姚夢依，錢嘉寧，狄玉昌，陳潤，白嘉誠，張雪蓮

復(fù)旦大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院遺傳工程國家重點實驗室， 上海 200433

結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis，Mtb)目前仍是全世界十大致死的致病感染源之一，世界衛(wèi)生組織(World Health Organization，WHO) 2018年數(shù)據(jù)統(tǒng)計顯示，僅2017年度全球共發(fā)生約 1 000 萬新發(fā)結(jié)核病病例及160萬死亡病例[1]，有55.8萬新發(fā)病例對抗結(jié)核一線藥物——利福平耐受，其中有82%的患者感染的是耐多藥結(jié)核菌。耐多藥、廣泛耐藥菌的產(chǎn)生使得結(jié)核病治療面臨巨大挑戰(zhàn)[2-3]，目前臨床上廣泛使用的仍為20世紀(jì)研發(fā)的藥物。近幾十年來抗結(jié)核上市新藥僅有貝達喹啉和德拉馬尼，但耐藥結(jié)核菌的不斷產(chǎn)生，使得抗結(jié)核新藥的研發(fā)依然迫在眉睫[4-5]。

ATB-152E和ATB-152J為本實驗室前期獲得的具有良好抗結(jié)核活性的2種結(jié)構(gòu)類似的小分子化合物，最低抑菌濃度(minimal inhibitory concentration，MIC)均為0.09 μg/mL，專利ZL201210088290.0。由于結(jié)核分枝桿菌耐藥菌株中存在的突變基因往往與該藥物的作用靶標(biāo)密切相關(guān)[6-7]，為探索ATB-152E和ATB-152J的抗結(jié)核靶標(biāo)及可能的耐藥機制，本實驗篩選了這2種小分子化合物的耐藥菌株，并對其進行表型分析，期望為后續(xù)全基因組測序發(fā)現(xiàn)耐藥菌基因組突變及探明ATB-152E和ATB-152J可能的抑菌作用機制提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 結(jié)核分枝桿菌H37Ra(MycobacteriumtuberculosisH37Ra，簡寫為WT Ra)為本實驗室保存菌種，卷曲霉素購自美國Sigma公司。

1.1.2 培養(yǎng)基 油酸、白蛋白、右旋葡萄糖、過氧化氫酶(oleic acid，albumin，dextrose，catalase，OADC)培養(yǎng)基100 mL：稱取5 g 牛血清白蛋白第5組分(上海艾研生物科技有限公司)、0.03 g 過氧化氫酶(美國Sigma公司)、2 g 右旋葡萄糖、0.85 g NaCl、12 μL Oleic Acid(上海生工生物工程有限公司)，加水定容至100 mL，用0.22 μm濾膜(德國默克公司)過濾除菌； Sauton培養(yǎng)基100 mL：稱取0.4 g天門冬素、0.2 g檸檬酸、0.05 g磷酸氫二鉀、0.05 g MgSO4·7H2O、0.05 g枸櫞酸鐵銨、6 mL甘油，氨水調(diào)pH至7.2～7.4，加水定容至100 mL；米氏7H9、7H10 肉湯為美國 BD公司產(chǎn)品。

