蘇文哲,曾 慶,蔣力云,曹毅敏,李意蘭,陳宗遒,朱娉婷,景欽隆,狄 飚,胡玉山,張周斌
登革病毒(Dengue virus, DENV)是一種經(jīng)伊蚊傳播的蟲媒病毒,感染人體后可導(dǎo)致登革熱,目前已有超過100個國家和地區(qū)報道過登革熱病例[1]。DENV目前已發(fā)現(xiàn)有4個血清型(DENV-1~4),每個血清型之間存在一定的交叉反應(yīng);異型DENV的二次感染常可引發(fā)宿主的嚴(yán)重免疫反應(yīng),即所謂的抗體依賴性感染增強現(xiàn)象(antibody dependent enhancement,ADE),進(jìn)展為重癥病例(包括登革出血熱和登革休克綜合征)[2]。DENV基因組為單股負(fù)鏈RNA,全長約11 000 bps,包含1個開放讀碼框架,共編碼3個結(jié)構(gòu)蛋白(capsid/membrane/envelop, C/M/E)和7個非結(jié)構(gòu)蛋白(NS1/NS2A/NS2B/NS3/NS4A/NS4B/NS5)[2]。全球每年約有3.9億人感染DENV,其中9 600萬感染者具有明顯的臨床癥狀,絕大多數(shù)的感染者均可自愈,但該疾病所帶來的社會負(fù)擔(dān)仍然不可忽視,登革熱已經(jīng)成為全球性的公共衛(wèi)生問題[3]。目前已有針對4種血清型DENV的疫苗Dengvaxia問世,并已在國外獲批投入使用,但由于存在安全問題,未感染過DENV的人群在接種疫苗后感染可能加重臨床癥狀,因此尚未在我國投入使用[4]。
我國建國后首次有記錄的登革熱暴發(fā)疫情始于1978年,波及的省份包括廣東、廣西、云南、福建和浙江[5]。登革熱的主要傳播媒介白紋伊蚊和埃及伊蚊均在廣東省本地被發(fā)現(xiàn)過,在過去30年間,常有輸入性的登革熱病例引起的本地暴發(fā)疫情的報道;最近一次大規(guī)模的暴發(fā)疫情發(fā)生在2014年,由DENV-1型病毒引起,全省報告病例共計45 236例,其中廣州市報告病例37 340例,為近10年來最高[6]。東南亞各國氣候炎熱,衛(wèi)生條件較差,登革熱疫情常年不斷,毗鄰廣東省,是廣東省登革熱的主要輸入地[3]。近年來隨著對外貿(mào)易和外出旅游頻率的不斷提高,廣州市每年均有輸入性登革熱病例的報道,但近5年尚未有DENV-4型本地病例的報道。因此,本研究擬通過對廣州市2018年報告的輸入性DENV-4型登革熱病例血清標(biāo)本進(jìn)行分離培養(yǎng),并進(jìn)一步分析DENV-4其生物學(xué)來源,從而為本地登革熱的防控提供科學(xué)依據(jù)并累積基線數(shù)據(jù)。
1.1病例及標(biāo)本來源 本研究所涉及的輸入性登革熱病例標(biāo)本均來自2018年廣州市各醫(yī)院和區(qū)疾控中心送檢/復(fù)核的輸入性登革熱排查病例血清標(biāo)本,每份標(biāo)本均有獨立的編號,并有完整的標(biāo)本信息;標(biāo)本的使用征得患者知情同意并通過廣州市疾病預(yù)防控制中心倫理委員會批準(zhǔn);同時通過國家疾控中心傳染病監(jiān)測信息報告系統(tǒng)和廣州市疾控中心實驗室信息系統(tǒng)收集病例信息。
1.2標(biāo)本初篩和病毒分離 核酸檢測和病毒分離過程參考《登革熱診斷標(biāo)準(zhǔn)》(WS 216-2018),使用QIAamp Viral RNA Mini Kit(QIAGEN)試劑盒對血清標(biāo)本進(jìn)行核酸提取,進(jìn)而采用DENV通用型和DENV-1~4型核酸檢測試劑盒(江蘇碩世生物有限公司)進(jìn)行實時熒光定量PCR檢測。對DENV-4核酸陽性標(biāo)本在C6/36細(xì)胞進(jìn)行連續(xù)傳代培養(yǎng),傳代3次無病變者方判定為病毒分離陰性。
