周繼慧，金學(xué)榮，涂 璇，望松柏，王洋洋

（三峽大學(xué)生物與制藥學(xué)院，湖北宜昌 443002）

酵母是一種生長于濕潤且偏酸性環(huán)境中的單細(xì)胞真核微生物，與人類生活生產(chǎn)關(guān)系密切，在烘焙、釀酒、油品脫蠟、藥物生產(chǎn)等方面應(yīng)用廣泛[1]。神農(nóng)架位于湖北省西部，屬于中緯度北亞熱帶季風(fēng)區(qū)，古老漫長的地理變遷和相對封閉的自然環(huán)境，使神農(nóng)架全境蘊(yùn)藏著豐富的自然資源[2]。在該地區(qū)很早就有人類活動(dòng)，釀酒歷史悠久，民間有許多釀酒作坊。由于所處地理位置的交通不便，這些釀酒作坊各自都使用自己傳統(tǒng)保留的酒曲來釀酒。酒曲常以米粉或麩皮等為原料,接入一定量的母曲或者采用自然接種,在一定溫度、濕度及通風(fēng)條件下制成[3]。

酒曲中除了有豐富的糖化菌，同時(shí)酵母種類也十分豐富，對于酵母菌類群的分類，傳統(tǒng)的研究方法采用形態(tài)學(xué)鑒定和生理生化指標(biāo)[4]。近年一系列的分子生物學(xué)技術(shù)也逐步應(yīng)用到菌種的鑒定分類上來[5-7]，這使得分類步驟得以簡化，大大降低了工作的復(fù)雜性及縮短了實(shí)驗(yàn)時(shí)間。人們對馴養(yǎng)動(dòng)植物早已有了較為廣泛和深入的研究[8-9]，但對馴養(yǎng)微生物的研究還較為薄弱，甚至可以說是剛剛起步階段。美國研究人員通過對酵母基因序列分析，發(fā)現(xiàn)野生酵母與馴養(yǎng)酵母菌確實(shí)存在遺傳分化[10]。這一研究使得許多研究人員開始釀酒酵母菌群體遺傳學(xué)的相關(guān)研究。本實(shí)驗(yàn)利用rDNA-ITS 序列對從酒曲中所分離的酵母菌進(jìn)行鑒定并結(jié)合形態(tài)學(xué)特征和抗逆性能探討了酒曲中酵母菌的多樣性，對了解神農(nóng)架地區(qū)酵母菌資源的多樣性，篩選優(yōu)良性狀的釀酒酵母菌菌株，保護(hù)我國神農(nóng)架地區(qū)的酵母菌資源具有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

1.1.1 酒曲

酒曲原料：分別來自湖北神農(nóng)架及周邊地區(qū)，神農(nóng)架溫水林場、木魚鎮(zhèn)、興山，秭歸和宜昌。從9種不同酒曲中共分離獲得19 株酵母菌株，發(fā)酵特性參照安琪酵母。

1.1.2 培養(yǎng)基

分離純化培養(yǎng)基（YPD）：酵母膏10 g，蛋白胨20 g，葡萄糖20 g，瓊脂粉15～20 g，加入1000 mL蒸餾水，高壓滅菌后，臨用前加入氯霉素，使其終濃度為100 μg/L。

產(chǎn)子囊孢子培養(yǎng)基（McClary）：購自北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

發(fā)酵培養(yǎng)基：酵母抽提物0.5 g/L，磷酸二氫鉀1 g/L，氯化鈣1.8 g/L，葡萄糖10 g/L，pH4.0。

1.1.3 主要儀器和試劑顯微鏡OLYMPUS BX53，即用PCR 擴(kuò)增試劑盒（上海生工），PCR儀（東勝龍），電泳儀DYY-2型（北京六一儀器廠），凝膠成像系統(tǒng)Gel.DocXR+(Bio-Rad),SDA-40D 生物傳感分析儀（山東省科學(xué)院生物研究所），pH 計(jì)(上海幫西儀器科技有限公司)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 供試菌株的分離純化

稱取研磨的酒曲粉末1 g，加入99 mL 無菌水溶解均勻后再依次進(jìn)行梯度稀釋，取10-3、10-4、10-5稀釋菌液0.1 mL 進(jìn)行涂布，28 ℃培養(yǎng)1～3 d；用接種環(huán)挑取可疑單菌落多次劃線分離得到純種，4 ℃保藏。

