岳思君，馮翠娥，楊彥研，陳麗萍，郭 洋，鄭 蕊，蘇建宇

(寧夏大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，西部特色生物資源保護(hù)與利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 寧夏 銀川 750021)

連作障礙作為長期困擾農(nóng)業(yè)生產(chǎn)可持續(xù)發(fā)展的原因之一，其形成機(jī)制一直是農(nóng)業(yè)發(fā)展研究的熱點(diǎn)。影響農(nóng)作物連作障礙發(fā)生的因素有很多，有研究表明，其主要原因是由于土壤生態(tài)環(huán)境失衡[1]。土壤微生物在土壤生態(tài)環(huán)境中生物與環(huán)境物質(zhì)循環(huán)和能量轉(zhuǎn)換間扮演重要角色，是土壤環(huán)境正常運(yùn)行的重要組成部分[2]。同時(shí)，土壤微生物對(duì)土壤基質(zhì)變化比較敏感，對(duì)土壤養(yǎng)分的吸收與轉(zhuǎn)化、作物生長發(fā)育有顯著影響[3]。連作土壤中土壤微生物群落結(jié)構(gòu)與功能的改變是導(dǎo)致土壤肥力下降、作物減產(chǎn)的主要原因[4]。連作會(huì)破壞土壤微生物群落結(jié)構(gòu)與物種多樣性，促進(jìn)病原微生物的生長與積累，抑制有益微生物繁殖，作物產(chǎn)量顯著降低[5-6]。同時(shí)，土壤微生物多樣性和群落結(jié)構(gòu)也會(huì)受到作物連作時(shí)間的影響，連作時(shí)間越長，微生物群落結(jié)構(gòu)差異越明顯[7-8]。細(xì)菌是土壤環(huán)境中重要的微生物類群，研究表明，連作會(huì)影響土壤細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)，阻礙馬鈴薯、棉花、番茄等作物的生長[9-11]。

硒砂瓜主產(chǎn)于寧夏中衛(wèi)市環(huán)香山地區(qū)，其采用壓砂栽培技術(shù)，并富含硒元素，故得名“硒砂瓜”，是當(dāng)?shù)刂饕慕?jīng)濟(jì)作物。硒砂瓜栽培生產(chǎn)中由于西瓜枯萎病而導(dǎo)致連作障礙嚴(yán)重，硒砂瓜產(chǎn)量和品質(zhì)受到明顯影響。目前，對(duì)于硒砂瓜土壤中細(xì)菌多樣性以及連作時(shí)間對(duì)土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響少有報(bào)道，研究闡明連作條件下硒砂瓜土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)及變化規(guī)律，對(duì)減少硒砂瓜土傳病害發(fā)生，提高硒砂瓜產(chǎn)量和品質(zhì)具有重要意義。本研究應(yīng)用高通量測(cè)序技術(shù)，分析寧夏中衛(wèi)市環(huán)香山地區(qū)不同連作年限硒砂瓜土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)特征，為采用合理有效方法防治連作條件下硒砂瓜土傳病害的發(fā)生提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究地概況

試驗(yàn)地點(diǎn)位于寧夏中衛(wèi)市沙坡頭區(qū)(105°25′ E、36°97′ N)，海拔1 642.0 m，年平均氣溫8.8℃，年降水量179.6 mm，年蒸發(fā)量為1 829.6 mm，供試土為砂土。

試驗(yàn)設(shè)置5個(gè)處理：分別為連作5 a(T5)、10 a(T10)、15 a(T15)、20 a(T20)及對(duì)照土壤(T0，未種植硒砂瓜)，各處理分別設(shè)置3個(gè)重復(fù)，根據(jù)連作時(shí)間進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)。

1.2 樣本采集

于2017年10月1日在試驗(yàn)區(qū)采樣。硒砂瓜采收后期去除表層(0～15 cm)砂石，在深度為15～25 cm處取土，每個(gè)處理各采集3份土壤，每份土樣分別采用五點(diǎn)取樣法取樣，除去土壤中的植物根系、碎石及其他雜物，混勻成1份土樣裝進(jìn)塑封袋，置入冰盒帶回實(shí)驗(yàn)室，一部分鮮土置于超低溫冰箱，用于微生物多樣性研究；另一部分土樣自然風(fēng)干后過1 mm篩子，用于測(cè)定土壤中全氮、全鉀、全磷、堿解氮、速效磷、速效鉀、pH值、有機(jī)質(zhì)等。

