沙如意 張沙沙 余 瞻 趙福權(quán) 蔡成崗,3,4 肖竹錢,3,4 毛建衛(wèi),3,4

(1. 浙江科技學(xué)院生物與化學(xué)工程學(xué)院 杭州310023； 2. 浙江省廢棄生物質(zhì)循環(huán)利用與生態(tài)處理技術(shù)重點實驗室 杭州310023； 3. 浙江省農(nóng)產(chǎn)品化學(xué)與生物加工技術(shù)重點實驗室 杭州310023； 4. 浙江省農(nóng)業(yè)生物資源生化制造協(xié)同創(chuàng)新中心 杭州310023)

資源是經(jīng)濟(jì)和社會可持續(xù)發(fā)展的重要物質(zhì)基礎(chǔ)。隨著世界各國對資源需求的不斷增長以及對環(huán)境保護(hù)的日益重視，開發(fā)和研究可再生資源代替被過度開采和使用的不可再生資源，已成為各國在資源利用方面共同的發(fā)展方向。以木材和草類纖維為代表的木質(zhì)纖維素類生物質(zhì)是地球上最豐富的可再生資源，年產(chǎn)量約2 000億t，有效利用木質(zhì)纖維素類生物質(zhì)可以降低人類對化石燃料資源的依賴(Zhang， 2008)。木質(zhì)纖維原料主要由纖維素(38%～50%)、半纖維素(23%～32%)、木質(zhì)素(10%～25%)以及少量的果膠、蛋白質(zhì)和灰分等組成，為提高木質(zhì)纖維素類生物質(zhì)的轉(zhuǎn)化率，提升纖維素酶的水解效率和可發(fā)酵性糖產(chǎn)量，降低纖維素酶的使用量和生物質(zhì)轉(zhuǎn)化成本，需對木質(zhì)纖維素類生物質(zhì)進(jìn)行預(yù)處理，以打斷木質(zhì)素、纖維素、半纖維素之間的天然抗降解屏障，釋放出包裹在內(nèi)部的纖維素組分，提高纖維素酶的可及性(Puetal., 2013)。

木質(zhì)纖維素類生物質(zhì)預(yù)處理主要有物理法、化學(xué)法、物理化學(xué)法和生物法，其中應(yīng)用較多的是采用質(zhì)量分?jǐn)?shù)小于4%的稀酸法(如鹽酸、硫酸和硝酸等，120～210 ℃)、高溫?zé)崴?、蒸汽爆破法和液相水熱法?Yangetal.， 2006； Kumaretal.， 2009)。不同預(yù)處理方法可溶解和去除原料中的木質(zhì)素或大部分半纖維素等，有利于提高纖維素酶的可及性。木質(zhì)素對纖維素酶解具有明顯抑制作用，通過預(yù)處理降低木質(zhì)素含量有利于提高纖維素酶解效率。研究表明，利用稀酸和高溫?zé)崴葎×曳绞綄δ举|(zhì)纖維進(jìn)行預(yù)處理后，Klason木質(zhì)素相對含量反而會增加，預(yù)處理過程中沉積的假木質(zhì)素比木質(zhì)素更加明顯地抑制木質(zhì)纖維素類生物質(zhì)轉(zhuǎn)化(Mengetal.， 2017)。通常，將生物質(zhì)預(yù)處理過程中生物質(zhì)碳水化合物的脫水或聚合產(chǎn)物形成的酸不溶性物質(zhì)稱為“假木質(zhì)素”(pseudo-lignin)，假木質(zhì)素是一種芳香族類化合物，并非來自于生物質(zhì)中的天然木質(zhì)素，可以球狀等形式沉積在預(yù)處理后的生物質(zhì)細(xì)胞壁表面和內(nèi)部，導(dǎo)致Klason木質(zhì)素含量增加(Sannigrahietal.， 2011)。本研究綜述木質(zhì)素液滴和假木質(zhì)素沉積對纖維素酶解的影響，以期為構(gòu)建高效的木質(zhì)纖維素類生物質(zhì)轉(zhuǎn)化路徑提供科學(xué)指導(dǎo)。