1.2.2 形態(tài)學(xué)觀察

將活化好的菌株接種于新鮮的YPD 平板，28 ℃培養(yǎng)1～3 d，觀察并記錄菌落形態(tài)；涂片后在顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)及是否出芽生殖；將活化后的酵母菌接種到McClary 平板上，28 ℃培養(yǎng)7 d 后顯微鏡觀察產(chǎn)子囊孢子情況以及子囊孢子形態(tài)。

1.2.3 抗逆性能測定

分別對酒精濃度、高溫、高糖、乙酸、糠醛類化合物的耐受性及抗凍融性幾個(gè)方面進(jìn)行抗逆性能的測定。每個(gè)條件進(jìn)行梯度設(shè)置，觀察菌種生長狀況[11-14]。

1.2.4 酵母菌rRNA-ITS區(qū)域分析

1.2.4.1 DNA的提取

DNA微量提取法[15]。

1.2.4.2 rRNA-ITS區(qū)域PCR反應(yīng)

PCR擴(kuò)增程序采用上海生工即用PCR試劑盒，引物為ITS1（tcc gta ggt gaa cct gcg c）和ITS4（tcc tcc gct tat tga tat gc）。

PCR 反應(yīng)條件：94 ℃、5 min，然后94 ℃變性30 s，55 ℃退火40 s，72 ℃延伸90 s，35 個(gè)循環(huán)后72 ℃延伸10 min[16]。

取5 μL PCR 產(chǎn)物在1.2%的瓊脂糖凝膠上，于100 V，100 mA 條件下進(jìn)行電泳檢測，電泳結(jié)束后用凝膠成像系統(tǒng)顯示結(jié)果。

1.2.4.3 測序及序列分析

PCR 原液送至武漢艾康健生物科技有限公司進(jìn)行雙向測序，正反向引物分別為上述的ITS1 和ITS4。將測序返回的結(jié)果在線Blast 比對，對同源序列進(jìn)行搜索，比較供試菌株與已知菌株序列的同源性，根據(jù)搜索結(jié)果的同源序列，用Clustal X 軟件進(jìn)行匹配測試菌株的多重序列和相關(guān)的菌株，并采用mega6.0 軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，對供試菌種進(jìn)行多樣性分析[17-18]。

表1 酒曲來源及菌株編號分布

2 結(jié)果與分析

2.1 實(shí)驗(yàn)材料的采集和分離

本實(shí)驗(yàn)收集神農(nóng)架地區(qū)不同地方共9 種酒曲，從中分離出22 株酵母菌株，根據(jù)來源與形態(tài)觀察，最后確定19 個(gè)菌株進(jìn)行后續(xù)研究，酒曲采集的地點(diǎn)分布和分離的菌株編號見表1。

2.2 菌株的初步形態(tài)分類

2.2.1 菌落的形態(tài)觀察

將保藏的菌株在YPD 固體培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)，觀察不同菌株單菌落的形態(tài)、顏色等。從菌落圖片顯示，分離純化得到的菌株菌落主要為乳白色，淡黃色和深黃色，其中A-2.1、A-2.2、B-2.1 等為乳白色，A-3.1、A-3.2 等為淡黃色，G 為深黃色。其中B-2.1 菌落濕潤光滑，而A-1、D、F-1、F-2 菌落為放射狀或絨毛狀且表面干燥，不易挑起。不同菌株間菌落的形態(tài)比較多樣。菌落描述匯總見表2。部分菌落形態(tài)如圖1所示。

2.2.2 細(xì)胞形態(tài)觀察

對19 株菌進(jìn)行觀察，結(jié)果顯示，大部分菌株細(xì)胞為橢圓形到球形，如A-3.1，B、1.1、B-1.2、G、M-3 具有典型的橢圓形；A-2.1，E-1 形態(tài)呈圓球形，與橢圓形有很明顯相異。19 株菌中統(tǒng)計(jì)得到球形菌株為4 株，橢圓形菌株有12 株，另有3 株介于圓形和橢圓形之間。細(xì)胞形態(tài)匯總見表2。部分細(xì)胞形態(tài)如圖2。