1.3 土壤理化性質(zhì)測(cè)定

按照土壤農(nóng)化分析方法[12]，土壤pH值采用電位法測(cè)定(水∶土=2.5∶1)；土壤有機(jī)質(zhì)含量測(cè)定采用重鉻酸鉀外加熱法，全氮采用凱氏定氮法，堿解氮采用擴(kuò)散法，全磷采用礬鉬黃比色法，速效磷采用鉬銻抗比色法，全鉀采用ICP法，速效鉀采用原子吸收分光光度計(jì)法。

1.4 Illumina Miseq測(cè)序

土壤樣本送上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司的Illumina Miseq PE300 平臺(tái)(San Diego, CA, USA)進(jìn)行16s rDNA高通量測(cè)序。

1.5 序列分析

原始測(cè)序序列使用Trimmomatic[13]軟件質(zhì)控，使用FLASH軟件進(jìn)行拼接：去除質(zhì)控后長度低于50 bp的序列；去除模糊堿基；根據(jù)重疊堿基overlap將兩端序列進(jìn)行拼接。使用的UPARSE v7.1軟件[14]，對(duì)有效數(shù)據(jù)在97%的相似度水平進(jìn)行操作分類單元OTU聚類；使用UCHIME軟件[15]剔除嵌合體。利用RDP classifier (http://rdp.cme.msu.edu/)[16]對(duì)每條序列進(jìn)行物種分類注釋，比對(duì)Unite(Release 6.0 http://unite.ut.ee/index.php)數(shù)據(jù)庫，設(shè)置比對(duì)閾值為70%，并在各個(gè)水平上統(tǒng)計(jì)樣本的群落組成。

1.6 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 2016進(jìn)行計(jì)算，通過SPSS 19.0進(jìn)行單因素方差分析(P<0.05)，表中數(shù)據(jù)均采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 硒砂瓜連作對(duì)土壤理化性質(zhì)的影響

不同連作年限土壤pH值均大于8，為堿性土。土壤pH值隨連作年限的增加而增大，至連作20 a略有降低；與T0土壤相比，T5～T20土壤有機(jī)質(zhì)、全氮、速效鉀、全磷含量均增加，其中T5土壤中全氮、速效磷、全磷、速效鉀、堿解氮含量最高，T15土壤中有機(jī)質(zhì)含量最高。從結(jié)果可知，土壤綜合理化性質(zhì)與硒砂瓜連作年限不存在相關(guān)性。因此，硒砂瓜連作障礙不是由于土壤理化性質(zhì)的改變所導(dǎo)致的(表1)。

2.2 測(cè)序數(shù)據(jù)分析

對(duì)5份不同連作年限的硒砂瓜土壤樣本v3-v4區(qū)進(jìn)行Illumina 高通量測(cè)序并進(jìn)行優(yōu)化后，5份土壤樣本共獲得835 534條序列，平均序列長度為438.99，總堿基數(shù)為366 797 133 bp?；赟obs指數(shù)的稀釋曲線分析(圖1)表明，各樣本的稀釋曲線基本趨向平坦，說明本次測(cè)序數(shù)據(jù)量合理，能夠比較真實(shí)地反映土壤樣本的細(xì)菌群落。

2.3 硒砂瓜連作土壤中細(xì)菌的多樣性

對(duì)不同連作年限硒砂瓜土壤中細(xì)菌進(jìn)行Alpha多樣性分析，結(jié)果見表2。結(jié)果表明，T0土壤細(xì)菌多樣性最低，隨著連作年限的增加，硒砂瓜土壤中細(xì)菌多樣性逐漸增加，T20土壤細(xì)菌多樣性最高。硒沙瓜土壤中細(xì)菌多樣性隨著連作年限的增加而增加。

表1 不同連作年限的土壤理化性質(zhì)

注：T0、T5、T10、T15、T20分別指未種植硒砂瓜處理及連作5、10、15、20 a處理，下同。

Note: T0, T5, T10, T15, and T20 refer to the treatment of non-planted selenium-sand melon and continuous cropping for 5, 10, 15 a and 20 a, respectively. The same below.

