王 卓 趙冰冰 李守強(qiáng) 于丹丹 趙 晨 姜雙全 冷曉萍

隨著心臟移植術(shù)手術(shù)方式的不斷改進(jìn)及免疫抑制劑的發(fā)展和應(yīng)用，心臟移植已逐漸成為治療終末期心力衰竭的有效方法。然而，由T-細(xì)胞介導(dǎo)主導(dǎo)的急性排斥反應(yīng)仍是影響移植患者心臟功能和長(zhǎng)期存活的重要因素之一［1］。T細(xì)胞活化和細(xì)胞因子的產(chǎn)生是移植排斥反應(yīng)的中心環(huán)節(jié)。探索移植排斥反應(yīng)的免疫機(jī)制、尋找新的阻斷排斥反應(yīng)的作用位點(diǎn)是抑制急性排斥反應(yīng)的重要途徑［2-3］。研究［4］表明，半乳糖凝集素-7（galectin-7）特異性表達(dá)于移植器官的血管內(nèi)皮細(xì)胞及浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞表面，可以促進(jìn)T細(xì)胞的分化和增殖，進(jìn)而發(fā)生移植排斥反應(yīng)。因此，通過抑制galectin-7蛋白的表達(dá)有可能抑制移植后急性排斥反應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)擬建立大鼠心臟移植急性排斥反應(yīng)模型，以發(fā)生排斥反應(yīng)心肌大量表達(dá)的血管內(nèi)皮細(xì)胞表面黏附因子（intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1）作為靶點(diǎn)，利用ICAM-1靶向陽(yáng)離子超聲納泡（chronic nanobubbles，CNBs）作為 galectin-7-干擾核糖核酸（siRNA）的載體，通過超聲靶向微泡定位釋放（ultrasound-targeted microbubble destruction，UTMD）技術(shù)，即使用低強(qiáng)度聚焦超聲（low intensity focused ultrasound，LIFU）輻照靶向納泡，使其靶向釋放galectin-7-siRNA，介導(dǎo)siRNA下調(diào)galectin-7的表達(dá)從而達(dá)到抑制急性排斥反應(yīng)的目的，實(shí)現(xiàn)心臟移植急性排斥反應(yīng)的靶向治療。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及心臟模型制備

1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：雄性Lewis大鼠60只，體質(zhì)量180～200 g；雄性 Brown Norway大鼠 36只，體質(zhì)量 180～200 g。均購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。

2.模型制備及分組：采用改良的Ono術(shù)式行大鼠異位心臟移植術(shù)，將供體的升主動(dòng)脈和肺動(dòng)脈分別與受體的腹主動(dòng)脈和下腔靜脈吻合，制備心臟移植模型。以雄性Lewis大鼠作為心臟受體，Lewis大鼠作為心臟供體構(gòu)建同系移植ISO組（n=12），Brown Norway大鼠作為心臟供體構(gòu)建異系移植ALLO組，共36只，隨機(jī)將其分為ALLO+磷酸鹽緩沖液（PBS）+LIFU組、ALLO+微泡（NBs）組及ALLO+NBs+LIFU組，每組各12只。

二、實(shí)驗(yàn)主要試劑和儀器

1.主要試劑：二硬脂酰磷脂酰膽堿（PSPC，美國(guó)Avanti公司）；二硬脂酰磷脂酰乙醇胺聚乙二醇2000-生物素（PSPE-PEG-2000-biotin，美國(guó)Avanti公司）；鏈霉親和素（美國(guó)Sigma公司）；小鼠抗大鼠ICAM-1抗體（美國(guó)Abcam公司）；生物素化小鼠抗大鼠ICAM-1抗體（美國(guó)Abcam公司）；FAM-Galectin-7-siRNA（江蘇吉馬基因股份有限公司）；APC標(biāo)記的兔抗小鼠熒光二抗；蘇木素-伊紅染料；DAB顯色劑（美國(guó)RD公司）；抗熒光淬滅劑（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；全氟丙烷氣體（天津核工業(yè)廠）；液氮（哈爾濱黎明氣體廠）

