楊曉宇 孫 靜 呂欣孺 李 祥 陳麗霞 付 恬 馬 天馬沛然 李 儀 王玉龍 侯志軍 曾祥偉 王亞君 楊思遠(yuǎn)張國(guó)鋼* 孫 穎* 柴洪亮*

(1.東北林業(yè)大學(xué)野生動(dòng)物與自然保護(hù)地學(xué)院，哈爾濱，150040；2.全國(guó)鳥類環(huán)志中心，北京，100091；3.黑龍江民族職業(yè)學(xué)院，哈爾濱，150066)

禽流感病毒(avian influenza virus，AIV)是屬于正黏病毒科(Orthomyxoviridae)甲型流感病毒屬(InfluenzavirusA)的甲型單鏈負(fù)向RNA病毒[1]。根據(jù)血凝素(HA)和神經(jīng)氨酸酶(NA)糖蛋白的抗原性，將甲型流感病毒分為18種HA和11種NA亞型[2]。野生水禽，尤其是雁鴨類，被認(rèn)為是AIV的天然宿主[3]。感染低致病性禽流感病毒的鳥類，包括家禽和野生鳥類，通常不會(huì)表現(xiàn)出臨床癥狀，但是，它們?yōu)榈椭虏⌒郧萘鞲胁《鹃g的基因重組提供了環(huán)境，而低致病性禽流感病毒可以作為高致病性禽流感病毒的前體[4]。禽流感病毒對(duì)家禽受體的適應(yīng)可以增強(qiáng)其在人與禽之間傳播的潛力，進(jìn)而使它獲得跨物種傳播的能力[5]。近年來，禽類中陸續(xù)出現(xiàn)了不同的流感病毒亞型(例如H5，H6，H7和H10)，它們?cè)竭^了物種屏障并引起了人類感染的頻繁暴發(fā)。禽流感的持續(xù)暴發(fā)已經(jīng)引起人們的警覺，野生鳥類作為禽流感病毒主要儲(chǔ)存庫的作用越來越受到重視，它們保持了禽流感病毒的持久性和變異性，促進(jìn)了病毒的傳播和疾病的發(fā)生。

H6亞型禽流感病毒首次于1965年在馬薩諸塞州的火雞(Meleagrisgallopavo)體內(nèi)分離到[6]，目前已經(jīng)在全球范圍內(nèi)流行，且宿主范圍也較為廣泛，包括各種水禽、家禽以及哺乳動(dòng)物等。日前，在荷蘭3個(gè)農(nóng)場(chǎng)的雞群中暴發(fā)H6N1亞型禽流感病毒已造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[7]。在中國(guó)，已有血清學(xué)證據(jù)表明人類以及其他哺乳動(dòng)物都曾感染H6亞型AIVs[8]，在臺(tái)灣也已有人感染H6N1亞型流感病毒并引起明顯流感癥狀的確診病例[9]，之前的研究還表明H6N1病毒有7個(gè)基因片段與1997年香港暴發(fā)的H5N1病毒高度同源[10]。雖然目前還未發(fā)現(xiàn)H6亞型禽流感病毒引起類似于H5、H7亞型病毒的高致病性和大面積暴發(fā)，但是它們的普遍存在和致病力增強(qiáng)的潛在可能一直令人擔(dān)憂，特別是能否獲得對(duì)哺乳動(dòng)物的跨種感染能力與傳播能力。

本試驗(yàn)對(duì)從江蘇省海豐農(nóng)場(chǎng)豆雁(Anserfabalis)糞便中分離的1株H6N1亞型毒株J746進(jìn)行全基因克隆及遺傳進(jìn)化分析。

1 材料和方法

1.1 樣品采集

本課題組于2017年1月19日在江蘇省海豐農(nóng)場(chǎng)小麥地采集新鮮豆雁糞便樣品159份。用棉簽蘸取少量糞便放入5 mL EP管中，內(nèi)含2 mL病毒保存液(PBS緩沖液、青霉素、鏈霉素和10%甘油)，-80 ℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 病毒分離鑒定