2.4 硒砂瓜連作土壤細(xì)菌群落組成與結(jié)構(gòu)分析

根據(jù)高通量測(cè)序結(jié)果分析，從5份供試土壤樣本中共檢測(cè)出細(xì)菌39門、98綱、189目、349科、620屬、1195種。在門水平上(圖2)，不同連作年限的硒砂瓜土壤物種組成較為相似，其中放線菌門(Actinobacteria)、變形菌門(Proteobacteria)、綠彎菌門(Chloroflexi)、酸桿菌門(Acidobacteria)相對(duì)豐度超過10%，豐度分別為20.71%～24.14%、17.08%～24.14%、15.82%～18.45%、11.76%～18.83%，是硒砂瓜土壤中的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌群落；此外厚壁菌門(Firmicutes)、芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)、硝化螺旋菌門(Nitrospirae)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、浮霉菌門(Planctomycetes)、unclassified-norank在土壤中相對(duì)豐度大于1%，是土壤中細(xì)菌主要的門。與T0相比，隨連作時(shí)間增加，變形菌門、綠彎菌門豐度呈逐漸下降趨勢(shì)，酸桿菌門豐度呈逐漸增加的趨勢(shì)，且在T15中豐度最高，為18.83%，且T0中變形菌門、T5中放線菌門、T15中酸桿菌門細(xì)菌豐度最高，分別為24.14%、25.97%、18.83%；T0、T10中變形菌門、硝化螺旋菌門細(xì)菌豐度顯著高于其它組份物種豐度(P<0.05)。

在綱水平上(圖3)，土壤樣本中優(yōu)勢(shì)綱分別為放線菌綱(Actinobacteria)、酸桿菌綱(Acidobacteria)、α-變形菌綱(Alphaproteobacteria)、芽單胞菌綱(Gmmatimonadetes)、桿菌綱(Bacilli)、熱原體綱(Thermomi-crobia)、γ-變形菌綱(Gammaproteobacteria)、β-變形菌綱(Betaproteobacteria)。在T5中放線菌綱豐度最高為25.97%，酸桿菌綱隨連作年限增加呈先增加后下降趨勢(shì)，并在T15中豐度達(dá)到18.83%，γ-變形菌綱在T5中豐度最低(5.23%)，在T20中桿菌豐度最高(8.18%)。

注：不同字母表示處理間差異顯著(P<0.05)。Note: Different letters indicate significant difference at P<0.05.圖1 硒砂瓜連作土壤樣本在OTU水平稀釋曲線Fig.1 Rarefaction curves of OTU level in soil samples of selenium-sand melon continuous cropping

表2 不同連作年限硒砂瓜土壤細(xì)菌多樣性指數(shù)和豐富度指數(shù)

在目水平(圖4)，豐度前5的類群分別為norank_c_Acidobacteria、芽孢桿菌目(Bacillales)、芽單胞菌目(Gemmatimonadales)、根瘤菌目(Rhizobiales)、酸微菌目(Acidimicrobiales)。隨連作年限增加，norank_c_Actinobacteria豐度先增加后減少，在T15中豐度為13.97%；芽孢桿菌目在T15中豐度最低(5.08%)，在T20中豐度最高(8.15%)；芽單胞菌目在T10中豐度最高(7.77%)；根瘤菌目在T5中豐度最高(6.64%)；隨連作年限增加，酸微菌目豐度呈下降趨勢(shì)。

圖2 硒砂瓜不同連作年限土壤細(xì)菌群落在門水平相對(duì)豐度Fig.2 Relative abundance of soil bacterial communities at phylum level in different continuous cropping years of selenium-sand melon

圖4 硒砂瓜不同連作年限土壤細(xì)菌群落在目水平相對(duì)豐度Fig.4 Relative abundance of soil bacterial communities at order level in different continuous cropping years of selenium-sand melon

圖5 硒砂瓜不同連作年限土壤細(xì)菌群落在科水平相對(duì)豐度Fig.5 Relative abundance of soil bacterial communities at family level in different continuous cropping years of selenium-sand melon