2.儀器與設(shè)備：使用Philips iE Elite彩色多普勒超聲診斷儀，超凈工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備廠）；光學(xué)顯微鏡（日本Olpympus公司）；手術(shù)顯微鏡（日本Olpympus公司）；精密電子天平（日本島津公司）；熒光顯微鏡（德國(guó)Lecia公司）；流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD公司）；庫(kù)爾特顆粒計(jì)數(shù)儀（美國(guó)Beckman Coulter公司）；銀汞振蕩儀（廣東佛山斯凱斯醫(yī)療器械公司）；LIFU實(shí)驗(yàn)裝置（重慶融海超聲醫(yī)學(xué)工程研究中心）；Nano-ZS 90納米粒度及Zeta電位分析儀（英國(guó)馬爾文儀器有限公司）。

三、靶向超聲納泡構(gòu)建

攜galectin-7-siRNA靶向納泡的構(gòu)建采用薄膜-水化法制備超聲納泡，分別取PSPC 10 mg、DSPEPEG-2000-biotin 4 mg及DC-chol 1 mg，加入450 μl去離子水和50μl甘油充分混勻，置于40℃水浴30 min，4℃冰箱中10 min，轉(zhuǎn)移至充滿全氟丙烷氣體的特制管型瓶中，使用銀汞振蕩儀振蕩50 s（頻率600次/min），靜置后加入稀釋并離心，所得上層的乳白色懸浮帶即為脂質(zhì)陽(yáng)離子納泡；并將其濃度稀釋為1.0×107NBs/ml，加入6μg鏈霉親和素于4℃孵育30 min，并離心2次，去除過量的鏈霉親和素。再加入6μg生物素化的ICAM-1抗體，于4℃孵育30 min，離心2次，去除過量的ICAM-1抗體，即得到攜ICAM-1抗體的靶向陽(yáng)離子納泡（NBICAM-1）［5］。顯微鏡觀察納泡的形態(tài)，使用納米粒度及電位分析儀檢測(cè)納泡的粒徑和表面電位。

將NBICAM-1與綠色熒光標(biāo)記的大鼠galectin-7-siRNA按照荷電比1∶2～2∶1的不同比例混合，室溫孵育30 min，通過靜電吸附作用得到galectin-7-siRNA/NBICAM-1，離心2次，去除過量的siRNA。應(yīng)用紅色熒光標(biāo)記的二抗與galectin-7-siRNA/NBICAM-1孵育，使其與ICAM-1抗體結(jié)合，并在熒光顯微鏡下觀察siRNA及ICAM-1與納泡連接的情況，流式細(xì)胞儀檢測(cè)siRNA及 NBICAM-1連接率［6］。

四、UTMD介導(dǎo)載基因靶向納泡治療心臟移植排斥反應(yīng)

ISO組和ALLO組大鼠于術(shù)后第1、3、5、7天分別經(jīng)鼠尾靜脈注射靶向納泡（濃度1×107NBs/ml）400μl或等劑量的PBS，隨即用2 ml生理鹽水沖管，注射30 s后，使用LIFU實(shí)驗(yàn)裝置對(duì)移植心臟進(jìn)行靶向爆破，頻率1 MHz，功率2.0 W/cm2，占空比50%，使用超聲診斷儀造影模式于胸骨旁乳頭肌水平短軸持續(xù)觀察，至心肌內(nèi)納泡顯影完全消失時(shí)停止LIFU爆破。

五、病理學(xué)檢測(cè)

于心臟移植后第10天處死大鼠并摘取供心標(biāo)本，用4%福爾馬林固定24 h，梯度酒精脫水、二甲苯透明，進(jìn)行石蠟包埋并切片（厚度6μm），行HE染色，光鏡下觀察心肌的病理學(xué)改變。排斥反應(yīng)的病理學(xué)分級(jí)依照國(guó)際心肺移植協(xié)會(huì)（ISHLT）制定的標(biāo)準(zhǔn)［7］：0級(jí)，正常心?。虎窦?jí)，排斥反應(yīng)表現(xiàn)為少量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，無(wú)心肌壞死；Ⅱ級(jí)，排斥反應(yīng)表現(xiàn)為中等量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)伴少量心肌壞死；Ⅲ級(jí)，排斥反應(yīng)表現(xiàn)為彌漫型淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)伴中等量心肌壞死；Ⅳ級(jí)，排斥反應(yīng)表現(xiàn)為彌漫型淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)伴嚴(yán)重心肌壞死。

