黃桂賢，梁珊珊，彭影，沈洪波，王菲菲，徐軍發(fā)

1. 廣東醫(yī)科大學(xué)檢驗醫(yī)學(xué)研究所臨床免疫學(xué)研究室， 東莞 523808； 2. 同濟大學(xué)附屬上海市肺科醫(yī)院結(jié)核病臨床研究中心， 上海 200433； 3. 復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)系， 教育部、衛(wèi)健委、醫(yī)科院醫(yī)學(xué)分子病毒學(xué)重點實驗室， 上海 200032

結(jié)核病(Tuberculosis, TB)的病原菌結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis, Mtb)能在宿主細胞內(nèi)寄生、繁殖。Mtb侵入機體后可被巨噬細胞表面的受體識別，通過胞吞作用進入巨噬細胞[1]。毒性較強的Mtb不但能抑制吞噬體和溶酶體的融合，阻止吞噬細胞對其的殺傷，而且能夠調(diào)節(jié)巨噬細胞的分化和成熟，從而進行免疫逃逸[2]。γ干擾素活化的巨噬細胞可促進吞噬體與溶酶體融合來清除細胞，因此，細胞免疫在調(diào)控Mtb感染過程中發(fā)揮重要作用。探究Mtb與宿主細胞的關(guān)系，對于深入闡明Mtb的致病機制以及宿主的抗結(jié)核免疫具有重要意義。

microRNA(簡稱miRNA) 是一種約19～22 nt長的內(nèi)源性非編碼RNA，通過與靶基因的調(diào)控區(qū)域結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄后水平降解mRNA或抑制靶基因的翻譯，從而調(diào)控基因的表達[3]。Mtb感染能引起宿主細胞中miRNA表達量發(fā)生顯著變化。以往的研究表明，命名為miR-125b-5p的miRNA在結(jié)核病人體內(nèi)含量顯著升高[4-5]，但其具體作用機制未知。本研究通過觀察miR-125b-5p對分枝桿菌在宿主細胞及小鼠體內(nèi)生長情況的影響，探討其與結(jié)核感染的關(guān)系，以期證明miR-125b-5p在抗結(jié)核免疫過程中所發(fā)揮的作用。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和細胞 恥垢分枝桿菌(Mycobacteriumsmegmatis, MS)和牛分枝桿菌(Mycobacteriumbovis)卡介苗(Bacillus Calmette-Guérin vaccine, BCG)由本實驗室保存。人肺上皮細胞A549、人巨噬細胞THP-1及鼠巨噬細胞RAW264.7源自中國科學(xué)院生化細胞研究所細胞庫。

1.1.2 試驗動物 C57BL/6小鼠，SPF級，7～8周齡，雌性，共12只，購自上海斯萊克實驗動物有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基 7H9液體培養(yǎng)基和10%OADC增菌液購自BD公司，7H10固體培養(yǎng)基購自BD公司，1640培養(yǎng)基加10%胎牛血清(fatal bovine serum，F(xiàn)BS)購自GIBCO公司。

1.1.4 試劑 miR-125b-5p模擬物(miR-125b-5p-mi)、miR-125b-5p抑制劑(miR-125b-5p-in)及其miRNA對照(mi-con、in-con)均購自天根生化科技有限公司，Trizol購自Qiagen公司，miRcute miRNA First-Strand cDNA Synthesis試劑盒和miRcute miRNA q-PCR Detection(SYBR Green)試劑盒購自天根生化科技有限公司。表達miR-125b-5p抑制劑的慢病毒購自上海吉凱基因科技有限公司。

1.1.5 引物 miR-125b-5p熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)引物(5′-UCA CCG GGUGUAAAUCAGCUU-3′)和U6引物(5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′)購自天根生化科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 分枝桿菌的培養(yǎng)和計數(shù) 分枝桿菌培養(yǎng)采用7H9液體培養(yǎng)基和10%OADC增菌液，在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中進行。用7H10固體培養(yǎng)基和10%OADC培養(yǎng)3～4周，然后計算菌落數(shù)目。