1.1.3 儀器 宏觀變倍體視顯微鏡(型號：Stereo Discovery. V20)購自德國卡爾蔡司公司。

1.1.4 抗結(jié)核活性小分子化合物 ATB-152E和ATB-152J為上海皓元化學(xué)合成有限公司為本實驗室合成定制[8]。

1.2 方法

1.2.1 耐藥菌的篩選 準(zhǔn)備含有1x、2x、4x、8x MIC ATB152-E和ATB152-J的7H10-OADC平板。將對數(shù)期的WT Ra按1∶50接種于100 mL 7H9-OADC培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)2周至A600=0.8，按每管1 mL(約107CFU/mL)菌液分裝，13 000 r/min離心1 min，棄去900 μL上清液，將菌體重懸在100 μL的培養(yǎng)基中備用。將上述離心、重懸、含107CFU/mL的菌液，分別涂布于含有不同濃度的ATB152-E或者ATB152-J的7H10-OADC平板(1x MIC ATB152-J、2x MIC ATB152-E、2x MIC ATB152-J、4x MIC ATB152-E、4x MIC ATB152-J)，每個梯度設(shè)多個重復(fù)板。將這些平板于37 ℃倒置培養(yǎng)3～4周，統(tǒng)計每個濃度梯度生長的菌落數(shù)，挑取單克隆，在液體培養(yǎng)基7H9-OADC中37 ℃擴大培養(yǎng)，培養(yǎng)基中加有單克隆生長平板對應(yīng)的藥物濃度。待菌長到對數(shù)期，將菌液繼續(xù)在含有2倍化合物濃度的固體平板上劃線培養(yǎng)。如此不斷提高化合物篩選濃度以獲得遺傳穩(wěn)定的耐藥菌株。

1.2.2 耐藥菌MIC的測定 Mtb MIC測定方法采用微孔法[9]，將培養(yǎng)至對數(shù)期的WT Ra和耐藥菌菌液分別稀釋到A600=0.1，然后用7H9-OADC培養(yǎng)基稀釋100倍。取2塊96孔圓底微孔板，在第1塊板中，B2、D2孔中加入198 μL 稀釋后的耐藥菌菌液，B、C、D、E行的其余孔內(nèi)加入100 μL耐藥菌菌液，在F2和G2孔內(nèi)加入稀釋后的WT Ra菌液，F(xiàn)、G行的其余孔加入100 μL WT Ra菌液；在B2和D2孔內(nèi)加入2 μL濃度為10 mg/mL的ATB152-E(或ATB152-J)，F(xiàn)2和G2孔內(nèi)加入2 μL濃度為10 mg/mL的卷曲霉素作為陽性對照；在B2孔內(nèi)吸取100 μL混勻的菌液加入B3孔內(nèi)，吹打均勻后再吸取100 μL加至B4孔。以此類推，梯度稀釋，直到下一行C10孔，直接吸取100 μL棄去，C11孔為不加化合物的對照孔；D、E行是技術(shù)重復(fù)孔，方法相同。F2～F10同理梯度稀釋，G行同理為技術(shù)重復(fù)孔。在第2塊板中，第2列B～E內(nèi)，加入稀釋后的WT Ra菌液198 μL和2 μL濃度為144 μg/mL的化合物(終濃度為16x MIC)，B2、C2中加ATB152-E，D2、E2中加ATB152-J；接下來每行進行同上的梯度稀釋；最后每塊板的四周每孔需加上200 μL無菌H2O，以防蒸發(fā)。封口膜封口，37 ℃培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)，3周后觀察實驗結(jié)果。

1.2.3 耐藥菌菌落形態(tài)觀察 將培養(yǎng)至對數(shù)期的WT Ra和耐藥菌菌液分別稀釋到A600=0.3，梯度稀釋到10-4，取50 μL涂布于相應(yīng)MIC的平板，37 ℃ 倒置培養(yǎng)約6周，置于宏觀變倍體視顯微鏡下觀察菌落形態(tài)并拍照記錄，對菌落形態(tài)表型進行分析。

1.2.4 耐藥菌的成膜觀察 收集5 mL培養(yǎng)至對數(shù)期的WT Ra和耐藥菌菌液，用Sauton培養(yǎng)基洗1次； 用Sauton培養(yǎng)基將菌液調(diào)整到A600=0.3，再稀釋30倍，于24孔板中加入菌液1.3 mL/孔，每種菌各3個復(fù)孔，四周加1 mL無菌H2O以防蒸發(fā)；封口膜封口，鋁箔包裹，于37 ℃培養(yǎng)4～6周，觀察結(jié)果并對形成的生物膜表型進行分析。