1 木質(zhì)素液滴和假木質(zhì)素沉積的形成

1.1 木質(zhì)素液滴沉積的形成

木質(zhì)纖維類生物質(zhì)預(yù)處理過程中，木質(zhì)素會以液滴形式沉積于纖維素表面(表1)。稀酸預(yù)處理可導(dǎo)致木質(zhì)素液滴無序排列于細(xì)胞壁外部邊界，在強(qiáng)酸或高溫條件下更容易觀察到木質(zhì)素的重新定位和再分布。利用稀酸對玉米(Zeamays)秸稈(Donohoeetal.， 2008)、甘蔗(Saccharumofficinarum)渣(Colettaetal.， 2013)、玉米莖(Seligetal.， 2007)、竹子(Phyllostachys)(林玲等， 2014)等木質(zhì)纖維進(jìn)行預(yù)處理時，木質(zhì)素會易位、重新分布，形成不同形態(tài)的木質(zhì)素液滴(Pingalietal.， 2010； Holopainen-Mantilaetal.， 2013； Liu， 2015)，覆蓋在細(xì)胞壁表面阻止酶進(jìn)一步接近細(xì)胞壁組分，從而降低纖維素酶的可及性(Colettaetal.， 2013)。木質(zhì)纖維水熱預(yù)處理過程中也會產(chǎn)生木質(zhì)素液滴，Kristensen等(2008)借助原子力顯微技術(shù)，在水熱處理小麥(Triticumaestivum)秸稈時觀察到處理后的細(xì)胞表面出現(xiàn)類似于稀酸預(yù)處理時的木質(zhì)素球狀顆粒，Demartini等(2011)利用選擇性單克隆抗體免疫標(biāo)記技術(shù)觀察到水熱預(yù)處理楊樹(Populus)表面的木質(zhì)素液滴，Li等(2014a)進(jìn)一步利用掃描電子顯微鏡和濕化學(xué)分析研究高溫?zé)崴A(yù)處理后的微晶纖維素和楊木混合物，發(fā)現(xiàn)來源于楊木的木質(zhì)素液滴會遷移到纖維素表面，證實在劇烈預(yù)處理條件下更加容易形成木質(zhì)素液滴的沉積。

表1 不同原料在不同預(yù)處理條件下的木質(zhì)素液滴Tab.1 Lignin droplets of different raw materials under different pretreatment conditions

續(xù)表1

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對于木質(zhì)素液滴形成機(jī)制，一般認(rèn)為木質(zhì)素聚集體起初存在于預(yù)處理材料中，后隨著預(yù)處理溫度增加，木質(zhì)素達(dá)到相轉(zhuǎn)變溫度(120～200 ℃)，分子鏈微布朗運動加快，木質(zhì)素軟化呈熔融狀態(tài)，具有一定流動性，進(jìn)而在細(xì)胞腔和胞間層基質(zhì)內(nèi)聚結(jié)形成液滴(Donohoeetal.， 2008; Seligetal.， 2007; 林玲等， 2014)。此外，由于木質(zhì)素具有疏水性，表面張力較高，細(xì)胞壁層內(nèi)的靜水壓力會迫使一部分木質(zhì)素遷移到外表面，進(jìn)而與稀酸預(yù)處理后的物料接觸并重新沉積于植物細(xì)胞壁表面(Holopainen-Mantilaetal.， 2013)。

1.2 假木質(zhì)素的沉積及結(jié)構(gòu)表征

1.2.1 假木質(zhì)素的沉積 稀酸可有效水解半纖維素，破壞木質(zhì)素和半纖維素間的結(jié)構(gòu)，提高纖維素酶的可及性，普遍應(yīng)用于硬木、軟木、草類、農(nóng)業(yè)廢棄物和報紙等生物質(zhì)預(yù)處理中。以往研究認(rèn)為，通常情況下稀酸預(yù)處理對木質(zhì)素含量影響不大，如Cao等(2012)在170 ℃下利用稀酸對毛果楊(Populustrichocarpa)預(yù)處理0.3～26.8 min，結(jié)果發(fā)現(xiàn)木質(zhì)素含量(24.4%～25.9%)與未處理(24.6%)相似。然而，最近越來越多的研究表明，在不添加有機(jī)溶劑的條件下，僅利用稀酸常常不能有效去除木質(zhì)素或顯著降低木質(zhì)素含量，相反還會導(dǎo)致木質(zhì)素相對含量增加(Mengetal.， 2017)，如表2所示。

表2 不同原料預(yù)處理后的木質(zhì)素含量變化①Tab.2 Changes of lignin content of different raw materials after pretreatment

續(xù)表2

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①總纖維含量為纖維素和半纖維素含量之和；木質(zhì)素含量為酸不溶性和可溶性木質(zhì)素含量之和。The total fiber content is the sum of cellulose and hemicellulose；The lignin content is the sum of acid insoluble and soluble lignin content.