1.2.2 細胞培養(yǎng) 所有細胞都采用1640培養(yǎng)基加10% FBS，于5% CO2和37 ℃條件下培養(yǎng)。

1.2.3 miRNA轉(zhuǎn)染 按照轉(zhuǎn)染試劑Lipo2000的說明書，將終濃度為50 nmol/L的miR-125b-5p-mi、miR-125b-5p-in及其對照mi-con、in-con與細胞孵育。在孵育后的不同時間點收集細胞，進行實驗。

1.2.4 細菌感染細胞 在被細菌感染前，用佛波酯(Phorbol 12-myristate 13-acetate, PMA)以50 ng/ml的濃度誘導(dǎo)THP-1細胞。分別用分枝桿菌以MOI=10∶1(細菌∶細胞)的比例感染誘導(dǎo)后的THP-1細胞、A549或RAW264.7細胞。感染4 h后，洗掉未被細胞吞噬的細菌。根據(jù)實驗?zāi)康脑诓煌臅r間點取樣，用于提取RNA或microRNA，或者用于菌落計數(shù)。

1.2.5 熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)檢測 用Trizol裂解細胞，抽提總RNA，用miRcute miRNA First-Strand cDNA Synthesis試劑盒進行miRNA cDNA第1鏈合成。用miRcute miRNA q-PCR Detection試劑盒對miR-125b-5p的表達量進行熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction, PCR)檢測，miR-125b-5p的熒光定量PCR引物為5′-UCA CCG GGUGUAAAUCAGCUU-3′。熒光定量PCR的反應(yīng)條件為95 ℃變性120 s；95 ℃變性15 s，60 ℃退火30 s，共40個循環(huán)。核內(nèi)小RNA U6作為內(nèi)參，U6的引物為5′-CTCGCTTCGGCA-GCACA-3′。

1.2.6 分枝桿菌感染小鼠 C57BL/6小鼠12只，飼養(yǎng)于上海市肺科醫(yī)院P2動物房。實驗組6只小鼠攻毒劑量1.3×107CFU/只，攻毒方式為尾靜脈注射；對照組6只小鼠注射等體積的磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline，PBS)。在分枝桿菌感染后第3天，開始在小鼠后肢足墊注射表達miR-125b-5p抑制劑的慢病毒進行治療，劑量為5×106TU/只。小鼠飼養(yǎng)3周后頸椎脫臼處死，在無菌的超凈臺內(nèi)將小鼠解剖，取出肺臟并稱重，在研缽中將臟器全部研磨制成勻質(zhì)的懸液，取300 μL細胞懸液抽提RNA，用熒光定量PCR檢測miR-125b-5p的表達量。肺部病理切片用蘇木素-伊紅染色( hematoxylin-eosin staining)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

實驗數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 5 軟件進行分析。兩組樣本均數(shù)檢驗采用t檢驗，多組樣本均數(shù)檢驗采用單因素方差分析。P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 分枝桿菌感染誘導(dǎo)細胞內(nèi)miR-125b-5p的上調(diào)表達

為驗證分枝桿菌的感染是否會改變宿主細胞中miR-125b-5p的表達量，首先采用生長速率較快的恥垢分枝桿菌感染人肺上皮細胞A549。在感染24 h后，熒光定量PCR檢測發(fā)現(xiàn)miR-125b-5p在感染細胞中的表達量比未感染的細胞提高了約15倍(圖1A)。隨后，用生長速率比較緩慢的牛分枝桿菌BCG感染A549細胞，檢測發(fā)現(xiàn)感染后的miR-125b-5p表達量比感染前提高了20多倍。

為了驗證分枝桿菌感染是否能夠提高miR-125b-5p在巨噬細胞中的表達量，分別采用BCG感染人源巨噬細胞系THP-1和小鼠巨噬細胞系RAW264.7。發(fā)現(xiàn)miR-125b-5p在兩種巨噬細胞中的表達量都提高了10倍以上(圖1B)。上述結(jié)果證明分枝桿菌感染能誘導(dǎo)宿主細胞中miR-125b-5p顯著上調(diào)表達。

