郭新穎，陳 峰，楊清華，楊梅桂，戴志英

（江蘇省南通市疾病預(yù)防控制中心 理化科，江蘇 南通 226007）

花類中藥（traditional Chinese medicine flowers,TCM flowers）是一類以植物花入藥的中草藥材料的總稱，藥用的花用部位一般為干燥的單花、花序以及花的某一部分。大量的研究證明，許多花類中藥提取物具有良好的養(yǎng)生保健與臨床應(yīng)用，能夠有效緩解血脂紊亂、糖尿病、高血糖和炎性疾病[1]，一些常見的花類中藥普遍成為人們茶余飯后就地取材的日常營(yíng)養(yǎng)保健品。羥自由基（·OH）作為一類普遍參與人體代謝活動(dòng)的活性氧自由基，需要外界和體內(nèi)提供大量抗氧化劑進(jìn)行清除。基于此，花類中藥的抗氧化活性性能研究逐漸成為許多學(xué)者的研究熱點(diǎn)[2,3]。本試驗(yàn)通過一種新型錳基芬頓試劑熒光分析法對(duì)6種花類中藥進(jìn)行抗·OH的體外抗氧化研究并比較了抗氧化活性大小，可為花類中藥在抗氧化性能篩選、醫(yī)療保健和臨床開發(fā)及應(yīng)用等方面奠定一定的理論基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

M-850型熒光分光光度計(jì)（日本日立公司）；FA2004型電子天平（上海良平儀器儀表有限公司）。

2.0 ×10-4mol·L-1羅丹明B溶液，1.5×10-4mol·L-1MnSO4溶液，0.3%H2O2溶液，0.05mol·L-1Tris-HCl緩沖液。試驗(yàn)用花類中藥均為市售，所用試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水為二次去離子水。

1.2 試驗(yàn)方法

在兩支10mL比色管中分別依次加入0.8mL RB溶液，1.0mL Tris-HCl緩沖液，一支作為空白參比，另一支加入0.6mL MnSO4溶液和0.4mL H2O2溶液。定容搖勻，常溫放置10min，用1cm的熒光比色皿在582nm處分別測(cè)定空白參比的熒光強(qiáng)度F0和反應(yīng)體系的熒光強(qiáng)度F。其中，·OH清除率計(jì)算公式為[4]：

C%=（Fs－F）/（F0－F）×100%

1.3 原料處理

將干性樣品充分研磨，準(zhǔn)確稱取5.00g，置于杯中，加入沸水浸泡得到初提液，再用沸水反復(fù)沖洗殘?jiān)?，合并濾液，冷卻、過濾、離心，定容至500mL，取上清液待測(cè)。

2 結(jié)果與討論

2.1 測(cè)定原理

本試驗(yàn)是在傳統(tǒng)Fenton反應(yīng)的基礎(chǔ)上將鐵基芬頓試劑換為錳基芬頓試劑進(jìn)行類芬頓反應(yīng)。錳與鐵元素在第四周期，同屬過渡金屬，化學(xué)性質(zhì)極為相似。由此建立了一種新型錳基類Fenton試劑反應(yīng)，用于測(cè)定花類中藥的抗·OH清除率，從而評(píng)價(jià)不同花類中藥提取物的抗氧化活性。

2.2 熒光光譜

RB作為一種常用熒光染色劑，本身具有很強(qiáng)的熒光。在弱堿性介質(zhì)中，用M-850型熒光光度計(jì)對(duì)體系溶液的熒光強(qiáng)度進(jìn)行測(cè)定，得到了空白參比溶液、不含抗氧化劑溶液和含有抗氧化劑溶液的3種不同反應(yīng)體系的熒光光譜圖。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，錳基芬頓（Mn-Fenton）體系溶液的發(fā)射波長(zhǎng)為582nm，僅僅加入Fe2+-H2O2溶液時(shí)，體系的熒光強(qiáng)度幾乎無(wú)變化；當(dāng)加入Fenton試劑，體系發(fā)生熒光淬滅，熒光強(qiáng)度顯著下降；當(dāng)加入抗氧化劑，即發(fā)生抗氧化劑清除·OH反應(yīng)時(shí)，可使熒光淬滅程度減弱。

2.3 最佳試驗(yàn)條件

分別對(duì)體系中的緩沖液用量、熒光劑用量、錳試劑用量、H2O2用量和反應(yīng)時(shí)間進(jìn)行試驗(yàn)，探索出熒光光譜法的最佳試驗(yàn)條件。

