陳彩霞，賈彩鳳，李先恩，趙晨光，侯俊玲，王文全，

1.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 藥用植物研究所，北京 100193；2.河北大學(xué) 中醫(yī)學(xué)院，河北 保定 071000；3.北京康仁堂藥業(yè)有限公司，北京 101301；4.北京中醫(yī)藥大學(xué) 中藥學(xué)院，北京 102488；5.中藥材規(guī)范化生產(chǎn)教育部工程研究中心，北京 102488

知母為臨床常用中藥，是百合科植物知母AnemarrhenaasphodeloidesBge.的干燥根莖，具有清熱瀉火、滋陰潤燥的功效[1]。知母主要有效成分為芒果苷、知母皂苷等，具有降糖、降脂、抗動脈粥樣硬化、抑制腫瘤細胞生長等多種藥理活性[2-5]，也是知柏地黃丸、二母寧嗽丸、健步丸等200余種現(xiàn)代中藥的處方成分[6]。目前，知母野生資源急劇減少，栽培品逐漸成為藥材市場的主流商品。栽培知母主產(chǎn)于河北易縣、安徽亳州等地，山西、內(nèi)蒙、山東、河南等地零散種植，但以河北產(chǎn)知母質(zhì)量最佳[7]。

知母栽培生產(chǎn)中多以種子繁殖為主，種子質(zhì)量優(yōu)劣直接影響藥材的產(chǎn)量和品質(zhì)，進而影響臨床療效。以往研究表明，不同產(chǎn)地來源、不同采收期和采種部位的種子質(zhì)量差異顯著[8-11]。2009年河北省頒布了知母種子質(zhì)量地方標(biāo)準(zhǔn)，但未見分級，且適用范圍不能涵蓋全國。國內(nèi)市場流通的知母種子也存在質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)不明確、檢驗不規(guī)范等問題，嚴(yán)重制約了中藥材知母產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。有學(xué)者已對部分中藥材如遠志、桔梗、甘草、柴胡等種子的分級標(biāo)準(zhǔn)進行了研究[12-17]，關(guān)于知母種子質(zhì)量分級標(biāo)準(zhǔn)研究還未見報道。本研究對來源于知母主產(chǎn)區(qū)及藥材市場的20份種子材料，進行種子質(zhì)量檢測、確定質(zhì)量分級指標(biāo)，并以初步等級劃分的種子為材料進行田間對比試驗，驗證種子質(zhì)量分級的合理性，旨在為中藥材知母的規(guī)范化生產(chǎn)和質(zhì)量控制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

知母種子來自河北安國、易縣、石家莊靈壽、張家口，山東濟南，安徽亳州，北京藥用植物研究所等地，均為人工栽培種子。經(jīng)中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所王文全教授鑒定為知母AnemarrhenaasphodeloidesBunge.的種子。種子產(chǎn)地信息見表1。

表1 知母種子的來源

1.2 方法

1.2.1知母種子質(zhì)量指標(biāo)檢測 參照知母種子檢驗方法[18]，對收集到的20份不同產(chǎn)地知母種子的真實性、凈度、千粒質(zhì)量、含水量、生活力、發(fā)芽率5項質(zhì)量指標(biāo)進行了測定，每批種子重復(fù)4次測定。