Mao等(2010)在140～180 ℃條件下利用稀酸處理玉米秸桿，結(jié)果木質(zhì)素含量增加2%～6%。Foston等(2010)在高溫條件下利用稀酸處理楊木，發(fā)現(xiàn)Klason木質(zhì)素含量從25%增加到40%。類似地，Samuel等(2010)在190 ℃下利用稀酸預(yù)處理柳枝稷(Panicumvirgatum)1 min，木質(zhì)素含量增加10%。Hashmi等(2017)利用自水解預(yù)處理甘蔗渣，發(fā)現(xiàn)溫度從110 ℃增加至190 ℃，總木質(zhì)素含量從30.9%增加至41.8%，相應(yīng)地，木聚糖含量從18.9%降至8.2%。相似地，Hao等(2017)在175 ℃、8.5×105～10.0×105Pa條件下對松木(Pinus)進(jìn)行自水解預(yù)處理并保持85 min，預(yù)處理后半纖維素類單糖含量顯著下降，葡聚糖從39.88%增加至42.54%，而酸不溶性木質(zhì)素含量由32.06%增加至46.11%。經(jīng)過劇烈條件自水解預(yù)處理后，木質(zhì)素含量增加可能歸因于大量半纖維素去除而保留大部分木質(zhì)素所致，也可能與形成假木質(zhì)素有關(guān)。不僅僅稀酸預(yù)處理可以導(dǎo)致木質(zhì)素含量增加，楊雪霞等(2001)利用氣爆對玉米秸稈進(jìn)行氨化預(yù)處理，也發(fā)現(xiàn)木質(zhì)素含量增加的現(xiàn)象。這其中一部分原因可能是預(yù)處理過程中以半纖維素為代表的糖類化合物的損失，木聚糖含量下降，導(dǎo)致得到的酸不溶性木質(zhì)素含量比未處理前反而增加(林玲等， 2014； Singhetal.， 2015； Normarketal.， 2016； Brazdausksetal.， 2016)； 然而Sannigrahi等(2011)則認(rèn)為預(yù)處理后木質(zhì)素含量增加與生物質(zhì)中碳水化合物脫水和聚合形成的酸不溶性物質(zhì)——假木質(zhì)素有關(guān)，其利用稀酸處理楊木綜纖維素時，發(fā)現(xiàn)具有球形結(jié)構(gòu)的假木質(zhì)素沉積于稀酸處理后的生物質(zhì)細(xì)胞壁表面。

Normark等(2016)在嚴(yán)峻烘焙條件下(310 ℃，25 min)處理挪威云杉，也發(fā)現(xiàn)假木質(zhì)素的沉積現(xiàn)象。利用不同酸對木質(zhì)纖維進(jìn)行預(yù)處理也會生成不同含量的假木質(zhì)素，如磷酸預(yù)處理比硝酸預(yù)處理可能產(chǎn)生較少量的假木質(zhì)素(Boonsombutietal.， 2015)。此外，高溫?zé)崴?Koetal.， 2015)、氯化鋁水熱催化(Shenetal.， 2016)、高壓熱水(Yangetal.， 2015)、自水解(Sipponenetal.， 2014a)、加壓熱水(Leeetal.， 2017)等預(yù)處理木質(zhì)纖維也觀察到假木質(zhì)素沉積。本研究分別利用硫酸和植酸溶液對毛竹(Phyllostachysedulis)粉進(jìn)行高溫預(yù)處理(121 ℃、60 min)，可看到橢球形的沉積物形成于纖維素表面(圖1箭頭所示)。酸不溶性木質(zhì)素-假木質(zhì)素的增加可能與生物質(zhì)多糖降解產(chǎn)物和木質(zhì)素聚合、重構(gòu)形成的假木質(zhì)素有關(guān)(Puetal.， 2013； Sunetal.， 2014)。Wang等(2017)利用水熱法與強(qiáng)氫氧化鈉相結(jié)合預(yù)處理桉樹(Eucalyptus)，預(yù)處理溫度從180 ℃增加至200 ℃，木質(zhì)素得率從5.1%增加至7.5%，相應(yīng)地，總糖從0.16%下降至0.10%，其認(rèn)為在此溫度范圍內(nèi)木質(zhì)素與半纖維素間的鍵斷裂，導(dǎo)致木質(zhì)素遷移，以濃縮木質(zhì)素液滴的形式存在于細(xì)胞壁上，從而有利于后期堿的提取。此外，也可能是形成假木質(zhì)素所致，這是因為Wang等(2017)將溫度繼續(xù)增加至210 ℃，木質(zhì)素含量降至2.7%，而總糖含量僅為0.03%，更加可能是在此劇烈預(yù)處理條件下，碳水化合物和木質(zhì)素降解產(chǎn)物形成假木質(zhì)素。假木質(zhì)素沉積的形成一定程度上解釋了稀酸處理后的生物質(zhì)中觀察到更高含量木質(zhì)素，且假木質(zhì)素含量隨著預(yù)處理嚴(yán)重程度增加而急劇增加(Kumaretal.， 2013； Sipponenetal.， 2014b)。

圖1 不同稀酸預(yù)處理的毛竹表面Fig.1 Scanning electron microscopy of bamboo surface with different dilute acid pretreatmenta. 硫酸Sulfuric acid(2 000×)； b. 植酸Phytic acid(5 000×).