A: The relative expressions of miR-125b-5p were tested by q-PCR method in A549 cells with MS infection for 24 hours and those without infection, respectively. B: The relative expressions of miR-125b-5p in A549, THP-1 and RAW264.7 cells were tested by q-PCR method in cell with BCG infection for 24 hours and those without infection, respectively. These experiments were repeated at least 3 times. *：P<0.05， **：P<0.01， ***：P<0.001. (n=3)

圖1 分枝桿菌感染不同類型的細胞誘導(dǎo)了細胞內(nèi)miR-125b-5p的上調(diào)表達

Fig.1 Mycobacteria infection induced miR-125b-5p up-regulation in target cells

為了驗證分枝桿菌感染是否影響miR-125b-5p在宿主體內(nèi)的表達量，采用BCG感染C57BL/6小鼠。在感染1個月后，提取小鼠臟器內(nèi)的RNA，反轉(zhuǎn)成cDNA，進行熒光定量PCR檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR-125b-5p在BCG感染小鼠的肺中表達量約為PBS對照組的15倍(圖2)。結(jié)果說明，分枝桿菌感染能夠提高miR-125b-5p在小鼠肺中的表達量, 即miR-125b-5p表達量與分枝桿菌感染密切相關(guān)。

2.2 miR-125b-5p促進分枝桿菌在細胞內(nèi)生長

為驗證miR-125b-5p的表達量改變是否影響分枝桿菌在細胞內(nèi)的生長，用BCG感染吞噬細胞，然后向細胞內(nèi)轉(zhuǎn)染miR-125b-5p的模擬物或?qū)φ铡Ｅ囵B(yǎng)3 d后，裂解細胞。裂解液涂板，培養(yǎng)3周后進行菌落計數(shù)，發(fā)現(xiàn)在模擬物轉(zhuǎn)染的A549細胞中，BCG菌落數(shù)目大約是對照組的3倍(圖3A，左圖)。與此類似，在模擬物轉(zhuǎn)染的巨噬細胞THP-1和RAW264.7中， BCG的菌落數(shù)目都比對照組提高了約2倍(圖3A，中、右圖)。結(jié)果說明，轉(zhuǎn)染miR-125b-5p模擬物后，分枝桿菌在細胞內(nèi)生長、繁殖的速率增加，菌落數(shù)目增多。

用BCG感染吞噬細胞后，再轉(zhuǎn)染miR-125b-5p抑制劑來減低細胞內(nèi)miR-125b-5p的表達量。菌落計數(shù)的結(jié)果表明，在被抑制劑轉(zhuǎn)染的A549細胞中，BCG菌落數(shù)目約是對照組的50%(圖3B，左圖)。同樣，在被抑制劑轉(zhuǎn)染的巨噬細胞THP-1和RAW264.7中，BCG的菌落數(shù)目都比對照組顯著降低(圖3B，中、右圖)。結(jié)果說明，在轉(zhuǎn)染miR-125b-5p抑制劑后，分枝桿菌在細胞內(nèi)的生長數(shù)目減少。表明miR-125b-5p的表達能夠促進分枝桿菌在細胞內(nèi)的生長。

***：P<0.001. (n=6)

圖2 miR-125b-5p在BCG感染的C57BL/6小鼠肺部的表達水平顯著高于對照組

Fig.2 The expression of miRNA-125b-5p in BCG infected mice lung is significantly higher than that in uninfected mice lung

A: The BCG CFUs were counted in lysate of A549, THP-1 and RAW264.7 cells transfected by the mimic of miR-125b-5p (125b-5p-mi) or control microRNAs (mi-con), respectively. B: The BCG CFUs were counted in lysate of A549, THP-1 and RAW264.7 cells transfected by the inhibitor of miR-125b-5p (125b-5p-in) or control microRNAs (in-con), respectively. These experiments were repeated at least 3 times. **：P<0.01，***：P<0.001. (n=3)