將上述159份糞便樣品震蕩混勻后靜置10 min，取0.1—0.2 mL上清液由尿囊腔途徑接種2枚9日齡SPF 雞胚，37 ℃全自動(dòng)孵化器內(nèi)孵育72 h后在無菌環(huán)境中收取尿囊液6—8 mL，分裝于4個(gè)2 mL EP管中，取其中一管進(jìn)行血凝(HA)實(shí)驗(yàn)。

HA呈陽性的尿囊液樣品，按照QIAGEN公司的RNA提取試劑盒說明書要求對(duì)其進(jìn)行總RNA的提取，隨后用Unit12引物(5′-AGC AAA AGC AGG-3′)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，作為PCR模板。

利用特異性HA-640引物進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)和HA亞型鑒定[11]，PCR產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳后，挑選出呈預(yù)期長(zhǎng)度條帶的核酸樣品，使用特異性引物進(jìn)行RT-PCR實(shí)驗(yàn)擴(kuò)增全基因組片段。

1.3 測(cè)序和序列分析

基因組擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物送往吉林庫美生物科技有限公司測(cè)序，返回的測(cè)序結(jié)果用DNAStar 軟件包中的Seqman 程序進(jìn)行拼接，利用MegAlign 程序進(jìn)行核苷酸同源性比較。使用Mega 7.0 進(jìn)行序列比對(duì)以及氨基酸序列分析，利用IQTREE軟件分別對(duì)8個(gè)基因片段最優(yōu)進(jìn)化模型的篩選，隨后構(gòu)建最大似然法遺傳進(jìn)化樹。

2 結(jié)果

2.1 全基因RT-PCR擴(kuò)增及測(cè)序結(jié)果

從雞胚尿囊液中提取病毒核酸，并進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，電泳結(jié)果顯示，各條帶與預(yù)期片段大小相符。對(duì)返回測(cè)序進(jìn)行拼接，J746分離株P(guān)B2、PB1、PA、HA、NP、NA、M、NS基因蛋白質(zhì)編碼區(qū)(CDS)長(zhǎng)度為2 280 bp、2 274 bp、2 151 bp、1 701 bp、1 497 bp、1 410 bp、982 bp、844 bp，GISAID序列號(hào)分別為EPI1619579、EPI1619611-EPI1619617。

2.2 同源性比較結(jié)果

如表1所示，J746的HA基因與韓國(guó)野生水禽病毒A/wild waterfowl/Korea/F14-5/2016(H6N1)同源性最高，同源性為99.4%，NA同樣與在韓國(guó)野生水禽中分離出的A/white-fronted goose/Korea/H909-1/2017(H6N1)，A/white-fronted goose/Korea/H952/2017(H6N1)和A/wild waterfowl/Korea/F14-5/2016(H6N1)同源性最高，同源性均為99.4%。6個(gè)內(nèi)部基因中，PB2、PB1和NP均與蒙古家鴨的低致病性毒株同源性最高，分別為99.7%，99.9%和100%；與PA同源性最高的毒株中，除了分離于蒙古家鴨的低致病性H10N2毒株，還有分離于日本家鴨的低致病性H3N8毒株，同源性均為99.4%，與M同源性最高的毒株中，除了分離于蒙古家鴨的低致病性H4N6毒株，還有分離于荷蘭野鴨的低致病性H4N6毒株，同源性均為99.7%，與NS同源性最高的為分離于中國(guó)武漢的家禽源A/chicken/Wuhan/WHJF/2014(H5N2)毒株，同源性為100%。

2.3 遺傳進(jìn)化分析結(jié)果

2.3.1 外部基因

如圖1和圖2所示，J746的HA基因與分離于韓國(guó)、日本野生水禽的低致病性H6N1、H6N8亞型毒株和孟加拉家鴨的低致病性H6N2亞型毒株聚集在一個(gè)分支上，其中與A/wild waterfowl/Korea/F14-5/2016(H6N1)親緣關(guān)系最近。NA基因與分離于韓國(guó)野生水禽的低致病性H6N1、H7N1亞型聚集在一個(gè)分支上，同樣與A/wild waterfowl/Korea/F14-5/2016(H6N1)的親緣關(guān)系非常近。因此J746的HA和NA基因可能共同起源于韓國(guó)病毒A/wild waterfowl/Korea/F14-5/2016(H6N1)。