1.2.2知母種子質(zhì)量等級初步劃分 20份知母種子的發(fā)芽率、凈度、千粒質(zhì)量等質(zhì)量指標(biāo)數(shù)據(jù)，經(jīng)過 Excel 和 SPSS 軟件進行整理、分析，通過主成分分析確定知母種子質(zhì)量分級指標(biāo)。采用K-均值聚類法分析，初步制定知母種子的質(zhì)量分級標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.3知母種子分級驗證 根據(jù)知母種子質(zhì)量初步分級標(biāo)準(zhǔn)，分別將Ⅰ級、Ⅱ級、Ⅲ級種子進行田間對比種植，研究不同等級種子與知母種苗、藥材產(chǎn)量和品質(zhì)的關(guān)系。試驗地點設(shè)在中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所栽培試驗地，小區(qū)面積3 m2，重復(fù)3次。采用條播方式，行距25 cm，用種量約1500粒/小區(qū)(用種量依據(jù)知母育苗經(jīng)驗)。小區(qū)間設(shè)置50 cm為保護行(隔離區(qū))。于種植當(dāng)年及第二年秋季，五點取樣法分別在每小區(qū)取樣15株，對不同等級知母種子種植后植株的根系生長狀況、單株產(chǎn)量等指標(biāo)進行調(diào)查。2年生植株根莖采收后，去除須根，用微濕潤的毛刷仔細刷凈泥土后切片，55 ℃烘箱中快速烘干，粉碎后過50目篩，根據(jù)《中華人民共和國藥典》(以下簡稱《中國藥典》)進行藥材品質(zhì)檢測[1]。

2 結(jié)果與分析

2.1 知母種子質(zhì)量指標(biāo)檢測

顯微鏡下觀察，知母種子長三棱形，背部呈弓狀隆起，腹棱平直，下端有一微凹的種臍。種皮黑色，有光澤。分別對20份知母種子的長度、寬度、凈度、千粒質(zhì)量、含水量、生活力和發(fā)芽率等指標(biāo)的測定，結(jié)果見表2。

表2 知母種子質(zhì)量指標(biāo)測定結(jié)果

由表2知，知母種子各質(zhì)量指標(biāo)檢測值變異范圍明顯不同。種子凈度、千粒質(zhì)量、生活力及發(fā)芽率的變異范圍比較大，這可能與不同產(chǎn)地知母種子的生產(chǎn)技術(shù)水平、采收期、貯藏條件與貯藏年限有關(guān)。從表2數(shù)據(jù)看出，目前我國知母種子生產(chǎn)和市場流通的種子質(zhì)量存在嚴(yán)重參差不齊的現(xiàn)象。就基地條件清楚的直采種子而言，栽培管理水平與種子質(zhì)量密切相關(guān)，安國種苗基地種植技術(shù)成熟，集約化栽培，種子質(zhì)量最好。靈壽、易縣基地均為山地仿野生栽培，所以種子質(zhì)量較差，北京地區(qū)種子屬于粗放管理，也影響了種子質(zhì)量?？梢姡ㄟ^提高栽培技術(shù)，加強田間管理能夠顯著提高知母種子的質(zhì)量。

2.2 知母種子質(zhì)量等級初步劃分

2.2.1檢測指標(biāo)的相關(guān)性分析 種子質(zhì)量好壞直接影響知母藥材的產(chǎn)量和質(zhì)量的穩(wěn)定。能反映知母種子質(zhì)量的指標(biāo)有多個，如種子大小、千粒質(zhì)量、含水量、生活力、發(fā)芽率等，在評定種子質(zhì)量時，測定的指標(biāo)越多，所得到的質(zhì)量信息越完整，但在實際生產(chǎn)中，很難對每批種子的多個質(zhì)量指標(biāo)都進行測定。由于各指標(biāo)間具有一定的相關(guān)性，利用多個指標(biāo)進行評價的信息往往是重疊的[19]。為明確影響知母種子質(zhì)量的各項檢測指標(biāo)之間的相關(guān)性，對知母種子的5項檢測指標(biāo)數(shù)據(jù)進行相關(guān)性分析，結(jié)果見表3。

表3 20份知母種子5項質(zhì)量指標(biāo)的相關(guān)性分析

注：*P<0.05；**P<0.01。

相關(guān)性分析結(jié)果表明，種子含水量與凈度、千粒質(zhì)量呈極顯著負相關(guān)，凈度與種子生活力呈極顯著正相關(guān)，與發(fā)芽率沒有顯著相關(guān)性。發(fā)芽率與千粒質(zhì)量、種子生活力呈極顯著正相關(guān)。這說明知母種子質(zhì)量各檢測指標(biāo)之間存在重疊，可以通過主成分分析法，確定知母種子的分級指標(biāo)。