1.2.2 假木質(zhì)素形成機(jī)制 許多研究者在生物質(zhì)預(yù)處理過程中都觀察到了假木質(zhì)素沉積，但由于假木質(zhì)素的結(jié)構(gòu)和形成條件的復(fù)雜性，對于假木質(zhì)素具體形成機(jī)制還尚未有定論。

對假木質(zhì)素結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，其中含有大量不飽和碳原子，說明在生物質(zhì)酸預(yù)處理過程中碳水化合物水解成相應(yīng)的單糖，繼而發(fā)生脫水反應(yīng)和分解反應(yīng)(Mengetal.， 2017)。表3歸納了不同預(yù)處理條件下假木質(zhì)素的形成。在Li等(2005； 2007)的研究中，其推測認(rèn)為多糖的降解產(chǎn)物(如糠醛)可能與木質(zhì)素聚合形成木質(zhì)素的類似物——假木質(zhì)素，該現(xiàn)象可歸因于在稀酸條件下，伴隨著木質(zhì)纖維預(yù)處理過程中多糖的損失，通過酸催化脫水反應(yīng)，木糖和葡萄糖可分別形成糠醛和5-羥甲基糠醛(HMF)。進(jìn)一步地，糠醛和/或HMF經(jīng)重排可以產(chǎn)生芳族化合物，可能作為假木質(zhì)素形成的中間產(chǎn)物，如木質(zhì)素酸降解的主要產(chǎn)物為3,8-2-羥基-甲色酮，5-羥甲基糠醛(HMF)經(jīng)水解開環(huán)反應(yīng)可以生成1,2,4-苯三醇(BTO)等中間產(chǎn)物，這些中間產(chǎn)物經(jīng)過聚合和/或縮聚反應(yīng)最后形成假木質(zhì)素(Mengetal.， 2017； Huetal.， 2012)。然而，假木質(zhì)素的形成量與生物質(zhì)本體中的木質(zhì)素含量并無太大關(guān)聯(lián)性，Sannigrahi等(2011)認(rèn)為，在稀酸預(yù)處理過程中，假木質(zhì)素可由生物質(zhì)中的碳水化合物轉(zhuǎn)變而成，而木質(zhì)素的貢獻(xiàn)率不明顯。

另一方面，假木質(zhì)素的形成具有溫度相關(guān)性，當(dāng)前大部分研究集中于加熱預(yù)處理過程后假木質(zhì)素的形成情況，事實上當(dāng)預(yù)處理結(jié)束后，隨著反應(yīng)溫度降低，溶解在水解液中的木質(zhì)素或其類似物也可能重新沉積到生物質(zhì)表面，這也可能是在木質(zhì)纖維預(yù)處理過程中假木質(zhì)素沉積的原因之一。在生物質(zhì)預(yù)處理過程中存在著多種形態(tài)的假木質(zhì)素，取決于預(yù)處理溫度條件。Yang等(2015)發(fā)現(xiàn)預(yù)處理溫度達(dá)到180 ℃，能夠觀察到游離的微球狀假木質(zhì)素，溫度高于200 ℃或低于120 ℃，則觀察不到游離假木質(zhì)素，而吸附型的假木質(zhì)素在較廣的溫度范圍內(nèi)都比較容易形成。同樣地，最近有研究表明，在預(yù)處理溫度下收集到的木材樣品中并未檢測到假木質(zhì)素存在，從而證實假木質(zhì)素是在冷卻過程中產(chǎn)生的。這就要求預(yù)處理后需要及時將生物質(zhì)與水解液分離開，以降低冷卻誘導(dǎo)假木質(zhì)素的形成。通過對水解液進(jìn)行分析，Zhuang等(2017)發(fā)現(xiàn)解聚的木質(zhì)素和呋喃分別占假木質(zhì)素組成的80.4%和10.6%，而碳水化合物水解得到的可溶性糖與冷卻誘導(dǎo)的假木質(zhì)素形成無關(guān)。這一發(fā)現(xiàn)與Sannigrahi等(2011)研究結(jié)論不一致，可能與預(yù)處理生物質(zhì)的結(jié)構(gòu)、預(yù)處理方式和操作條件等因素有關(guān)。由此可見，假木質(zhì)素的形成非常復(fù)雜，對于木質(zhì)素具體形成機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究和證實。

表3 不同原料預(yù)處理后形成的假木質(zhì)素Tab.3 Pseudo-lignin formation after pretreatment with different raw materials

續(xù)表3

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為進(jìn)一步研究假木質(zhì)素的形成機(jī)制，基于稀酸水解預(yù)處理和蒸汽爆破預(yù)處理的相似性，Lam等(2009)結(jié)合稀酸水解中木聚糖的解聚一級反應(yīng)動力學(xué)模型及醋酸中木質(zhì)素溶解和縮合反應(yīng)一級動力學(xué)模型，引入包括糠醛和木質(zhì)素聚合在內(nèi)的旁路反應(yīng)，提出蒸汽爆破過程中假木質(zhì)素形成預(yù)測模型能夠比較準(zhǔn)確地模擬試驗數(shù)據(jù)。但是將此模型用于不同來源的原料和預(yù)處理工藝條件下的假木質(zhì)素形成過程還需要進(jìn)一步完善，如酸催化的歧化機(jī)制也可能伴隨著假木質(zhì)素的形成(Fanetal., 2012)。高溫和酸是假木質(zhì)素形成的關(guān)鍵因素，理解假木質(zhì)素形成機(jī)制，有利于在生物質(zhì)預(yù)處理過程中調(diào)控假木質(zhì)素的沉積，從而有利于提高纖維素酶解效率。

