關(guān)系數(shù)絕對值較大(分別為0.838和0.291),而表5中僅有甘油(G)通過顯著性檢驗(P<0.01)。并且生物量與酶活力和比酶活的相關(guān)系數(shù)都很高,分別為0.597和0.309,所以后續(xù)實驗甲醇含量處于高水平(即10 mL/L)有利于提高木聚糖酶的酶活力和比酶活。

表6 Plackett-burman設(shè)計相關(guān)系數(shù)表Table 6 Correlation coefficients table of Plackett-Burman design

3 結(jié)論

本文通過單因素分析、Plackett-Burman實驗設(shè)計、基于逐步回歸的多元線性模型和相關(guān)系數(shù)分析,初步優(yōu)化了重組畢赤酵母表達木聚糖酶的誘導(dǎo)合成培養(yǎng)基。通過單因素實驗發(fā)現(xiàn)甘油磷酸鈉、硫酸銨、硫酸鈣和PTM1是影響木聚糖酶表達的關(guān)鍵培養(yǎng)基成分其中甘油磷酸鈉是比KH2PO4更適于作為重組畢赤酵母表達木聚糖酶的磷源,并得到FMG誘導(dǎo)培養(yǎng)基是最佳初始誘導(dǎo)合成培養(yǎng)基;通過Plackett-Burman實驗得到誘導(dǎo)合成培養(yǎng)基的最佳配方為甘油磷酸鈉 20 g/L,(NH4)2SO42.0 g/L,CaSO4·2H2O 2.0 g/L,K2SO420.0 g/L,MgSO4·7H2O 6.0 g/L,PTM1 8.0 mL/L,甲醇10.0 mL/L,吐溫80 2.0 g/L。在此條件下木聚糖酶的酶活力和比酶活有了大幅度的提高,分別達到(2298.4±77.8) U/mL和(9926.3±312.2) U/mg。通過相關(guān)系數(shù)分析可以對非顯著成分的濃度取值做出合理取舍。該研究為進一步優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基成分提供了重要的理論依據(jù)與實踐基礎(chǔ)。