王 慧，董 瑩

(1.貴陽(yáng)學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550005;2.東營(yíng)市農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，山東 東營(yíng) 257091)

紅楓湖位于貴州省貴陽(yáng)市平壩縣，是日常生活用水的重要來(lái)源之一，與阿哈水庫(kù)，百花湖并稱(chēng)為“兩湖一庫(kù)”，是貴陽(yáng)市重要的飲用水水源。紅楓湖的微生物種類(lèi)及分布可作為檢測(cè)水質(zhì)的重要指標(biāo)之一，通過(guò)前期研究，在不同時(shí)間采集紅楓湖水體取樣，對(duì)水體中真菌進(jìn)行分離培養(yǎng)，通過(guò)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，得出真菌的優(yōu)勢(shì)菌屬分別是半知菌亞門(mén)鏈格孢屬(Alternariaspp.)，曲霉屬(Aspergillusspp.)，青霉屬(Penicilliumspp.)，擔(dān)子菌亞門(mén)耙齒菌屬(Irpexspp.)[1]?，F(xiàn)將出現(xiàn)頻率較高，且具有研究意義的真菌進(jìn)行小鼠毒力測(cè)定，為水體評(píng)價(jià)提供一定的理論依據(jù)[2-3]。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

于貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院和貴州大學(xué)動(dòng)科院購(gòu)買(mǎi)體重17-20g的清潔級(jí)健康小白鼠，試驗(yàn)前先喂養(yǎng)觀(guān)察一周，試驗(yàn)期間飼喂貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院提供的小鼠專(zhuān)用飼料，自由飲水，在整個(gè)試驗(yàn)周期內(nèi)定期將試驗(yàn)場(chǎng)地、籠具與水具消毒，通風(fēng)良好，定期打掃，讓其適應(yīng)新的環(huán)境，準(zhǔn)備用于試驗(yàn)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌液配制

取分離純化好的菌株，用無(wú)菌手術(shù)刀把平板表面的孢子刮入帶玻璃珠的無(wú)菌水中，混勻后，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，配制成1×105、1×107、1×109個(gè)/mL。對(duì)于不產(chǎn)孢的真菌，刮取菌絲后，脫水，稱(chēng)重，配制成1×10-5、1×10-3、1×10-1g/mL。

1.2.2 毒力測(cè)定方法

試驗(yàn)采用灌胃給藥的方法進(jìn)行小白鼠染毒。灌藥前先稱(chēng)量每只小鼠的重量，根據(jù)體重灌胃給藥。嚴(yán)格遵照每只小鼠灌胃量不得大于0.2mL/10g，灌藥前禁食4h，只供給充足的清潔飲水。

1.2.3 試驗(yàn)動(dòng)物與試驗(yàn)設(shè)計(jì)

選用17-20g的清潔級(jí)小鼠共50只，其中雌鼠25只，雄鼠25只，任意挑選雌雄小鼠各5只放在一組，飼養(yǎng)條件一致。第一組為對(duì)照組，其余5組在第一周連續(xù)七天染毒，1次/天，試驗(yàn)周期為3周，試驗(yàn)一周，觀(guān)察2周。采用灌胃的方式，采用等容蒸餾水處理作為對(duì)照，同時(shí)每7d稱(chēng)重記錄一次。在第7d、14d、21d剖殺作定期檢測(cè)觀(guān)察，一個(gè)時(shí)間點(diǎn)剖殺2只小鼠，雌雄各一只。

1.2.4 檢測(cè)指標(biāo)與測(cè)定方法

試驗(yàn)期間每日灌胃后密切觀(guān)察試驗(yàn)小鼠對(duì)毒性反應(yīng)，包括小鼠精神、食欲、飲水、活動(dòng)、皮毛等病理變化及其出現(xiàn)的時(shí)間、死亡數(shù)、死亡時(shí)間、死亡率、中毒劑量，并做好標(biāo)記。仔細(xì)觀(guān)察各試驗(yàn)組小鼠的采食、飲水和生長(zhǎng)發(fā)育情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 未導(dǎo)致小鼠發(fā)病的菌種

灌食耙齒菌屬(Irpespp.)真菌臨床癥狀及病理剖檢變化：試驗(yàn)組小鼠并無(wú)食欲減退，形體消瘦，精神萎靡等癥狀。剖檢后內(nèi)臟均正常。在喂食耙齒菌屬菌液后，對(duì)小鼠無(wú)任何毒性和危害。