2.3.1 緩沖液用量的影響 由于·OH的產(chǎn)生與pH值有關(guān)，試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)在堿性條件下錳基類Fenton體系熒光淬滅程度提高，△F值大，抗·OH的清除率表現(xiàn)出優(yōu)異的性能，但是過強(qiáng)的堿性環(huán)境容易使體系不穩(wěn)定。因此，綜合考慮，試驗(yàn)選用pH值為8.5的Tris-HCl緩沖液1.0mL進(jìn)行試驗(yàn)，此時(shí)錳基類Fenton體系穩(wěn)定、反應(yīng)快速、熒光淬滅程度高。

2.3.2 熒光劑用量的影響 在RB熒光試劑體積為0.1～1.2mL的范圍內(nèi)進(jìn)行試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)隨著熒光劑RB體積用量的不斷增加，△F值不斷增大，但用量過大體系超出可視讀數(shù)范圍，因此，綜合考慮，本試驗(yàn)選用濃度為2.0×10-4mol·L-1的RB溶液0.8mL。

2.3.3 錳試劑用量的影響 在錳基反應(yīng)試劑體積為0.1～1.0mL的范圍內(nèi)進(jìn)行試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)反應(yīng)體系的熒光強(qiáng)度隨著Mn2+濃度的增加而呈現(xiàn)出下降趨勢(shì)，△F值緩慢增大；當(dāng)Mn2+濃度達(dá)到0.6mL時(shí)，△F值基本無(wú)變化，故本試驗(yàn)選擇1.5×10-4mol·L-1的MnSO4溶液0.6mL。

2.3.4 H2O2用量的影響 體系的H2O2濃度在一定程度上決定了體系的反應(yīng)速率和抗氧化清除率，本試驗(yàn)選用0.3%的H2O2溶液0.4mL，此時(shí)，△F值較為理想。

2.3.5 反應(yīng)時(shí)間的影響 在0～20min以內(nèi)對(duì)反應(yīng)體系的熒光強(qiáng)度進(jìn)行測(cè)定，發(fā)現(xiàn)在10min內(nèi)，體系的熒光強(qiáng)度呈現(xiàn)出先急劇降低后趨于平緩的下降趨勢(shì)，10min以后△F值變化緩慢，清除率趨于穩(wěn)定，說明本法的穩(wěn)定性較好，試驗(yàn)時(shí)將反應(yīng)時(shí)間調(diào)整為10min。

2.4 樣品的抗氧化活性

為測(cè)定花類中藥樣品的清除率，按上述測(cè)定方法對(duì)6種花類中藥水提物進(jìn)行·OH清除率的測(cè)定，結(jié)果見表1。

表1 不同花類中藥對(duì)·OH清除效果的比較（n=6）Tab.1 Comparion of·OH scavenging effect of different TCM flowers

從表1中可以看出，玫瑰花對(duì)·OH的清除率相對(duì)最高，數(shù)值達(dá)到54.31%，表明其抗氧化活性最強(qiáng)；三七花的清除效果最弱，清除率僅達(dá)16.35%。綜合來(lái)看，6種花類中藥水提物清除率范圍在16.35%～54.31%，總體抗氧化活性順序?yàn)槊倒寤ǎ緱d子花＞槐花＞葛花＞桂花＞三七花。不同花類中藥的抗氧化性能或可與其各自抗氧化活性成分及其含量大小有關(guān)?？傊?，試驗(yàn)結(jié)果為日常選擇具有良好食用價(jià)值和保健功能的花類中藥提供了一定的參考價(jià)值。

3 結(jié)論

熒光光譜法具有準(zhǔn)確快速、操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，是實(shí)驗(yàn)室普遍使用的一種分析方法。本試驗(yàn)是在傳統(tǒng)芬頓試劑反應(yīng)的基礎(chǔ)上建立一種新型錳基類芬頓試劑熒光法對(duì)6種花類中藥進(jìn)行抗·OH的體外抗氧化研究，并比較了其抗氧化性能。研究結(jié)果表明，6種花類中藥的抗氧化能力大小各有差異，與其他文獻(xiàn)略有不同，這或可是由于試驗(yàn)本身的測(cè)試方法和反應(yīng)條件不同，抑或由于樣品的加工工藝的差異導(dǎo)致其在抗氧化性能與清除率數(shù)值上有所差別。但6種花類中藥的自由基清除能力各自表現(xiàn)出了較好的抗氧化性能，這與其各自本身的抗氧化活性成分、含量與抗氧化基團(tuán)密不可分[5-7]?？傊?，本試驗(yàn)研究結(jié)果為花類中藥在食品開發(fā)和醫(yī)藥保健領(lǐng)域的功能性開發(fā)提供了理論支持。當(dāng)然，對(duì)于花類中藥的抗氧化成分的提取及其含量的分析研究，依舊是本課題組今后的研究重點(diǎn)，仍然有待于進(jìn)一步深化探討。