盡管目前已有大量關(guān)于假木質(zhì)素形成機(jī)制的研究，但是假木質(zhì)素結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性和多樣性、形成條件的不確定性、反應(yīng)體系的異質(zhì)性以及多相催化的復(fù)雜性使得假木質(zhì)素的形成機(jī)制尚無定論?？梢酝茰y的是，假木質(zhì)素結(jié)構(gòu)中存在高含量的不飽和碳，這表明在稀酸、高溫?zé)崴?、蒸汽爆破等預(yù)處理過程中，纖維素和半纖維素分解成相應(yīng)的單糖，單糖組分在劇烈預(yù)處理環(huán)境下可能經(jīng)過解聚、分子重排、聚合等化學(xué)反應(yīng)形成假木質(zhì)素的中間產(chǎn)物，進(jìn)而形成假木質(zhì)素，至于木質(zhì)纖維本體中的木質(zhì)素在假木質(zhì)素形成過程中所起的作用還需要進(jìn)一步研究。在不同原料和預(yù)處理條件下，會出現(xiàn)不同形態(tài)的假木質(zhì)素，未來研究應(yīng)重視不同形態(tài)的假木質(zhì)素形成機(jī)制研究，可以通過構(gòu)建化學(xué)反應(yīng)數(shù)學(xué)模型、借助于人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型及先進(jìn)的深度學(xué)習(xí)算法等進(jìn)行假木質(zhì)素形成過程動力學(xué)的模擬和預(yù)測，從而全面揭示假木質(zhì)素的形成機(jī)制。

Donohoe等(2008)利用掃描電鏡(SEM)和透射電鏡(TEM)研究稀酸預(yù)處理玉米秸稈表皮組織過程中生物質(zhì)組分溶解規(guī)律，發(fā)現(xiàn)木質(zhì)素以球狀顆粒形式分布于胞間層、紋孔及細(xì)胞次生壁各個亞層，且這些球狀顆粒通過紋孔區(qū)域被擠出到細(xì)胞壁表面。采用共聚焦熒光顯微技術(shù)結(jié)合免疫熒光標(biāo)記觀察稀酸預(yù)處理前后玉米莖部組織木聚糖分布規(guī)律的變化，發(fā)現(xiàn)在厚壁細(xì)胞次生壁中層、次生壁內(nèi)層與胞間層區(qū)域，木聚糖的熒光信號隨處理時間變化同步增減，這為預(yù)處理過程中木質(zhì)素的遷移和重分布假設(shè)提供了重要依據(jù)(Bruneckyetal.， 2009)。Chu等(2010)利用堿預(yù)處理芒草(Miscanthus)，采用顯微共聚焦拉曼光譜成像(CRM)觀察到薄壁細(xì)胞壁中木質(zhì)素和纖維素共存，同時木質(zhì)素-半纖維素復(fù)合物在細(xì)胞壁內(nèi)部呈現(xiàn)球狀結(jié)構(gòu)。Sannigrahi等(2011)利用掃描電鏡觀察到稀酸預(yù)處理綜纖維素表面沉積有球狀顆粒，采用紅外光譜和核磁共振譜證實球狀顆粒是由碳水化合物和木質(zhì)素降解產(chǎn)物組成的假木質(zhì)素。利用共聚焦和熒光壽命成像顯微鏡，Coletta等(2013)觀察到稀酸預(yù)處理甘蔗渣后木質(zhì)素球狀顆粒沉積于細(xì)胞壁的外部邊界。林玲等(2014)利用環(huán)境掃描電鏡(ESEM)和X射線光電子能譜(XPS)分析預(yù)處理竹表面的形態(tài)和木質(zhì)素含量，結(jié)果顯示，水解后竹片表層物質(zhì)的木質(zhì)素特征峰(1 423、1 510和1 600 cm-1)不斷增強(qiáng)，說明水解使得竹子內(nèi)部木質(zhì)素類物質(zhì)向著竹片表層和表面遷移，從而造成表層木質(zhì)素含量增加。

目前，越來越多的先進(jìn)方法和設(shè)備用于表征假木質(zhì)素結(jié)構(gòu)，對假木質(zhì)素含量的精確定量也至關(guān)重要。為了檢測木質(zhì)纖維預(yù)處理過程中假木質(zhì)素的含量，Ma等(2015)利用XPS跟蹤熱水預(yù)處理全纖維素過程中假木質(zhì)素的形成，通過定量測定C和O含量達(dá)到對假木質(zhì)素形成量的檢測，相應(yīng)地，F(xiàn)TIR和CP/MAS13C-NMR幾乎無響應(yīng)，結(jié)果表明形成假木質(zhì)素后，C1由8.9%增加至23.0%，O/C含量由0.68降至0.54，而木質(zhì)素含量由1.0%增加至6.2%。對假木質(zhì)素含量進(jìn)行精準(zhǔn)定量，有利于更準(zhǔn)確確定假木質(zhì)素可能的形成機(jī)制。鑒于在預(yù)處理后的冷卻過程中也會不斷形成假木質(zhì)素，開發(fā)原位在線、操作簡單、針對木質(zhì)素和假木質(zhì)素等多重組分聯(lián)合分析、高通量的假木質(zhì)素含量檢測方法是未來的研究方向之一。