2 結(jié)果

2.1 耐藥菌的篩選

經(jīng)過含藥平板涂板以及平板劃線逐步提高化合物濃度的層層篩選，得到了ATB-152E的耐藥株(表1)以及ATB-152J的耐藥株(表2)。第1輪篩選從1x MIC ATB-152E平板篩選到1株耐藥菌，其余重復(fù)平板上的單克隆沒能在含有化合物的培養(yǎng)基中生長，即未能形成穩(wěn)定耐藥；從6個不同的2x MIC ATB-152E平板篩選到6株耐藥菌；后期通過不斷提高化合物篩選濃度的方法，最終篩選到ATB-152E耐藥菌17株(表1)。ATB-152J耐藥菌也經(jīng)歷類似的篩選過程，在4x MIC和8x MIC分別篩選到1個生長菌落，通過連續(xù)不斷提高化合物濃度，最終篩選到ATB-152J耐藥菌15株(表2)。這兩種化合物的耐藥頻率均為10-7，即涂107CFU于平板上最多只能長出1個耐藥菌株。

2.2 耐藥菌MIC測定

為確定篩選得到的耐藥菌遺傳穩(wěn)定性及具體耐藥程度，對篩選的菌株進行兩種化合物的MIC測定。采用微孔法對在含4x MIC以上的培養(yǎng)板上依然生長的耐藥菌進行MIC測定，結(jié)果見表3所示。測定結(jié)果顯示這些耐藥菌分別為化合物ATB-152E和ATB-152J的耐藥菌株，且部分菌屬于高度耐藥菌，它們是：4 MICE_2、8 MICE_10、4 MICJ_1、8 MICJ_1、8 MICJ_2、8 MICJ_4、8 MICJ_5和8 MICJ_6。

2.3 耐藥菌與野生株菌落形態(tài)的差異

為分析篩選的耐藥菌與野生株的形態(tài)差異， 用宏觀變倍體視顯微鏡觀察7H10-OADC固體平板上培養(yǎng) 6 周后的單菌落形態(tài)。結(jié)果顯示，生長6周后，耐藥菌的形態(tài)與野生株存在顯著差異。隨著耐藥程度的增加，ATB-152E耐藥菌形態(tài)逐漸變得更為隆起，褶皺變多；最高倍的耐藥菌褶皺密集，幾乎凝結(jié)成團塊狀。此外ATB-152E耐藥菌較野生株更為干燥(圖1)。ATB-152J耐藥菌隨著耐藥程度的增加，形態(tài)更為扁平，褶皺減少，表面呈現(xiàn)出顆粒狀隆起(圖1)。

表1 ATB-152E H37Ra耐藥菌

Tab.1 ATB-152E resistant H37Ra strains

ATB-152Er H37Ra strainsSource1MICE_1colony from 1x MIC plate2MICE_1colony from 2x MIC plate2MICE_2colony from 2x MIC plate2MICE_3colony from 2x MIC plate2MICE_5colony from 2x MIC plate2MICE_6colony from 2x MIC plate2MICE_7colony from 2x MIC plate4MICE_3.1restreaked from 2MICE_34MICE_5.1resreaked from 2MICE_54MICE_5.2resreaked from 2MICE_54MICE_2resreaked from 2MICE_28MICE_10resreaked from 4MICE_24MICE_1'colony from 4x MIC plate4MICE_2'colony from 4x MIC plate8MICE_2.2'resreaked from 4MICE_2'8MICE_2.3'resreaked from 4MICE_2'8MICE_2.4'resreaked from 4MICE_2'