表2 各酵母菌菌株的形態(tài)學(xué)鑒定

2.2.3 子囊孢子的觀察

酵母菌接種到McClary 培養(yǎng)基中，培養(yǎng)7 d 后進(jìn)行子囊孢子的觀察。結(jié)果顯示，A-3.1、B-1.1、B-1.2、G、M-3 具有較為明顯的子囊孢子產(chǎn)生。在其視野中可以觀察到有4 個(gè)孢子包裹在子囊中。M-2、A-1 視野中可以觀察到有3 個(gè)孢子被包裹在子囊中。但是在其他菌株中沒有觀察到子囊孢子的產(chǎn)生。子囊孢子產(chǎn)生與否見表2。部分菌株的子囊孢子形態(tài)見圖3。

2.3 抗逆性能實(shí)驗(yàn)

2.3.1 耐酒精實(shí)驗(yàn)

空白和加8%vol 乙醇的培養(yǎng)基平板上酵母均生長，但從圖片中可以明顯觀察到加乙醇的培養(yǎng)基中酵母生長明顯沒有對照組的長勢好。在10%vol乙醇的培養(yǎng)基平板上有18 株酵母生長，12%vol 乙醇的培養(yǎng)基平板上有19 株酵母生長，14%vol 乙醇的培養(yǎng)基平板上有4 株酵母生長，16%vol 乙醇的培養(yǎng)基平板上有12 株酵母生長。18%vol 的乙醇濃度中酵母均沒有生長。每個(gè)菌株的生長情況見表2。從表2 可以看出，編號為A-1、A-2.2、A-3.1、B-1.1、B-1.2、C-1.1、C-1.2、D、E-2.2、G、J、M-1、M-2 的酵母有較高的耐乙醇性能。菌種生長狀況統(tǒng)計(jì)如表3所示。

2.3.2 耐高溫實(shí)驗(yàn)

從表3 可以看出，在40 ℃有15 株菌株生長，43 ℃有12 株菌株生長，而在45 ℃只有編號為J、F-1、B-2.1 3株菌株生長，菌種生長狀況如表4所示。

2.3.3 耐乙酸實(shí)驗(yàn)

pH 值是影響酵母生長的重要因素，馴養(yǎng)酵母對pH值的適應(yīng)范圍沒有野生酵母的廣泛。檢測19株酵母的耐乙酸程度，生長狀況如表4 所示，從表4可以看出，pH3.5 酵母均不生長，pH4 時(shí)只有編號為C-1.1、C-1.2的菌株生長如圖3所示，而在pH4.5時(shí)，所有測試的酵母都生長?？梢缘贸鼋Y(jié)論，本實(shí)驗(yàn)所用的釀酒酵母的最適生長pH值范圍是4.0～4.5。

表3 耐酒精實(shí)驗(yàn) (%vol)

表4 酒曲酵母菌耐受性 (%vol)

2.3.4 耐高糖實(shí)驗(yàn)

將葡萄糖2%的為空白組和含高糖的培養(yǎng)基進(jìn)行對照。在2%～40%的含糖濃度的培養(yǎng)基中酵母菌生長如表5，在含糖量達(dá)到48%時(shí)，有編號為A-1、A-2.1、A-2.2、A-3.1、B-1.1、B-2.1、C-1.1、C-1.2、D、E-1、E-2.2、G、M-1 的酵母有明顯的生長。可以得出本實(shí)驗(yàn)所用酵母對糖具有很高的耐受能力。

2.3.5 酵母對糠醛類化合物的耐受能力實(shí)驗(yàn)

從表6 可以看出，實(shí)驗(yàn)所用到的酵母在培養(yǎng)基糠醛濃度為10～25 mmol/L 時(shí)，酵母均表現(xiàn)出生長的狀態(tài)，且在糠醛濃度為30 mmol/L 時(shí)有13 株酵母生長?？梢猿醪降贸鲴Z養(yǎng)酵母對于糠醛具有較強(qiáng)的抗逆性。本實(shí)驗(yàn)所用的A-2.1、A-3.1、B-1.2、B-2.1、B-2.2、C-1.1、C-1.2、D、E-2.2、F-1、G、M-1、M-2均對糠醛表現(xiàn)出抗逆性，生長情況見表6。

表5 酒曲酵母菌對葡萄糖濃度的耐受性

表6 對糠醛類化合物的耐受性

2.3.6 抗凍融試驗(yàn)

將置于-20 ℃的冰箱里冰凍36 h 再解凍的酵母接種到Y(jié)PD 培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h，發(fā)現(xiàn)酵母均生長，選出兩個(gè)長勢較好的平板如圖4。