2 假木質(zhì)素對纖維素酶解的影響

2.1 木質(zhì)素液滴對纖維素酶解的影響

在木質(zhì)纖維酶水解過程中，天然木質(zhì)素作為物理屏障降低酶的可及性，且通過疏水性相互作用不可逆地結(jié)合酶，導(dǎo)致酶活性的損失(Yangetal.， 2006)。與天然木質(zhì)素不同，木質(zhì)纖維預(yù)處理過程中形成的木質(zhì)素液滴更加顯著地抑制纖維素酶解(Koetal.， 2015)。

表4 不同大類生物質(zhì)材料本體構(gòu)造成分及其假木質(zhì)素特征Tab.4 Structural components and characteristics of pseudo-lignin with different biomass materials

續(xù)表4 Continued

續(xù)表4 Continued

①纖維素含量以葡萄糖計；半纖維素含量以阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖、木糖和半乳糖等計；Mn為數(shù)均分子質(zhì)量(g·mol-1)，Mw為重均分子質(zhì)量(g·mol-1)，Mw/Mn為重均分子質(zhì)量與數(shù)均分子質(zhì)量之比，表示多分散性。Cellulose content is calculated by glucose; Hemicellulose content is calculated by arabinose, mannose, glucose, xylose, galactose, etc.;Mnis the number average molecular weight(g·mol-1)，Mwis the weight average molecular weight(g·mol-1)，Mw/Mnis the ratio of the weight average molecular weight to the number average molecular weight, indicating polydispersity.

Selig等(2007)研究發(fā)現(xiàn)，在稀酸預(yù)處理濾紙片過程中，向其中添加源于玉米莖皮的木質(zhì)素，木質(zhì)素會以球形形式沉積在纖維素表面上，降低酶解速率，但其研究并不能區(qū)分球形沉積物是源于木質(zhì)素還是假木質(zhì)素。進(jìn)一步地，Donohoe等(2008)發(fā)現(xiàn)稀酸預(yù)處理后沉積在生物質(zhì)細(xì)胞壁上的木質(zhì)素液滴成為酶水解的物理屏障，不利于纖維素酶接近生物質(zhì)的碳水化合物部分。Hansen等(2011)利用熒光標(biāo)記法對秸稈預(yù)處理前后不同組織細(xì)胞中內(nèi)切葡聚糖酶和外切葡聚糖酶的分布進(jìn)行研究，推測造成2種纖維素酶顯著不同分布的原因是預(yù)處理過程中形成的木質(zhì)素球狀顆粒附著在纖維素表面，因而降低了纖維素酶的利用效率。為更進(jìn)一步明確熱預(yù)處理過程中木質(zhì)素液滴對纖維素酶解的影響作用，Li等(2014a)發(fā)現(xiàn)沉積在純纖維素Avicel上的木質(zhì)素液滴顯著抑制纖維素酶解，經(jīng)過系列試驗證實木質(zhì)素液滴主要通過纖維素表面阻滯作用抑制纖維素的酶解，而木質(zhì)素液滴和酶的非特異性結(jié)合并不是主要影響因素。木質(zhì)素液滴影響纖維素酶解的機(jī)制主要是非特異性吸附或表面阻滯或2個方面的結(jié)合，取決于木質(zhì)素液滴的化學(xué)特性和顆粒尺寸。木質(zhì)素液滴對纖維素酶解可能還受木質(zhì)素液滴存在形式的影響，木質(zhì)素液滴占據(jù)的木質(zhì)纖維表面位點決定了纖維素酶的可及度，同時木質(zhì)素液滴覆蓋木質(zhì)素的表面積多寡更能影響到纖維素酶解的效率。

2.2 假木質(zhì)素對纖維素酶解的影響

與木質(zhì)纖維預(yù)處理過程中沉積的木質(zhì)素液滴類似，假木質(zhì)素也可以球狀顆粒形式沉積于纖維素表面，阻滯纖維素酶的作用位點，降低纖維素酶的利用度； 同時，假木質(zhì)素也可能通過與纖維素酶非生產(chǎn)性結(jié)合從而降低纖維素酶的酶解效率。通常情況下，添加到纖維素酶解系統(tǒng)中的少量假木質(zhì)素比生物質(zhì)中的木質(zhì)素更能顯著抑制純纖維素的酶解(Fanetal.， 2012)。Kumar等(2013)研究源于半纖維素的假木質(zhì)素對于纖維素酶解的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在較低的預(yù)處理劇烈因子(CSF 1.94)條件下，產(chǎn)生的假木質(zhì)素幾乎可以忽略不計，但會使得纖維素酶解效率顯著下降(>25%)，進(jìn)一步的蛋白吸附試驗表明假木質(zhì)素與纖維素酶產(chǎn)生了非生產(chǎn)性的結(jié)合。類似地，Hu等(2013)研究發(fā)現(xiàn)，假木質(zhì)素的添加可以降低纖維素底物糖產(chǎn)率25%，顯著不同于稀酸預(yù)處理后木質(zhì)素對于纖維素酶解的抑制，這可能與假木質(zhì)素和纖維素酶的高度疏水性，通過疏水性相互作用結(jié)合有關(guān)。