表2 ATB-152J H37Ra耐藥菌

Tab.2 ATB-152J resistant H37Ra strains

ATB-152Jr H37Ra strainsSource4MICJ_1colony from 4x MIC plate4MICJ_3colony from 4x MIC plate4MICJ_1'colony from 4x MIC plate4MICJ_2'colony from 4x MIC plate4MICJ_3'colony from 4x MIC plate4MICJ_4'colony from 4x MIC plate8MICJ_1.1'resreaked from 4MICJ_1'8MICJ_1.2'resreaked from 4MICJ_1'8MICJ_1.3'resreaked from 4MICJ_1'8MICJ_1.4'resreaked from 4MICJ_1'8MICJ_1colony from 8x MIC plate8MICJ_2colony from 4x MIC plate8MICJ_4colony from 4x MIC plate8MICJ_5colony from 4x MIC plate8MICJ_6colony from 4x MIC plate

表3 耐藥菌MIC測定

Tab.3 MICs against monodrug-resistant H37Ra strains

H37Ra strainMIC(μg/mL)CompoundWT0.09ATB-152E or ATB-152J 4MICE_3.112.5ATB-152E4MICE_5.112.5ATB-152E4MICE_5.212.5ATB-152E4MICE_250ATB-152E8MICE_1025ATB-152E4MICJ_16.25ATB-152J4MICJ_33ATB-152J8MICJ_125ATB-152J8MICJ_225ATB-152J8MICJ_425ATB-152J8MICJ_525ATB-152J8MICJ_625ATB-152J

2.4 耐藥菌與野生株成膜能力的差異

研究中還發(fā)現(xiàn)耐藥菌菌膜形成速度以及形成時間與野生株也存在明顯差異，因此我們對耐藥菌株的生長表型進行了分析。H37Ra野生株(WT)、 ATB-152E高度耐藥菌株4MICE_2、8MICE_10、 ATB-152J高度耐藥菌株4MICJ_1、8MICJ_1在液體Sauton培養(yǎng)基中培養(yǎng)4～6周后，液體表面會逐漸形成生物膜。將生物膜置于宏觀變倍體視顯微鏡下觀察(圖2)，結(jié)果顯示，4周時菌株4MICE_2沒有形成生物膜，4MICJ_1生物膜并沒有完全形成，而野生株生物膜已基本形成，菌株8MICE_10和8MICJ_1生物膜形成能力都強于野生株，且8MICJ_1成膜能力更強；6周時4MICE_2生物膜仍未形成，4MICJ_1生物膜已形成，但膜的完整性明顯低于野生株，8MICE_10和8MICJ_1生物膜形成能力都強于野生株，均有褶皺形成，且8MICJ_1成膜能力更強，褶皺更多。

圖1 H37Ra野生株、ATB-152E耐藥株和ATB-152J耐藥株的菌落形態(tài)

Fig.1 Colony morphology of H37Ra (WT), ATB-152E resistant H37Ra strain and ATB-152J resistant H37Ra strain

圖2 H37Ra野生株、ATB-152E耐藥株和ATB-152J耐藥株的生物膜形成

Fig.2 Biofilm formation of H37Ra (WT), ATB-152E resistant H37Ra strain and ATB-152J resistant H37Ra strain

3 討論

細菌產(chǎn)生耐藥有各種各樣的機制，研究表明目前主要包括通過降低細胞膜的通透性以減少藥物與靶標(biāo)的結(jié)合、靶標(biāo)發(fā)生基因突變、細菌對靶標(biāo)進行翻譯后修飾、對抗菌藥物進行修飾等[10]。在Mtb中，細菌耐藥與靶標(biāo)基因突變關(guān)系密切，如果基因組不發(fā)生變化，則為表型耐藥，細菌轉(zhuǎn)接后無法在含藥培養(yǎng)基中生長[11]，具有遺傳穩(wěn)定性的耐藥則大多由基因組上靶蛋白的突變導(dǎo)致，因而篩選細菌的耐藥菌，探究耐藥菌中的突變位點，是尋找抗結(jié)核藥物中作用靶標(biāo)最保守、最可靠的方式[6-7]。