另取切片行免疫組化染色，用抗大鼠的galectin-7抗體（0.5 mg/ml）孵育于4℃過夜，鏈親和素-辣根過氧化物酶室溫孵育30 min，應(yīng)用DAB顯色劑進(jìn)行顯色，并在顯微鏡下觀察galectin-7的分布及表達(dá)程度，使用Image Pro Plus軟件分析galectin-7表達(dá)情況。

六、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以x±s表示，組間兩兩比較采用單因素方差分析；病理等級(jí)比較行K獨(dú)立樣本檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、siRNA/NBs的表征及基因攜帶能力檢測(cè)

納泡在光鏡下顯示為均勻分布的球形（圖1A），平均粒徑（221.25±34.21）nm（圖1B），其Zeta電位（51.32±2.21）mV（圖1C）。熒光顯微鏡下觀察顯示靶向納泡表面攜帶抗ICAM-1為紅色熒光，siRNA為綠色熒光（圖2）。流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示，同時(shí)攜帶ICAM抗體和galectin-7-siRNA的微泡所占百分比為71%（圖3）。

二、免疫組化檢測(cè)UTMD體內(nèi)轉(zhuǎn)染效率

免疫組化結(jié)果顯示，ALLO+PBS+LIFU組和ALLO+NBs組均可觀察到心肌組織內(nèi)galectin-7大量表達(dá)，ALLO+NBs+LIFU組中g(shù)alectin-7陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量顯著減少，galectin-7表達(dá)水平減低，與ALLO+NBs組和ALLO+PBS+LIFU組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。見圖4，5。

三、移植心臟排斥反應(yīng)分級(jí)

ALLO+PBS+LIFU組和ALLO+NBs組的大鼠供體心臟切片均可觀察到心肌及心內(nèi)膜中有大量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，心肌細(xì)胞凝結(jié)壞死，心肌間質(zhì)內(nèi)大量紅細(xì)胞聚集，符合ISHLTⅢ～Ⅳ級(jí)。與ALLO+PBS+LIFU組和ALLO+NBs組比較，ALLO+NBs+LIFU組顯示免疫排斥反應(yīng)相對(duì)較弱，僅2只符合排斥反應(yīng)Ⅲ級(jí)，其余10只均表現(xiàn)為血管病變較局限，心肌內(nèi)僅出現(xiàn)少量壞死，淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)多見于心內(nèi)膜，但數(shù)量明顯減少，符合ISHLTⅠ～Ⅱ級(jí)（圖6），與ALLO+NBs組及ALLO+PBS+LIFU組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。見圖7。

圖1 靶向納泡特性檢測(cè)圖

圖2 攜galectin-7-siRNA靶向納泡特性檢測(cè)圖

圖3 靶向納泡與galectin-7-siRNA和ICAM抗體的連接率

圖4 免疫組化檢測(cè)各組大鼠移植心臟內(nèi)galectin-7表達(dá)（×400）

圖5 各組大鼠移植心臟galectin-7表達(dá)水平比較

圖6 HE染色檢測(cè)各組大鼠移植心臟急性排斥反應(yīng)程度（×400）

圖7 各組大鼠移植心臟急性排斥反應(yīng)分級(jí)圖

討 論

心臟移植后，早期發(fā)現(xiàn)和及時(shí)治療急性排斥反應(yīng)對(duì)于患者的遠(yuǎn)期存活至關(guān)重要。目前的免疫抑制療法主要使用小分子藥物，但由于其半衰期短，對(duì)細(xì)胞特異性不足，長(zhǎng)期使用易導(dǎo)致全身免疫系統(tǒng)失衡，造成感染及腫瘤等并發(fā)癥。因此，臨床上迫切需要一種克服小分子藥物上述缺陷的新的治療方法。siRNA體積小，易于包被成為抑制細(xì)胞中mRNA表達(dá)的有效方法，但存在在生物體內(nèi)不穩(wěn)定，易被核酸降解，半衰期短，轉(zhuǎn)染效率低的問題，因此需要基因載體使目的基因運(yùn)送至靶細(xì)胞［8-9］。病毒是基因傳遞最常用的載體，病毒載體雖然具有較高的基因轉(zhuǎn)染效率，但因存在毒性和免疫原性等問題其應(yīng)用受限。本實(shí)驗(yàn)采用UTMD技術(shù)，利用超聲納泡這種安全、便捷的非病毒載體載入 siRNA，靶向釋放基因［10］。