假木質(zhì)素影響纖維素酶解的程度與其結(jié)構(gòu)密切相關(guān)。木質(zhì)素中紫丁香丙烷單元(S)/愈創(chuàng)木基丙烷單元(G)的比例較高意味著纖維素酶解比較容易進(jìn)行，這是因為G型木質(zhì)素具有支鏈結(jié)構(gòu)，可與3個以上的基團(tuán)共價結(jié)合，而S型木質(zhì)素為線性結(jié)構(gòu)，僅能與2個以上的基團(tuán)共價結(jié)合。Pal等(2017)在中試規(guī)模下對甘蔗渣進(jìn)行不同組合的蒸汽爆破-混合酸處理過程中，發(fā)現(xiàn)預(yù)處理后的物料具有較高的S/G比例，有利于纖維素酶解，推測這可能是形成少量假木質(zhì)素的結(jié)果。

目前，假木質(zhì)素影響纖維素酶解的機(jī)制并不明確。Fan等(2012)、Smith等(2016)利用稀酸預(yù)處理雜交楊樹生物質(zhì)，認(rèn)為纖維素和半纖維素經(jīng)酸催化的脫水、斷裂、重排和縮聚和/或聚合反應(yīng)產(chǎn)生的假木質(zhì)素顯著抑制纖維素酶解，可能是假木質(zhì)素和纖維素酶之間形成不可逆性的吸附作用。此外，纖維素酶的可及度也是制約纖維素酶解的重要因素，Ishizawa等(2007)發(fā)現(xiàn)稀酸或高溫?zé)崴A(yù)處理后，木質(zhì)素液滴經(jīng)過重排或多或少增強(qiáng)了纖維素酶對纖維素微絲的可及度。存在于纖維素微纖絲間疏水的木質(zhì)素顆粒，有效增大了纖維素間的空間，限制了微纖絲間的塌陷，增大了酶對纖維素的可及性，可以增強(qiáng)酶的水解效率(馬建鋒等， 2014)； 假木質(zhì)素沉積物也可能通過誘導(dǎo)形成類似于Igarashi 等(2011)在報道的“Traffic Jam”從而抑制纖維素酶解，包括假木質(zhì)素對纖維素晶型轉(zhuǎn)變的影響(Lietal.， 2014b)。因此，至于假木質(zhì)素究竟是通過何種可機(jī)制抑制纖維素酶解，目前還沒有系統(tǒng)的研究證實。評價假木質(zhì)素對于纖維素酶解的影響機(jī)制，需要綜合考慮預(yù)處理方式、木質(zhì)纖維結(jié)構(gòu)、組成、纖維素的結(jié)晶度、纖維素酶的可及性和其他因素的影響。假木質(zhì)素可能通過抑制和促進(jìn)纖維素酶解2種綜合效應(yīng)影響纖維素水解： 一方面，沉積的假木質(zhì)素通過吸附作用減少游離纖維素酶量，也可以通過占據(jù)纖維素表面酶催化位點降低纖維素酶的可及度，還可以通過阻滯纖維素酶移動通路抑制纖維素酶的水解； 另一方面，沉積的假木質(zhì)素可能分布于木質(zhì)纖維空間間隙，造成可利用纖維素空間位點增加，反而有利于增加纖維素酶的可及度，從而提高纖維素酶的水解。這也可能是在不同預(yù)處理條件下，假木質(zhì)素對纖維素酶解影響結(jié)論不一性的原因。此外，假木質(zhì)素、木質(zhì)素液滴、木質(zhì)素對于纖維素酶活性的影響，也是需要考慮的影響纖維素酶解的因素。

3 假木質(zhì)素沉積形成的調(diào)控

木質(zhì)纖維預(yù)處理過程中形成的假木質(zhì)素不利于纖維素酶酶解，這就要求在處理中能夠調(diào)控以抑制假木質(zhì)素的形成，提高木質(zhì)纖維的轉(zhuǎn)化效率(Normarketal.， 2016； Mathewetal.， 2015)。