1.3病毒基因組測定 使用QIAamp Viral RNA Mini Kit核酸提取試劑盒(QIAGEN)對分離株進(jìn)行核酸提取,提取完畢馬上進(jìn)行基因擴增。全序列測定所用到的引物詳見表1[7]。使用SuperScriptTMIII One-Step RT-PCR System with PlatinumTMTaq DNA Polymerase試劑盒(Invitrogen)進(jìn)行擴增,反應(yīng)體系參考說明書,反應(yīng)體系總體積為50 μL。反應(yīng)條件為:55 ℃ 30 min, 94 ℃ 2 min;94 ℃ 30 s, 58 ℃ 30 s, 68 ℃ 2 min, 40個循環(huán);68 ℃ 10 min, 4 ℃ ∞。使用ABI 9700基因擴增儀進(jìn)行擴增,在完成基因擴增后,用QIAxcel全自動分析系統(tǒng)對擴增產(chǎn)物進(jìn)行分析,得到目的片段后進(jìn)行測序。序列的測定委托天一輝遠(yuǎn)基因科技公司完成。
1.5序列比對分析、進(jìn)化樹重建和重組分析 參考序列均來自NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov),一共下載了84條DENV-4型病毒的基因組序列,所選取的參考序列均是DENV-4型病毒在不同年代和不同地區(qū)的代表株,均有明確的分離時間和地點,并涵蓋了DENV-4型病毒的4個基因型。用Smart Model Selection(SMS,http://www.atgc-montpellier.fr/sms/)在線工具和貝葉斯信息準(zhǔn)則(Bayesian Information Criterion,BIC)尋找最優(yōu)核酸替換模型和參數(shù),用PhyML 3.1在線工具(http://www.atgc-montpellier.fr/phyml/)重建進(jìn)化樹,進(jìn)化樹的支長計算采用貝葉斯檢驗(aBayes)的方法[8]。核苷酸和氨基酸序列的差異分析通過MEGA 6.0軟件(Molecular Evolutionary Genetics Analysis)完成。
表1 DENV-4病毒基因組全序列測定引物
Tab.1 Primers for DENV-4 full-length sequencing
引物名稱引物序列(5′-3′)方向退火溫度/℃D4-F1TTAGTCTGTGTGGACCGACAAGGACAG正向68D4-R806AATCCTGGGTTTCTGAGTATCCAACTCTC反向66D4-F683AGTGGGGAACGGAGACGAGAGAAG正向68D4-R1406GGGTTATCGTAGCTGTCACTCCGTG反向68D4-F1088GAAGTGGCTCTGTTAAGAACCTATTGCATCGAAGC正向67D4-R1928CATCTCTTATCTCTATGGGAACTTTGCATGG反向66D4-F1642AATGGTGACGTTTAAGGTCCCTCATGC正向66D4-R2370AGAAACAAAGTAATCCCTCCAACAGCTATGC反向66D4-F2195GATTTTGGCTCTGTTGGTGGACTGCTC正向68D4-R3084ATGTGTGGGTCTTGGGCCATAGACATG反向68D4-F2696GTGAAAGGGGTGTTATCCAAAGGCAAGAG正向67D4-R3571GCACAAAGGGTGGTCACCACAACCAATATC反向69D4-F3264GAACAACAGTCACCATTCAAGAGGATTGTGACC正向68D4-R4177CATTCTTTAGAAGGGCGCTTCCCAAG反向66D4-F3917GCCCTTTCCTTGACTTTCATAAAATCAACAATGC正向66D4-R4785GCTAGAACTTGAACGTCTTCTTCTTTATCCC反向66D4-F4464TGGCAATTCCAGTCACAATGACCCTATGG正向67D4-R5314GAACTCTGGTTGATGATAAAAGTCTTGTTGTG反向65D4-F5028GAATTGGCGAACCAGATTATGAAGTGGATG正向66D4-R5852TTGCTGGAGTCACTGGAATAGGACC反向66D4-F5498CAGAGCAATAGCCCAATAGAAGATATCGAGAG正向67D4-R6554GAAGATGCCTGCTGTCATAGCTCCTAG反向68D4-F6400AATTGCCAGTTTGCCAACGTACCTTTCCTC正向67D4-R7458ATGTTAGCTGTGGACACGGCTATAGTCG反向68D4-F7079CTTGGTGTGCCGCTATTAGCAATGGGATGC正向70D4-R7877CATAGGAATCGGTTCTTCATGTCCTGGACC反向69D4-F7700GGATCTAAAATCAAGTATGCAGTGTCCAGAG正向66D4-R8708ACAGTCTGGGATTTTTCTTCTTCCCGAGGAG反向69D4-F8486TCCTTCGACAGGCTCGGCATCCTC正向70D4-R9206AGGGGCCATCTGTTCTGTGATCAGCTCTTC反向70D4-F9105GATACATCCTGGAGGACATAGATAAGAAAGATG正向66D4-R9863AGGCTAAGCGCAGGTCCCTTCTATG反向68D4-F9482GAAAGAGTTGAGAAATGGCTGAAAGAGTGTG正向66D4-R10353GCCTCCCTGGGATTTTTACGCCTCCCG反向68D4-F10247GAAGGAGTTCTGTAATTACCAACAACAAACACC正向66D4-R10716CACGAGGAAGCTGTACTCCTGGTG反向68
2.1毒株分離情況 對2018年廣州市輸入性登革熱病例的標(biāo)本進(jìn)行檢測、鑒定,最后分離培養(yǎng)得到DENV-4型毒株5株,毒株編號和信息如表2所示:
2.2核苷酸與氨基酸同源性比較 將本研究分離到的5株DENV-4型毒株與6株參考株的全基因組序列進(jìn)行核苷酸和氨基酸的同源性分析。結(jié)果顯示,4株由泰國和柬埔寨輸入的分離株(18XN11706/18XN13312/18XN16107/18XN17096)的核苷酸(氨基酸)同源性為99.2%~99.8%(99.7%~99.9%),與DENV-4型病毒Sylvatic基因型 (EF457906.1)的核苷酸(氨基酸)同源性為85.9%~86.0%(95.4%~95.5%);菲律賓輸入的病例分離株(18XN20946)與中南半島來源的4株分離株核苷酸(氨基酸)同源性為90.8%(96.7%~96.9%),與菲律賓2014年分離株(KU523871.1)的核苷酸(氨基酸)同源性為98.6%(99.1%)與DENV-4型病毒Sylvatic基因型(EF457906.1)的核苷酸(氨基酸)同源性為86.1%(95.1%)。具體結(jié)果詳見表3。
表2 廣州市2018年輸入型DENV-4毒株信息
Tab.2 Information of imported DENV-4 strains in Guangzhou, 2018
毒株編號輸入時間輸入地點基因型GenBank編號18XN117062018.05泰國ⅠMK61409318XN133122018.05柬埔寨ⅠMK61409218XN161072018.06柬埔寨ⅠMK61409118XN170962018.06柬埔寨ⅠMK61409018XN209462018.08菲律賓ⅡaMK640208
表3 廣州市2018年輸入型DENV-4毒株與參考株全序列核苷酸和氨基酸同源性比較
Tab.3 Homology comparisons of full-length genomes among reference DENV-4 strains and imported strains in Guangzhou, 2018
序列編號18XN1170618XN1331218XN1610718XN1709618XN20946AY618988.1AY762085.1EF457906.1JN638572.1KP792537.2KU523871.118XN11706—99.499.299.490.890.091.385.995.898.590.8 18XN1331299.8—99.699.890.890.091.486.095.898.690.8 18XN1610799.799.8—99.790.990.091.386.095.898.590.8 