圖3 miR-125b-5p及其抑制劑對細胞內(nèi)感染的BCG生長的影響

Fig.3 miR-125b-5p regulated the growth of mycobacteria in phagocytes

2.3 miR-125b-5p抑制劑減低分枝桿菌感染小鼠體內(nèi)的細菌載量

為了驗證miR-125b-5p是否能夠調(diào)節(jié)分枝桿菌在宿主體內(nèi)的生長，在BCG感染小鼠后的第4天，注射表達miR-125b-5p抑制劑的慢病毒到小鼠體內(nèi)。感染1個月后，解剖小鼠，取脾臟，進行菌落計數(shù)。結(jié)果表明，在注射抑制劑的小鼠脾臟中BCG菌落數(shù)目顯著低于對照組(P<0.05，圖4A)。同時，取小鼠的肺部切片進行病理分析，發(fā)現(xiàn)對照組小鼠肺部出現(xiàn)了顯著的結(jié)核病理損傷，而治療組小鼠肺部的結(jié)核病理損傷較少。這說明注射表達miR-125b-5p抑制劑的慢病毒在降低小鼠體內(nèi)miR-125b-5p表達量后能顯著抑制分枝桿菌在小鼠體內(nèi)的生長，減輕肺部病理損傷。

A: The BCG CFUs were counted in spleen lysate of mice infected by BCG and administrated by miR-125b-5p inhibitor or control microRNAs, respectively. B: Histologic evaluation of lung tissue sections of BCG infected mice with administration of miR-125b-5p inhibitor or control microRNAs, respectively. *：P<0.05. (n=6)

圖4 miR-125b-5p的抑制劑治療BCG感染的C57BL/6小鼠能夠顯著降低分枝桿菌在脾臟的細菌載量，減輕肺部病理損傷

Fig.4 Administration of miR-125b-5p inhibitor in BCG infected mice significantly reduced the mycobacteria burden in mice spleen and pathological damage in mice lung comparing to the control mice

3 討論

microRNA與Mtb感染的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。microRNA不僅可以作為結(jié)核病的生物標(biāo)志物，而且還與細胞凋亡、自噬以及抗結(jié)核免疫調(diào)控等密切相關(guān)[6]。本研究深入探討了miR-125b-5p在抗結(jié)核免疫過程中的作用。

Mtb是一種胞內(nèi)寄生菌，主要寄生于宿主的巨噬細胞和肺上皮細胞[7-9]。因此，選擇人肺上皮細胞A549和人巨噬細胞THP-1[10]，及小鼠的巨噬細胞RAW264.7進行研究。無論用快速生長的恥垢分枝桿菌還是緩慢生長的BCG進行感染，細胞內(nèi)miR-125b-5p的表達量均顯著上調(diào)。感染BCG后，小鼠肺部miR-125b-5p的表達量也顯著上調(diào)。結(jié)果證明無論在體內(nèi)還是體外，分枝桿菌的感染都能誘導(dǎo)miR-125b-5p上調(diào)表達，提示miR-125b-5p的表達與分枝桿菌在宿主內(nèi)生長存在密切關(guān)系。

為了進一步證實miR-125b-5p對分枝桿菌在宿主細胞內(nèi)生長的作用，分別轉(zhuǎn)染miR-125b-5p模擬物和miR-125b-5p抑制劑，結(jié)果發(fā)現(xiàn)BCG在細胞中的生長發(fā)生顯著改變。且miR-125b-5p抑制劑能夠顯著降低BCG感染小鼠體內(nèi)的細菌載量。這表明miR-125b-5p抑制劑具有治療BCG感染的潛在應(yīng)用價值，也證明了miRNA具有用于結(jié)核病治療的潛力。

miR-125b-5p與其他miRNA一樣，具有多個靶點，受多種調(diào)控，可能通過多個機制調(diào)控分枝桿菌的生長[11-12]，例如，miR-125b-5p是否能夠調(diào)控巨噬細胞中吞噬體與溶酶體的融合[13]，是否能夠調(diào)控一氧化氮或維生素D通路相關(guān)的殺菌通路[14]，是否能影響細胞的自噬或凋亡過程等[15]。所以，miR-125b-5p影響分枝桿菌在宿主細胞和小鼠體內(nèi)生長的作用機制還有待進一步探究，可利用miR-125b-5p敲除的轉(zhuǎn)基因小鼠在系統(tǒng)水平上探究miR-125b-5p對分枝桿菌在宿主體內(nèi)生長的影響[16]。