2.2.2知母種子質(zhì)量檢測指標(biāo)的主成分分析 為確定影響知母種子質(zhì)量的主導(dǎo)因子，利用SPSS 24軟件對知母種子各指標(biāo)變量做主成分分析(見表4)。前2個特征值累計貢獻率已達到84.504%，說明前2個主成分基本包含了所有指標(biāo)信息，取前2個特征值并計算出相應(yīng)的特征向量。

表4 主成分特征值、貢獻率及累計貢獻率

前2個特征向量分別為：

F1=0.809X1+0.888X2-0.686X3+ 0.888X4+0.718X5

(1)

F2=-0.423X1+0.141X2+0.617X3+ 0.220X4+0.617X5

(2)

式中：X1代表凈度；X2代表千粒質(zhì)量；X3代表含水量；X4代表生活力；X5代表發(fā)芽率。

綜合來看，第一主成分中，凈度、千粒質(zhì)量和生活力發(fā)揮重要作用，發(fā)芽率的作用也比較顯著，第二主成分中發(fā)芽率發(fā)揮作用最大，因此，可以考慮凈度、千粒質(zhì)量、生活力、發(fā)芽率作為知母種子質(zhì)量分級的主要參考指標(biāo)。

制定種子質(zhì)量分級標(biāo)準(zhǔn)，選擇既能反映種子質(zhì)量，又便于測量，且生產(chǎn)上易于推廣應(yīng)用的指標(biāo)進行種子質(zhì)量分級，才能使種子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)具有實踐意義。考慮到種子生活力在實踐操作生產(chǎn)中的局限性，且種子生活力與種子發(fā)芽率呈極顯著相關(guān)，不考慮生活力作為知母種子質(zhì)量分級指標(biāo)。發(fā)芽率是知母發(fā)芽能力的重要指標(biāo)，是種子內(nèi)在質(zhì)量的反映，為種子等級劃分的決定性指標(biāo)。千粒質(zhì)量與種子的成熟度和飽滿度密切相關(guān)，由于知母為無限花序，開花結(jié)實持續(xù)期較長，自7月上旬開始種子陸續(xù)成熟，一直延續(xù)到9月中下旬，使知母種子成熟度有顯著差異，進而影響知母種子的質(zhì)量，且不同成熟度的種子與發(fā)芽率密切相關(guān)[11]，因此千粒質(zhì)量是影響知母種子質(zhì)量的關(guān)鍵指標(biāo)。凈度是反映知母商品性狀的重要指標(biāo)，在知母種子流通市場，常有多種雜質(zhì)特別是果皮摻雜其中，且不同批次知母種子凈度差異顯著，給生產(chǎn)帶來嚴(yán)重影響，適當(dāng)提高凈度標(biāo)準(zhǔn)有利于知母種子商品質(zhì)量的整體提高。種子含水量與種子貯藏條件有關(guān)，受環(huán)境影響較大，因此凈度和含水量可作為知母種子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的參考指標(biāo)。

2.2.3種子質(zhì)量初步分級 根據(jù)以上分析，本研究以知母種子的發(fā)芽率、千粒質(zhì)量和凈度3項指標(biāo)作為知母種子的質(zhì)量分級指標(biāo)。采用K-均值聚類法對20份知母種子的發(fā)芽率、凈度、千粒質(zhì)量等質(zhì)量指標(biāo)數(shù)據(jù)進行聚類分析，結(jié)果見表5。

表5 知母種子質(zhì)量單項影響因素K-均值聚類 最終聚類中心值

根據(jù)聚類數(shù)據(jù)結(jié)果，參考綜合因素和單項影響因素K-均值聚類分析結(jié)果及各分類，并結(jié)合生產(chǎn)實際，初步將不同產(chǎn)地知母種子的質(zhì)量等級劃分為3類，結(jié)果見表6。