18XN1709699.899.999.9—90.890.091.485.995.898.690.8 18XN2094696.996.896.796.8—90.292.686.191.491.298.6 AY618988.197.197.096.997.097.0—90.786.090.190.290.3 AY762085.197.597.597.397.497.897.3—86.491.791.792.8 EF457906.195.695.595.495.595.195.595.7—86.086.186.0 JN638572.198.498.498.398.396.896.897.295.2—96.291.5 KP792537.299.699.699.499.596.997.297.595.598.5—91.1 KU523871.196.996.896.796.899.197.098.095.096.897.0—
注:表格右上部分為核苷酸同源性比較結(jié)果,左下部分為氨基酸同源性比較結(jié)果。
2.3DENV-4型病毒基因組全序列進(jìn)化樹重建結(jié)果 通過SMS模型選擇工具計算得出最優(yōu)的核酸替換模型為GTR(G+I)模型(General Time Reversible Model),參數(shù)選擇為G=2.069,I=0.535。進(jìn)化樹重建結(jié)果如圖1所示。從圖1中可見,4株由泰國和柬埔寨輸入的分離株(18XN11706/ 18XN13312/ 18XN16107/ 18XN17096)在進(jìn)化上較為接近,屬于DENV-4基因Ⅰ型,在GenBank上同源性最高的序列是KP792537.2(新加坡2011年分離株);菲律賓輸入的病例分離株(18XN20946)與其他4株親緣性較遠(yuǎn),屬于DENV-4基因Ⅱa型,在GenBank上同源性最高的序列是KU523871.1(菲律賓2014年分離株)和KC333651.1(廣州市2012年輸入病例分離株)。進(jìn)化樹的重建結(jié)果詳見圖1。
2.4氨基酸位點差異分析 經(jīng)過比對,5株分離株和6株參考株的E蛋白區(qū)域有9個位點出現(xiàn)差異,NS1蛋白區(qū)域有14個位點出現(xiàn)差異,NS5蛋白區(qū)域有25個位點出現(xiàn)差異;4株由泰國和柬埔寨輸入的分離株(18XN11706/18XN13312/18XN16107/18XN17096)和菲律賓輸入病例的分離株(18XN20946)序列差異較大。具體結(jié)果詳見表4、表5和表6。
注:紅色序列為廣州市2018年分離株,黑框內(nèi)標(biāo)注為輸入地和輸入時間。圖1 廣州市2018年DENV-4分離株基因組全序列進(jìn)化樹重建結(jié)果Fig.1 Phylogenetic tree based on full-length genomes of 5 imported DENV-4 strains isolated in Guangzhou, 2018
表4 廣州市2018年輸入型DENV-4毒株與參考株E蛋白氨基酸差異位點比較
Tab.4 Amino acid substitutions in E gene region among reference DENV-4 strains and 5 imported strains in Guangzhou, 2018
序列編號位點468112016032938442947849418XN11706IYSETDLSH18XN13312IYSETDLSH18XN16107IYSETDLSH18XN17096IYSETDLSH18XN20946TFLVAEFTQAY618988.1IYSVTDFTQAY762085.1TYSVANFTQEF457906.1IYSVTDFSQJN638572.1IYSVTDLSHKP792537.2IYSETDLSRKU523871.1TYSVAEFTQ
表5 廣州市2018年輸入型DENV-4毒株與參考株NS1蛋白氨基酸差異位點比較
Tab.5 Amino acid substitutions in NS1 gene region among reference DENV-4 strains and 5 imported strains in Guangzhou, 2018