2.3.2 內(nèi)部基因

如圖3—圖8所示，PB2基因與蒙古家鴨低致病性H10N3毒株、中國(guó)重慶家鴨H5N3毒株以及哈薩克斯坦野鴨H1N1毒株聚集在一個(gè)分支上。PB1基因和NP基因都與循環(huán)于東南亞的低致病性毒株處于同一分支，其中PB1基因與蒙古家鴨的H1N1 毒株A/duck/Mongolia/520/2015(H1N1)親緣關(guān)系最近，NP基因與蒙古家鴨的A/duck/Mongolia/208/2015(H3N8)等H3N8毒株親緣關(guān)系最近。PA基因和M基因都處于歐亞分支上，值得注意的是PA基因，雖然處于歐亞大分支上，但形成了獨(dú)立的小分支，從進(jìn)化關(guān)系上看，雖然PA基因與日本家鴨的A/duck/Fukui/181019/2016(H3N8)和A/duck/Yamaguchi/351201/2016(H4N6)兩株毒親緣關(guān)系最近，但可能經(jīng)過了相對(duì)獨(dú)立的進(jìn)化過程。NS基因與分離于中國(guó)中南部和日本的多種亞型低致病性毒株聚集在一起，其中與中國(guó)安徽野生水禽的H6N2和H1N1兩種亞型的分離株親緣關(guān)系最近。

2.4 氨基酸位點(diǎn)分析結(jié)果

如表2所示，HA基因開放閱讀框架有1 701個(gè)堿基，編碼566個(gè)氨基酸，其裂解位點(diǎn)為PQIETR↓G，無連續(xù)堿性氨基酸的插入，表明該毒株符合低致病性禽流感病毒的典型特征[12]。第239(H3-226)位和241(H3-228)位氨基酸分別為Q和G，說明J746優(yōu)先結(jié)合唾液酸α2-3 受體[13]。NA蛋白無頸部氨基酸缺失，但其出現(xiàn)H274Y突變，表明J746對(duì)神經(jīng)氨酸酶類抗病毒藥物具有一定的耐藥性[14]。PB2蛋白中出現(xiàn)與增強(qiáng)對(duì)小鼠致病性有關(guān)的L89V突變[15]，NS1蛋白中出現(xiàn)與增強(qiáng)對(duì)小鼠致病性、提高復(fù)制能力和改變宿主嗜性有關(guān)的P42S、L103F、I106M、N205S突變[16-17]。

表1 J746各基因片段的核苷酸同源性比較

Tab.1 Comparison of nucleotide homology of each gene fragment of J746

3 討論

野生水禽是A型流感病毒重要的自然宿主，其每年規(guī)律性的遷徙活動(dòng)對(duì)流感病毒的長(zhǎng)期存在、持續(xù)變異和廣泛傳播起著十分重要的作用。在候鳥的8條主要遷徙路線中有3條經(jīng)過我國(guó)，幾乎覆蓋了我國(guó)的全部領(lǐng)域，各條路線之間還有相當(dāng)復(fù)雜的遷徙交匯區(qū)，更易造成不同鳥類種群之間的跨種傳播和接力式、遠(yuǎn)距離跨洲傳播。