在科水平(圖5)，豐度前6的類群分別為norank_c_Acidonbacteria、芽單胞菌科(Gemmatimonadaceae)、芽孢桿菌科(Bacillaceae)、norank_c_Actinobacteria、norank_o_JG-KF-CM45、厭氧繩菌科(Anaerolineaceae)。隨連作年限增加，norank_c_Actinobacteria豐度先增加后減少，在T15中豐度為13.97%；芽單胞菌科在T5中豐度最低(4.21%)，在T10中豐度最高(7.77%)；芽孢桿菌科在T10中豐度最高為5.84%，其次是T20(5.80%)，厭氧繩菌科在T0中豐度最高(3.99%)，在T5中豐度最低(1.50%)。

2.5 硒砂瓜連作土壤樣本比較分析

基于細(xì)菌OUT水平主成分分析結(jié)果表明， T10、T15、T20土壤樣本點(diǎn)距離比較近，T5與T15、T20樣本部分距離較近，群落結(jié)構(gòu)相似，而T0土壤樣本單獨(dú)聚在一起，群落結(jié)構(gòu)與其他連作土壤樣本中的群落結(jié)構(gòu)不同，表明長期種植硒砂瓜后，土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)會(huì)趨于一致性(圖6)。

圖6 硒砂瓜不同連作年限土壤細(xì)菌基于OTU水平的PCA分析Fig.6 PCA analysis of soil bacterial based on OTU level in different continuous cropping years of selenium-sand melon

2.6 土壤理化性質(zhì)與細(xì)菌群落的相關(guān)性

對(duì)土壤細(xì)菌群落與土壤理化因子進(jìn)行冗余分析(RDA)，結(jié)果如圖7所示。有機(jī)質(zhì)、速效磷是硒砂瓜連作土壤細(xì)菌群落組成的主要影響因子。

對(duì)不同連作年限硒砂瓜土壤細(xì)菌群落組成(綱水平)與土壤理化因子間相互關(guān)系分析發(fā)現(xiàn)，放線菌綱與土壤理化性質(zhì)無顯著相關(guān)性(P>0.05)，酸桿菌綱與有機(jī)質(zhì)含量呈極顯著正相關(guān)(P<0.01)，α-變形菌綱與速效磷含量呈極顯著正相關(guān)(P<0.01)，芽單胞菌綱與全磷含量呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.01)，桿菌與有機(jī)質(zhì)含量呈極顯著負(fù)相關(guān)(P<0.01)，熱原體綱與全磷、堿解氮含量呈顯著正相關(guān)(P<0.05)，與全鉀含量呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)(表3)。

圖7 土壤細(xì)菌群落與土壤理化因子的RDA分析Fig.7 RDA analysis of soil bacterial communities and soil physicochemical properties

表3 土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與土壤理化性質(zhì)的相關(guān)性

注：**P<0.01; *P< 0.05.

3 討 論

硒砂瓜是寧夏地區(qū)特有的經(jīng)濟(jì)作物，但連作障礙對(duì)硒沙瓜產(chǎn)量和品質(zhì)造成嚴(yán)重影響，是目前亟待解決的問題[17]。連作障礙發(fā)生的原因主要有土壤營養(yǎng)失衡、土壤理化性質(zhì)惡化、土壤微生物群落結(jié)構(gòu)失衡等。Xu等[18]研究黃連連作發(fā)現(xiàn)，隨著連作時(shí)間的增加，堿解氮、速效磷和速效鉀含量都出現(xiàn)增加的趨勢(shì)，與本研究中T5～T20土壤有機(jī)質(zhì)、全氮、速效鉀、全磷含量均增加的結(jié)果相似，硒砂瓜連作障礙并不是由于土壤理化性質(zhì)的改變所導(dǎo)致。

土壤微生物對(duì)作物的健康生長起著重要作用，有益微生物能增加土壤肥力、改善根際土壤環(huán)境、促進(jìn)根系的生長和防治植物病害等[19]。越來越多的研究表明，連作障礙與作物根際土壤微生物密切相關(guān)[20]。龔治翔等[21]研究表明，造成連作障礙的主要原因是由于土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的改變；朱菲瑩等[22]研究結(jié)果顯示，根際土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)是影響西瓜枯萎病發(fā)生的主要環(huán)境因子。