序列編號位點5?9?229098105128135153246251286288351?18XN11706ASIASATVLAITQS18XN13312ASIASATVLAITQS18XN16107ASITSATVLAITQS18XN17096ASIASATVLAITQS18XN20946VNVATTAIFSFARTAY618988.1VTTAVTAILAFTQSAY762085.1VSAATTAILSFTQTEF457906.1VSITTAAILTSTQAJN638572.1VSIASATVLAITQSKP792537.2ASIASATVLAITQSKU523871.1VSVATTAIFSFART
注:*該差異位點位于抗原表位區(qū)域
廣州市地處亞熱帶地區(qū),人口超過1 000萬,白紋伊蚊分布廣泛;每年的4月份至9月份是廣州的雨季,平均氣溫在20 ℃以上,濕熱多雨的氣候條件為伊蚊的繁殖生長提供了良好的場所,為登革熱的傳播創(chuàng)造了理想的條件,因此每年的8月份至10月份通常是廣州地區(qū)登革熱流行的高峰期。衛(wèi)生死角難以清理,蚊媒密度居高不下,越冬蚊蟲無法追蹤,是廣州市登革熱防控的難題[6]。
DENV的4個血清型在東南亞地區(qū)常年流行,四季不斷,交替循環(huán)[9-10];近年來,隨著旅游業(yè)的發(fā)展和國際貿(mào)易的日益頻繁,廣州市與周邊地區(qū)特別是東南亞地區(qū)的往來日益密切,口岸檢疫部門每年都有在歸國人員和外國入境者中檢出DENV陽性者[11]。稍有不慎,輸入型病例攜帶的DENV極易在本地引起暴發(fā)甚至流行。以2014年為例,東南亞地區(qū)來源的DENV-1型病毒的基因Ⅴ型輸入病例在廣州市引發(fā)了本地大流行,建國以來規(guī)模最大的一次城市登革熱暴發(fā)疫情,病例數(shù)達(dá)到37 340例[6],DENV-1病毒在廣州逐漸呈現(xiàn)本地化的趨勢;此外,2016年之后,DENV-2型病毒本地感染病例的比例逐漸升高;此外,近5年來廣州市尚未有DENV-3/4引起本地病例的報道。部分暴發(fā)街區(qū)同時出現(xiàn)了DENV-1和DENV-2型病毒的流行,由于ADE效應(yīng)的存在,這些街區(qū)如果發(fā)生2種以上血清型的暴發(fā)流行,有極高的概率出現(xiàn)重癥登革熱病例,使得原本非常嚴(yán)峻的登革熱防控變得更加復(fù)雜[12]。
表6 廣州市2018年輸入型DENV-4毒株與參考株NS5蛋白氨基酸差異位點比較
Tab.6 Amino acid substitutions in NS5 gene region among reference DENV-4 strains and 5 imported strains in Guangzhou, 2018
序列編號位點535920122423525626727629633433537237318XN11706YTHVTATIHMVVV18XN13312YTHVTATIHMVVV18XN16107YTHVTATIHMVVV18XN17096YTHVTATIHMVVV18XN20946HSYAIVIVQVIMIAY618988.1HSHATVTIQVIVVAY762085.1HSHATVTIQVIMVEF457906.1HSYAVVTVQVIVVJN638572.1HSYVTATIHVVVVKP792537.2YTHVTATIHVVVVKU523871.1HSHAIVTIQVVMI序列編號位點52552656358663163263564264382689389418XN11706KDIRREHEKIHF18XN13312KDIRREHEKIHF18XN16107KDIRREHGKIHF18XN17096KDIRREHEKIHF18XN20946QETKQDQERTPSAY618988.1KDIKQDQERTLSAY762085.1KDIRQDQERTPSEF457906.1KEIKQDQEKTPLJN638572.1KDVKRDHERTPSKP792537.2KDIKRDHERIHFKU523871.1KDTKQDQERTPS