有研究向稀酸預(yù)處理反應(yīng)介質(zhì)中加入DMSO，發(fā)現(xiàn)甚至在強(qiáng)烈預(yù)處理條件下，DMSO仍可有效抑制假木質(zhì)素形成，從而增加稀酸預(yù)處理后纖維素的酶消化率(Hu， 2014； Huetal.， 2014)，這可能與DMSO抑制形成假木質(zhì)素的關(guān)鍵中間產(chǎn)物(HMF)有關(guān)。盡管DMSO具有特殊的抑制假木質(zhì)素形成特性，但是其沒有顯著改變假木質(zhì)素分子質(zhì)量或其任何結(jié)構(gòu)特征。低溫、低酸和厭氧條件可能有助于抑制預(yù)處理過程中假木質(zhì)素的形成。

Normark等(2016)研究發(fā)現(xiàn)，利用離子液體1-丁基-3-甲基咪唑乙酸鹽處理含有因高溫焙烤沉積有假木質(zhì)素的挪威云杉，通過假木質(zhì)素脫除可以明顯增強(qiáng)纖維素酶的可及性。盡管醋酸鹽類離子液體具有溶解木質(zhì)纖維的優(yōu)勢，但是離子液體合成的高成本、回收可行性和穩(wěn)定性等問題，仍然需要進(jìn)一步探索和研究。Lee等(2017)利用加壓熱水(200 ℃，15 min)對北美鵝掌楸生物質(zhì)進(jìn)行預(yù)處理，發(fā)現(xiàn)生物質(zhì)表面沉積有直徑<2 μm的球狀假木質(zhì)素，進(jìn)一步結(jié)合過氧乙酸預(yù)處理可以明顯去除假木質(zhì)素，葡萄糖得率顯著提高，為生物質(zhì)預(yù)處理過程中假木質(zhì)素的脫除提供了一個新的思路。Liu等(2017)通過向高沸點醇/水預(yù)處理反應(yīng)體系中添加1,4-丁二醇(BDO)，降低了半纖維素的去除率，推測可能BDO阻滯了木質(zhì)素或假木質(zhì)素的沉積，從而增強(qiáng)了固體纖維素底物對酶的利用效率。在生物質(zhì)稀酸預(yù)處理過程中，添加各種助劑抑制假木質(zhì)素的形成量是可控的，這也為生物質(zhì)預(yù)處理過程中開發(fā)經(jīng)濟(jì)有效的預(yù)處理工藝提供了一條新的路徑。

然而，僅僅脫除假木質(zhì)素也不一定有利于纖維素轉(zhuǎn)化率的提高，還可能與形成的假木質(zhì)素比表面積有關(guān)(Sipponenetal.， 2014a)。在明確假木質(zhì)素形成機(jī)制的基礎(chǔ)上，通過各種控制條件抑制假木質(zhì)素形成，同時需要探索一種在不改變木質(zhì)纖維表面結(jié)構(gòu)特征條件下能夠精準(zhǔn)調(diào)控假木質(zhì)素沉積量的有效方案，以更準(zhǔn)確研究假木質(zhì)素生成量對纖維素酶解的影響，改變傳統(tǒng)以不同預(yù)處理劇烈因子改變假木質(zhì)素沉積量的方法。因此，對于假木質(zhì)素形成的調(diào)控需要綜合考慮其沉積量、比表面積等結(jié)構(gòu)特性，才能找到最有利于木質(zhì)纖維酶解效率提高的有效途徑。

4 結(jié)語

木質(zhì)纖維預(yù)處理過程中，特別是在嚴(yán)峻預(yù)處理環(huán)境下更容易產(chǎn)生木質(zhì)素類產(chǎn)物——假木質(zhì)素，使得預(yù)處理后生物質(zhì)的酸不溶性木質(zhì)素含量增加； 形成的假木質(zhì)素沉積于木質(zhì)纖維表面，更加不利于纖維素酶解的進(jìn)行。因此，研究假木質(zhì)素的產(chǎn)生機(jī)制、結(jié)構(gòu)特性、調(diào)控及其影響纖維素酶解機(jī)制對木質(zhì)纖維的生物煉制具有重要意義。

假木質(zhì)素形成屬于多相反應(yīng)過程，同時受傳質(zhì)擴(kuò)散(分子群水平)和流動(宏觀統(tǒng)計水平)的影響，將來對于假木質(zhì)素形成機(jī)制的研究，可從其介尺度行為的形成機(jī)制建立相關(guān)模型和理論，實現(xiàn)其科學(xué)定量描述與定向調(diào)控，這既有利于服務(wù)木質(zhì)纖維素類生物質(zhì)煉制工藝和過程的開發(fā)，也有利于推動跨領(lǐng)域、跨學(xué)科的介尺度科學(xué)的形成和發(fā)展。在假木質(zhì)素影響纖維素酶解機(jī)制方面，可以尋找一種可控性地調(diào)節(jié)假木質(zhì)素量的方案，同時又綜合考察纖維素酶的可及性、纖維素和木質(zhì)素的表面結(jié)構(gòu)特征等多尺度效應(yīng)，從而系統(tǒng)性地揭示生物質(zhì)預(yù)處理過程中假木質(zhì)素沉積對于纖維素酶解的影響機(jī)制。