本研究篩選了ATB-152E和ATB-152J兩種化合物的耐藥菌，在篩選過程中發(fā)現(xiàn)，兩種化合物的耐藥菌都比較難以篩選，只有當(dāng)平板上涂布菌量達到107以上才能長出1株耐藥菌株，且耐藥頻率較低。研究中發(fā)現(xiàn)，Mtb ATB-152E和ATB-152J耐藥菌菌落形態(tài)和生物膜生長速度和成熟均與野生株存在顯著的差異。在篩選過程中耐藥菌的菌落形態(tài)以及液體培養(yǎng)菌膜的產(chǎn)生都發(fā)生很大變化，菌落形態(tài)明顯比野生株更為隆起。液態(tài)培養(yǎng)條件下，生長較長時間的Mtb 會形成完整的菌膜，菌膜的生長速度和成熟與細菌代謝和毒力密切相關(guān)[12]。本研究中耐藥菌菌膜形成速度也與野生株存在明顯差異，在同一接種量、相同生長時間條件下，有的耐藥菌較野生株菌膜更為厚實，有的則未能形成完整菌膜，因此對耐藥菌株的生長表型進行了分析。

盡管ATB-152E和ATB-152J的結(jié)構(gòu)較為類似，但耐藥菌株的表型卻并不完全一致，提示兩種化合物的突變位點可能并不完全相同或化合物作用存在多個作用靶點。Mtb的細胞壁脂質(zhì)含量高達約40%的細胞干重[13]，且細菌的菌落形態(tài)、生物膜的形成均與細菌細胞壁的脂質(zhì)成分相關(guān)[14]，因而這些表型的改變證明活性化合物耐藥菌的基因突變可能導(dǎo)致細菌脂肪酸合成異常。此外ATB-152E或ATB-152J作用Mtb的 RNA-seq數(shù)據(jù)分析(未發(fā)表數(shù)據(jù))也初步發(fā)現(xiàn)脂肪酸合成通路相關(guān)基因有顯著變化，提示兩種化合物的作用機制可能與脂肪酸合成密切相關(guān)。脂肪酸合成是結(jié)核分枝菌酸(mycolic acid，MA)合成的重要通路，而MA是Mtb細胞壁的重要組分，因此脂肪酸合成通路是抗結(jié)核新藥開發(fā)非常有潛力的作用靶點方向[15-16]。異煙肼的作用靶點InhA就是靶向脂肪酸合成通路FAS-Ⅱ系統(tǒng)[17]。臨床前階段的抗結(jié)核藥物BM212也是靶向該通路上的MmpL3，通過阻斷海藻糖單霉菌酸酯(trehalose monomycolates，TMM)的轉(zhuǎn)運，影響分枝酸的合成[18]?？菇Y(jié)核新藥德拉馬尼也被認(rèn)為影響了MA的合成，可見脂肪酸合成對于Mtb非常重要，通路中的關(guān)鍵蛋白都有可能會成為藥物作用的靶點[13]。

隨著微生物全基因組測序技術(shù)在Mtb耐藥機制研究中趨于成熟[19]，基于本研究ATB-152E和ATB-152J耐藥菌的獲得，后續(xù)將進一步對這些耐藥菌進行全基因組測序，從比較基因組角度來尋找引起菌株耐受兩種化合物以及引起耐藥菌株表型發(fā)生顯著變化的分子機制。一方面從突變基因的生化角度，體外表達純化相關(guān)基因編碼蛋白，利用藥物親和反應(yīng)靶點穩(wěn)定性(drug affinity responsive target stability，DARTS)技術(shù)、等溫滴定量熱法(isothermal titration calorimetry，ITC) 測定目標(biāo)蛋白與活性化合物的結(jié)合能力，同時檢測化合物對這些基因的體外生化功能的影響；另一方面從Mtb內(nèi)作用的靶標(biāo)角度，通過菌體內(nèi)過表達篩選的突變基因，評價過表達菌株對ATB-152E和ATB-152J化合物的敏感性，確定基因與耐藥的關(guān)系，進而最終闡明化合物的耐藥和作用機制。