本研究結(jié)果表明，不同連作年限硒砂瓜土壤細(xì)菌優(yōu)勢(shì)群落主要為放線菌門、變形菌門、綠彎菌門、酸桿菌門、厚壁菌門，這與香榧、棉花、苧麻等的相關(guān)研究結(jié)果[23-25]相似。其中放線菌門隨著連作時(shí)間的增加，會(huì)出現(xiàn)先增加后下降的趨勢(shì)，在T5中豐度最高(圖2)，放線菌門大多數(shù)微生物主要降解纖維素甚至許多難降解的芳香族化合物，對(duì)于土壤的礦化作用起十分重要的作用[26]。70%抗生素來源于放線菌，其產(chǎn)生的抗生素及其代謝產(chǎn)物對(duì)動(dòng)物植物等都具有重要作用[27]?？赏茰y(cè)放線菌門在作物的連作過程中會(huì)抑制病原菌的侵害，其對(duì)長期連作土壤土傳病害有一定的防治能力。變形菌門和放線菌門都是土壤中有益的菌門，參與各種有機(jī)物碳氮循環(huán)，如固氮菌，對(duì)作物在土壤中氮的吸收有一定的作用。綠彎菌門是一種能通過光合作用并以CO2為碳源產(chǎn)生能量的微生物，在有機(jī)質(zhì)等營養(yǎng)含量低的土壤中也有較強(qiáng)的競(jìng)爭(zhēng)力，而硒砂瓜種植于干旱的沙漠地區(qū)，壓砂種植，日照充足，土壤貧瘠，因此，綠彎菌門可能對(duì)硒砂瓜的生長具有重要作用。酸桿菌門是土壤微生物的重要成員，能降解植物殘?bào)w、進(jìn)行光合作用、參與碳化合物代謝等，在土壤物質(zhì)循環(huán)和生態(tài)環(huán)境構(gòu)建過程中起到非常重要的作用[28]。聶園軍等[29]研究表明，隨著連作時(shí)間的增加，西瓜土壤中有益微生物的降低而病原菌所在的鐮刀菌屬(Fusarium)相對(duì)豐度增加，造成西瓜枯萎病的發(fā)生。本研究中，隨著連作時(shí)間的增加，放線菌門、變形菌門、綠彎菌門豐度逐漸下降，可推測(cè)其有益菌豐度的降低，使得土壤抵抗性差，土壤中病原菌數(shù)量增加，從而造成連作障礙。

在目水平上，芽孢桿菌目、芽單胞菌目、根瘤菌目是硒砂瓜土壤中的優(yōu)勢(shì)類群。研究表明，絕大多數(shù)芽孢桿菌都是有益菌，對(duì)植物病原菌的防治具有重要價(jià)值[30]，李丹等[31]研究表明，解淀粉芽胞桿菌對(duì)西瓜枯萎病有較強(qiáng)的防治作用，岳菊[32]篩選的枯草芽孢桿菌對(duì)西瓜枯萎病的防效達(dá) 80.4%。本試驗(yàn)結(jié)果表明，隨著連作時(shí)間的增加，芽孢桿菌目豐度呈現(xiàn)先增后降再升的趨勢(shì)，在T15土壤中豐度最低，在T20土壤中豐度最高，可能是由于隨著連作時(shí)間的增加，病原菌數(shù)量增加，導(dǎo)致芽孢桿菌目中有益菌數(shù)量減少；芽孢桿菌目在T20土壤中豐度增加，可能是由于長時(shí)間的連作使得土壤中細(xì)菌菌群變化較大，因?yàn)殚L期連作擾亂了細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致細(xì)菌群落增多[21,33]，同時(shí)，這也與本研究中不同連作年限土壤細(xì)菌多樣性增加的結(jié)果一致。

4 結(jié) 論

不同連作年限硒砂瓜土壤理化性質(zhì)變化不顯著，硒沙瓜連作障礙的產(chǎn)生不是由于土壤理化性質(zhì)的變化引起的，而是由于土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的變化所導(dǎo)致的。隨著連作時(shí)間的增加，細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，細(xì)菌群落增多，連作土壤中細(xì)菌群落多樣性增加。在群落結(jié)構(gòu)上，放線菌門、變形菌門、綠彎菌門、酸桿菌門、厚壁菌門等有益微生物豐度的下降，造成連作障礙的產(chǎn)生。研究結(jié)果對(duì)于采用合理有效的方法改善土壤連作障礙具有重要意義。