2.4 PCR擴(kuò)增

將提取的基因組DNA 作為模板進(jìn)行ITS 序列的擴(kuò)增，測序得到菌株ITS 序列片段大小為500～800 bp。PCR電泳圖譜如圖5所示。

2.5 ITS序列測定及分類研究

對實(shí)驗(yàn)菌株進(jìn)行基因組DNA 的提取后，擴(kuò)增其ITS序列，將ITS序列測序返回的結(jié)果在NCBI上進(jìn)行Blast 比對，然后用Clustal X 軟件進(jìn)行比對，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹進(jìn)行多樣性的分析。各菌株比對的結(jié)果如表2。N-J系統(tǒng)發(fā)育樹見圖6。

使用ITS1，ITS4 引物對19 株菌的ITS 序列進(jìn)行擴(kuò)增測序，得到19 個(gè)序列片段。ITS 序列測序結(jié)果表明（表4），所得到的序列長度為500～800 bp，Blast 比對結(jié)果顯示19 株實(shí)驗(yàn)供試菌分成5 個(gè)屬，分別為Wickerhamomycessp.,Pichia sp.,Saccharomycopsissp.，Candidasp.，Saccharomycessp.。Blast 比對顯示，A-1、A-2.1、B-2.1、D、M-1、M-2 比對結(jié)果為100%，故可以確定這幾株菌的種屬。由比對的結(jié)果可以看出，從酒曲中分離出來的酵母大多數(shù)都屬于Wickerhamomycessp.，共分離出來8株（A-2.1、A-2.2、B-2.1、C-1.1、C-1.2、D、M-1、M-2），占分離菌種的42.1%；另外Pichiasp.有1株（A-1），占菌株總數(shù)的5.3%，Saccharomycopsissp.有3 株（E-1、F-2、J），占菌株總數(shù)的15.8%，Candidasp.有1 株（E-2.2），占菌株總數(shù)的5.3%，Saccharomycessp.（A-3.1、A-3.2、B-1.1、B-1.2、G、M-3）有6株，占總數(shù)的31.6%。由此可以看出，酒曲中的優(yōu)勢菌群為Wickerhamomycessp.，其次為Saccharomycessp.。經(jīng)過Blast 比對結(jié)果的相似度都在99%及以上，可以說明所分離出來的菌種都屬于已知菌株，明確了其分類的種屬。

將序列比對后構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，由實(shí)驗(yàn)菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹可以看出，19 株馴養(yǎng)酵母菌基本由5 個(gè)分支組成，A-2.1、A-2.2、B-2.1、C-1.1、C-1.2、D、M-1、M-2 這8 株菌構(gòu)成一個(gè)獨(dú)立分支；E-1、F-2、J 3 株菌構(gòu)成一個(gè)單獨(dú)分支；A-3.1、A-3.2、B-1.1、B-1.2、G、M-3 構(gòu)成一個(gè)分支；菌株A-1 單獨(dú)處在一個(gè)分支上；菌株E-2.2 也單獨(dú)遠(yuǎn)離分布在一個(gè)分支上。

菌株A-2.1、A-2.2、B-2.1、C-1.1、C-1.2、D、M-1、M-2 在系統(tǒng)樹上聚集在以Wickerhamomycessp.為代表的分支中。結(jié)合這一部分菌的形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，這一分支中的酵母菌其菌落形態(tài)基本都是濕潤的圓形突起，細(xì)胞形態(tài)均呈圓形，沒有觀察到子囊孢子的產(chǎn)生。但是在該分支中的菌株D 其菌落呈白色絨毛狀，和其他聚集在此分支上的菌株有較大的差別。E-2.2 聚集在Candidasp.這一分支上，該菌菌落呈現(xiàn)為淡黃色，較為濕潤，細(xì)胞形態(tài)為橢圓形。E-1、F-2、J聚集在Saccharomycopsissp.分支中，聚集在此分支上的菌株菌落形態(tài)均為白色絨毛狀，微突起形態(tài)，細(xì)胞形態(tài)從圓形到橢圓形不太一致。結(jié)合前面陳述的，Wickerhamomycessp.分支中菌株D 在形態(tài)上與此分支有著共同之處。A-3.2、B-1.1、B-1.2、G、M-3 聚集在Saccharomycessp.這一分支中，聚集在此分支上的酵母菌具有典型的釀酒酵母的菌落形態(tài)，其菌落均為淡黃色，濕潤的圓形菌落；且這幾株菌細(xì)胞形態(tài)為典型的橢圓形，結(jié)合比對結(jié)果及發(fā)酵性能可以確定這5 株菌即為釀酒酵母屬。