研究［11-12］表明，galectin-7蛋白特異性表達(dá)在移植器官的血管內(nèi)皮細(xì)胞和浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞表面，并與細(xì)胞的凋亡和增殖有關(guān)。在T細(xì)胞介導(dǎo)的急性排斥反應(yīng)中，Th1型細(xì)胞因子可以誘發(fā)遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)，啟動(dòng)或加速器官移植排斥反應(yīng)的發(fā)生發(fā)展；Th2型細(xì)胞因子可抑制Th1細(xì)胞的分化和Th1型細(xì)胞因子的表達(dá)，調(diào)節(jié)免疫排斥反應(yīng)，促進(jìn)器官移植免疫耐受的建立。galectin-7對(duì)T淋巴細(xì)胞具有促進(jìn)增殖及誘導(dǎo)Th1/Th2細(xì)胞平衡向Th1細(xì)胞優(yōu)勢(shì)應(yīng)答偏移的作用，從而誘導(dǎo)移植排斥反應(yīng)發(fā)生。另有研究［11］表明，galectin-7可以與抗CD3/CD28抗體活化的T細(xì)胞中的pSmad3蛋白相互作用，并誘導(dǎo)pSmad3蛋白向胞漿轉(zhuǎn)位，表明galectin-7有阻斷活化的T淋巴細(xì)胞TGFβ/Smad信號(hào)通路的作用；由此也反映通過抑制galectin-7在活化的CD4+T細(xì)胞中的表達(dá)有可能抑制急性排斥反應(yīng)的發(fā)生。本實(shí)驗(yàn)中，ALLO+PBS+LIFU組和ALLO+NBs組心肌組織內(nèi)見大量galectin-7表達(dá)，而當(dāng)使用NBs+LIFU成功抑制異系移植大鼠galectin-7表達(dá)量后，急性排斥反應(yīng)的程度明顯減弱，證明在急性排斥反應(yīng)的早期抑制galectin-7蛋白表達(dá)，可以達(dá)到抑制急性排斥反應(yīng)的效果，也說明galectin-7有望成為急性排斥基因治療的全新靶點(diǎn)。

本實(shí)驗(yàn)使用了ICAM-1靶向納泡，使其能夠聚集在急性排斥反應(yīng)發(fā)生區(qū)域，同時(shí)使用UTMD提高siRNA轉(zhuǎn)染效率，通過UTMD產(chǎn)生的聲孔效應(yīng)，使siRNA直接進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，實(shí)現(xiàn)溶酶體逃逸，從而提高基因敲除效率［13］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，ALLO+PBS+LIFU組、ALLO+NBs組及ALLO+NBs+LIFU組比較，前兩組galectin-7表達(dá)量基本相似，而ALLO+NBs+LIFU組galectin-7蛋白表達(dá)量明顯減低（均P＜0.05），說明靶向ICAM-1的納泡能夠有效地將galectin-7-siRNA轉(zhuǎn)運(yùn)到大鼠心肌組織細(xì)胞中，并能成功減低galectin-7表達(dá)，證明UTMD技術(shù)結(jié)合siRNA靶向基因敲除具有較高效率。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)通過UTMD結(jié)合ICAM-1靶向納泡，成功實(shí)現(xiàn)galectin-7-siRNA的體內(nèi)轉(zhuǎn)染，并通過抑制galectin-7蛋白的表達(dá)減輕了移植后急性排斥反應(yīng)，證明UTMD結(jié)合galectin-7-siRNA基因轉(zhuǎn)染有望成為治療心臟移植后急性排斥反應(yīng)的一種新方法。