表1 喂食耙齒菌屬(Irpex spp.)菌液后小鼠變化

2.2 菌液處理小鼠發(fā)病較輕菌種

2.2.1 鏈格孢屬(Alternariaspp.)測(cè)定結(jié)果

臨床癥狀及病理剖檢變化：試驗(yàn)組小白鼠并無(wú)食欲減退，形體消瘦，精神萎靡等癥狀。剖檢可見(jiàn)胸腺腫大，109個(gè)/mL濃度組中出現(xiàn)了脾臟表面不光滑，增大。在喂食鏈格孢屬的菌液后，三個(gè)濃度組出現(xiàn)了不同程度的發(fā)病率，在第二三周，停止灌胃菌液后，身體開(kāi)始自愈。在重量變化方面，三組濃度組與對(duì)照組并無(wú)太大差異。

表2 喂食鏈格孢屬(Alternaria spp. )菌液后小鼠變化

2.2.2 小光殼屬(Leptosphaerulinaspp.)測(cè)定結(jié)果

臨床癥狀及病理剖檢變化：試驗(yàn)組小白鼠并無(wú)食欲減退，形體消瘦，精神萎靡等癥狀。剖檢可見(jiàn)107個(gè)/mL和109個(gè)/mL濃度組均出現(xiàn)胸腺腫大，109個(gè)/ml濃度組中出現(xiàn)了脾臟表面不光滑，增大。在喂食小光殼屬(leptosphaerulinaspp.)的菌液后，105個(gè)/mL濃度組未出現(xiàn)發(fā)病率，107個(gè)/mL濃度組出現(xiàn)了胸腺腫大的癥狀，109個(gè)/mL濃度組在第一周灌胃菌液時(shí)出現(xiàn)了胸腺腫大和脾臟表面不光滑，增大。以上三組均未出現(xiàn)死亡率。三組濃度組與對(duì)照組重量并無(wú)顯著差異。

表3 喂食小光殼屬(leptosphaerulina spp.)菌液后小鼠變化

2.2.3 小球腔菌屬(Leptosphaeriaspp.)測(cè)定結(jié)果

臨床癥狀及病理剖檢變化：試驗(yàn)組小白鼠并無(wú)食欲減退，形體消瘦，精神萎靡等癥狀。剖檢可見(jiàn)三個(gè)濃度組均出現(xiàn)胸腺腫大，無(wú)其他癥狀。在喂食小球腔菌屬菌液后，10-5g/mL濃度組和10-3g/mL濃度組癥狀相同，均出現(xiàn)了胸腺腫大的情況，但在停止灌胃菌液之后，第三周自愈。10-1g/mL濃度組從開(kāi)始灌胃菌液出現(xiàn)胸腺腫大，一直持續(xù)病癥。以上三組均未出現(xiàn)死亡率。三組濃度組與對(duì)照組重量并無(wú)顯著差異。

表4 喂食小球腔菌屬(Leptosphaeria spp.)菌液后小鼠變化

3 討論

通過(guò)小白鼠試驗(yàn)，5種優(yōu)勢(shì)真菌均未出現(xiàn)死亡率，臨床癥狀局限在胸腺腫大，脾臟增大，脾臟和肝臟表面不光滑，食欲下降等。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，以上均為免疫器官發(fā)生防御反應(yīng)，而且大部分在停止灌胃試驗(yàn)后，能夠自愈[4-6]，免疫響應(yīng)機(jī)制有待下一步深入研究，其他器官、外部特征和行為并未出現(xiàn)病癥。而耙齒菌屬中模式種白囊耙齒菌，是一種要用真菌，其多糖具有很好的抗菌、消炎、利尿、抗疲勞等功能，同時(shí)在治理環(huán)境方面具有顯著的優(yōu)勢(shì)，在廢水處理中起到積極的作用[7]。本研究灌胃菌液的濃度遠(yuǎn)高于飲用水的帶菌濃度，且高濃度下小鼠部分只產(chǎn)生了免疫響應(yīng)，耙齒菌屬真菌且具有多種對(duì)人體有益功能，綜合分析，紅楓湖水體優(yōu)勢(shì)真菌對(duì)水質(zhì)未產(chǎn)生消極作用。

4 結(jié)論

紅楓湖水體耙齒菌屬真菌未對(duì)小鼠產(chǎn)生任何刺激反應(yīng)，鏈格孢屬，小光殼屬，小球腔菌屬引起小鼠免疫反應(yīng)。4種優(yōu)勢(shì)真菌對(duì)小鼠無(wú)毒性刺激，對(duì)水質(zhì)未產(chǎn)生消極作用。