結(jié)合抗逆性實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，以上19 株菌株中，除所屬Saccharomycopsissp.的3 株菌株中僅有J 具有較高的酒精耐受性外，其余種屬的大部分菌株均具有較高的酒精耐受性；但是在耐高溫的抗逆性實(shí)驗(yàn)中，所屬Saccharomycopsissp.的3 株菌株中有兩株表現(xiàn)良好的耐受性，其余種屬的菌株的高溫耐受性較差；在耐高糖的抗逆性實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)所屬Wickerhamomycessp.的菌株表現(xiàn)良好的高糖耐受性，其余菌屬的高糖耐受性較差；除所屬Saccharomycopsissp 的菌株耐糖醛的性能較差外，其余菌株均表現(xiàn)良好的糖醛耐受性；在耐乙酸和耐凍融性實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)所有菌株均表現(xiàn)良好的耐受性。因此實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，菌株的抗逆性能與所屬種屬具有一定的關(guān)系，其中所屬Wickerhamomycessp.的菌株大多數(shù)表現(xiàn)有良好的抗逆耐受性。

3 結(jié)論

通過對神農(nóng)架周邊地區(qū)酒曲分離出來的酵母菌進(jìn)行形態(tài)學(xué)的鑒定，發(fā)酵性能的檢測及ITS 序列的測定，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹分析，確定各菌株之間的親緣關(guān)系，得到的結(jié)果如下：19 株馴養(yǎng)酵母經(jīng)Blast比對，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹分析，分屬于5 個(gè)屬，分別為Pichiasp.（1 株），Wickerhamomycessp.（8 株），Saccharomycopsissp.（3 株），Candidasp.（1 株），Saccharomycessp.（6 株），其中優(yōu)勢菌群為Wickerhamomycessp.和Saccharomycessp.；從（長陽）苞谷酒曲中共分離出5 株酵母菌，其中2 株屬于Wickerhamomycessp.，1 株P(guān)ichiasp.,2 株Saccharomycessp.；從神農(nóng)架溫水林場小曲中分離出3 株菌，分別為1 株Wickerhamomycessp.，2 株Saccharomycessp.；從下牢溪老酒坊小曲中分離出2 株Wickerhamomycessp.；秭歸甜酒曲中分離出了1 株Saccharomycopsissp.，1株Candidasp.，1株Wickerhamomycessp.；張家界甜酒曲中分離出1 株Saccharomycopsissp.，1 株Candidasp.；從神農(nóng)架木魚鎮(zhèn)酒曲得到1 株Saccharomycopsissp.以及1 株Saccharomycessp.；從興山甜酒曲中得到1 株Saccharomycopsissp.；從宜昌大曲中分離出2 株Wickerhamomycessp.，1 株Saccharomycessp.。結(jié)合菌種形態(tài)學(xué)研究、抗逆性實(shí)驗(yàn)以及ITS 序列測定及分類研究，發(fā)現(xiàn)菌種的形態(tài)、抗逆性均與其所屬種屬具有一定的關(guān)系，其中絕大部分菌株可耐受pH4.0～4.5 以及-20 ℃的凍融環(huán)境，大部分可耐受16%vol 的酒精以及30 mmol/L 的糠醛濃度，只有B-2.1、F-2 以及J 可耐受45 ℃的高溫環(huán)境，一部分菌株可耐受48%的高糖濃度。此研究在一定程度上說明了神農(nóng)架周邊地區(qū)馴養(yǎng)釀酒酵母多樣性較為豐富，且初步可判斷Wickerhamomycessp.的大多數(shù)菌株具有較好的抗逆耐受性，為這些菌株應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)提供了依據(jù)。但是由于樣品采集的局限性，該研究結(jié)果只能作為后續(xù)研究的一個(gè)指導(dǎo)，對于需要得到更加準(zhǔn)確的研究結(jié)果必須擴(kuò)大樣品的收集，結(jié)合相關(guān)的生理生化指標(biāo)進(jìn)行。