DENV-4型病毒根據(jù)演化路徑的不同,可分為Sylvatic、Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ一共4個基因型,其中Ⅱ型又可繼續(xù)分為Ⅱa和Ⅱb 2個分支。在全球范圍內(nèi),該型別報道較多的2個地區(qū)是東南亞地區(qū)和南美洲,這2個地區(qū)地處熱帶,都是登革熱流行最為嚴(yán)重的地區(qū),4種血清型的DENV常年交替流行[13]。在我國,DENV-4型病毒僅在云南邊境有過本地流行的報道,輸入來源均是緬甸[14];此外,在2010年,DENV-4輸入病例曾經(jīng)在廣州地區(qū)引起過暴發(fā)疫情,輸入來源是泰國[15]。
本研究中分離到的5株DENV-4型病毒均來自輸入病例,通過同源性分析和進(jìn)化樹重建可見4株中南半島輸入的分離株屬于DENV-4基因Ⅰ型,菲律賓輸入的病例分離株屬于DENV-4基因Ⅱa型,在進(jìn)化上分屬于不同的種群,這一結(jié)論與上述病例的流行病學(xué)資料是相吻合的。
DENV包膜蛋白(Envelop, E)基因共編碼495個氨基酸殘基,該蛋白包含3個結(jié)構(gòu)域(Ⅰ/Ⅱ/Ⅲ),與病毒的受體結(jié)合、免疫應(yīng)答、親嗜性和相關(guān)病理損傷高度相關(guān)[16]。本研究分離到的5株DENV-4型毒株在E蛋白結(jié)構(gòu)上共發(fā)現(xiàn)了9處氨基酸位點突變,均不涉及3個結(jié)構(gòu)域,提示DENV-4型毒株的E蛋白結(jié)構(gòu)相對穩(wěn)定。
DENV NS1基因編碼352個氨基酸殘基,在宿主體內(nèi)有2種存在形式,即二聚體的膜型NS1和六聚體的分泌型NS1[17]。NS1蛋白是DENV感染的標(biāo)志性抗原,在急性期患者的血清中可幾乎全程檢出,對病例的早期診斷具有重要的指導(dǎo)意義。此外,該蛋白可影響病毒RNA復(fù)制、免疫逃逸、宿主凝血功能和血管內(nèi)皮損傷過程。本研究分離的5株DENV-4型毒株在NS1蛋白結(jié)構(gòu)上共有14處氨基酸位點突變,有3處位于抗原表位區(qū)域(A5V,S9N,S351T),其中S9N位于FR-I亞區(qū),該變異可能影響NS1蛋白的二級結(jié)構(gòu),導(dǎo)致病毒NS1蛋白無法形成膜型的二聚體,從而影響宿主保護(hù)性抗體的產(chǎn)生,進(jìn)一步加速病毒的暴發(fā)流行。
DENV NS5基因臨近3′端,是病毒編碼區(qū)最長和最保守的區(qū)域,其編碼的NS5蛋白是病毒基因組編碼的最大蛋白(約900個氨基酸殘基),同時具有甲基轉(zhuǎn)移酶(methyltransferase, MTase)、核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶(terminal nucleotide transferase, TNTase)和RNA依賴性RNA聚合酶(RNA dependent RNA polymerase, RdRp)活性,是病毒復(fù)制過程的關(guān)鍵[18]。本研究分離的5株DENV-4型毒株在NS5蛋白結(jié)構(gòu)上共有25處氨基酸位點突變,其中6處位于該蛋白N端(1-265號氨基酸殘基),主要影響MTase活性;18處位于該蛋白C端(272-900號氨基酸殘基),主要影響TNTase和RdRp活性。
DENV遍布全球熱帶亞熱帶地區(qū),每個地區(qū)的DENV都有其獨特的演化路徑和基因特征。以往的監(jiān)測活動往往忽略了輸入性毒株,在本地病例發(fā)生的時候無法追溯到相應(yīng)的輸入來源,從而導(dǎo)致流行病學(xué)調(diào)查信息與分子流行病學(xué)溯源不一致的情況。本研究對廣州地區(qū)輸入性DENV-4型毒株進(jìn)行全基因組測定,間接掌握周邊國家地區(qū)DENV-4的基因特征,為本地登革熱的防控提供基線數(shù)據(jù),具有重要的公共衛(wèi)生意義。
利益沖突:無