本研究對(duì)2017年在江蘇海豐農(nóng)場(chǎng)采集的野生豆雁糞便中分離到的H6N1病毒株J746進(jìn)行了全基因組測(cè)序，并對(duì)其進(jìn)行了序列分析和遺傳進(jìn)化分析。結(jié)合同源性和遺傳進(jìn)化分析結(jié)果，J746的HA和NA基因均可能來源于韓國(guó)野鳥源H6N1病毒株A/wild waterfowl/Korea/F14-5/2016(H6N1)。內(nèi)部基因來源較復(fù)雜，PB2基因可能來源于亞洲中東部地區(qū)低致病性H1、H5或H10毒株；PB1和NP基因可能分別源于蒙古家鴨低致病性H1N1、H3N8毒株；PA和M基因均源于歐亞低致病性毒株但PA基因進(jìn)化過程相對(duì)獨(dú)立；NS基因與中國(guó)安徽野生水禽的H6N2和H1N1兩種亞型的分離株親緣關(guān)系最近。雖然J746各基因片段的進(jìn)化路徑不盡相同，但它們的來源在總體上呈現(xiàn)一定的區(qū)域性，因此推測(cè)J746是由循環(huán)在亞洲及歐洲的低致病性毒株在候鳥沿東亞—澳大利亞遷徙路線進(jìn)行遷徙或停歇時(shí)發(fā)生重組的。

此外，事實(shí)已經(jīng)證明，禽流感的每次暴發(fā)都會(huì)導(dǎo)致家禽養(yǎng)殖業(yè)的巨大經(jīng)濟(jì)損失，J746雖然分離于野生水禽，但其所有的內(nèi)部基因均與家禽源AIV毒株具有高度的同源性和密切的遺傳關(guān)系，說明野生水禽在遷徙過程中與家禽發(fā)生了密切的基因交流，這大大提高了家禽養(yǎng)殖業(yè)的風(fēng)險(xiǎn)和AIV防控的難度。并且J746已經(jīng)產(chǎn)生了多個(gè)與增強(qiáng)致病性和改變宿主適應(yīng)性有關(guān)氨基酸突變位點(diǎn)，不排除其存在感染哺乳動(dòng)物的可能。因此，加強(qiáng)對(duì)流感病毒的監(jiān)測(cè)，尤其是對(duì)野生水禽攜帶AIV的主動(dòng)預(yù)警監(jiān)測(cè)研究，無論是對(duì)維護(hù)社會(huì)經(jīng)濟(jì)穩(wěn)定，還是對(duì)提高社會(huì)公共衛(wèi)生水平，都具有重要意義。

表2 J746氨基酸位點(diǎn)分析

Tab.2 Amino acid site analysis of each gene fragment of J746

圖1 HA基因進(jìn)化樹Fig.1 Phylogenetic tree of HA gene 注：圖中加粗部分為J746的HA基因所在分支，箭頭指向J746分離株 Note：The bold part in the figure is the branch of the HA gene of J746，and the arrow points to the J746 isolate

圖2 NA基因進(jìn)化樹Fig.2 Phylogenetic tree of NA gene 注：圖中加粗部分為J746的NA基因所在分支，箭頭指向J746分離株 Note：The bold part in the figure is the branch of NA gene of J746，and the arrow points to the J746 isolate

圖3 PB2基因進(jìn)化樹Fig.3 Phylogenetic tree of PB2 gene 注：圖中加粗部分為J746的PB2基因所在分支，箭頭指向J746分離株 Note：The bold part in the figure is the branch of PB2 gene of J746，and the arrow points to the J746 isolate

圖4 PB1基因進(jìn)化樹Fig.4 Phylogenetic tree of PB1 gene 注：圖中加粗部分為J746的PB1基因所在分支，箭頭指向J746分離株 Note：The bold part in the figure is the branch of PB1 gene of J746，and the arrow points to the J746 isolate

圖5 PA基因進(jìn)化樹Fig.5 Phylogenetic tree of PA gene 注：圖中加粗部分為J746的PA基因所在分支，箭頭指向J746分離株 Note：The bold part in the figure is the branch of PA gene of J746，and the arrow points to the J746 isolate

圖8 NS基因進(jìn)化樹Fig.8 Phylogenetic tree of NS gene 注：圖中加粗部分為J746的NS基因所在分支，箭頭指向J746分離株 Note：The bold part in the figure is the branch of NS gene of J746，and the arrow points to the J746 isolate