表6 知母種子質(zhì)量等級初步劃分標(biāo)準(zhǔn)

分級方法采用最低定級原則，及任何一項指標(biāo)不符合規(guī)定標(biāo)準(zhǔn)都不能作為相應(yīng)等級的合格種子。本試驗所收集的20份樣本，有1份(5.0%)Ⅰ級種子，9份(45%)Ⅱ級種子，3份(15.0%)Ⅲ級種子。其中Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ級種子所占比例達到65%。7份不合格種子中，均與凈度偏低有關(guān)。但在種子生產(chǎn)過程中，可以通過加工提高種子的凈度。種子凈度偏低，貯藏過程中會因各種雜質(zhì)導(dǎo)致種子感染霉菌機會增多，種子的發(fā)芽率降低，進而導(dǎo)致種子質(zhì)量降低。因此，制定種子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，有望能整體提高知母種子在商品流通中與實際生產(chǎn)中的質(zhì)量。

2.3 知母種子質(zhì)量等級標(biāo)準(zhǔn)田間驗證

根據(jù)知母種子質(zhì)量等級初步劃分結(jié)果，分別選擇Ⅰ級、Ⅱ級、Ⅲ級種子進行田間對比種植試驗，研究不同等級種子與知母植株生長、種苗質(zhì)量、藥材植株產(chǎn)量和品質(zhì)的關(guān)系。

2.3.1不同等級知母種子種植1年植株生長狀況 種植當(dāng)年秋季對不同等級種子分級種植的知母植株取樣調(diào)查，結(jié)果見表7。

表7 不同等級知母種子對植株生長及種苗產(chǎn)量的影響

注：表中同列不同小寫字母表示P<0.05(LSD檢驗)。下同。

由表7看出，3個等級知母種子相同種子粒數(shù)播種后，在正常田間管理條件下，每小區(qū)的植株保存率顯著不同，Ⅰ級、Ⅱ級種子因發(fā)芽率高，出苗快、出苗整齊，苗木長勢旺，因此最終植株保存率、株高、側(cè)根數(shù)均顯著大于Ⅲ級種子生產(chǎn)的種苗，但平均根長、種球直徑差異無統(tǒng)計學(xué)意義。Ⅲ級種子因發(fā)芽率低，試驗小區(qū)總體植株數(shù)少，根系生長空間相對較大，因此與Ⅰ級、Ⅱ級種子生產(chǎn)的種苗根系生長狀況如根長、種球直徑、單株根質(zhì)量差異無統(tǒng)計學(xué)意義。根據(jù)知母種苗分級的研究成果[20-21]，以及生產(chǎn)實踐中對知母種苗的質(zhì)量要求，不同種子分級播種1年，相同管理條件下各級種子培育的1年生種苗均能達到合格苗的要求，優(yōu)質(zhì)種子能顯著提高單位面積種苗產(chǎn)量。

2.3.2不同等級知母種子種植2年的植株生長狀況 不同等級種子種植第2年的秋季，調(diào)查樣株的根系生長狀況如根莖分蘗數(shù)、平均根長、側(cè)根數(shù)、單株根質(zhì)量、小區(qū)產(chǎn)量等指標(biāo)，結(jié)果如表8。

由表8知，不同等級知母種子播種2年后，植株根莖分蘗數(shù)、平均根長差異無統(tǒng)計學(xué)意義，Ⅰ級、Ⅱ級種子種植2年后植株的平均側(cè)根數(shù)和單株根鮮質(zhì)量均顯著高于Ⅲ級種子，Ⅰ級種子的單株根莖鮮質(zhì)量顯著高于Ⅱ級、Ⅲ級種子。小區(qū)保留株數(shù)和小區(qū)產(chǎn)量的表現(xiàn)則是Ⅰ級>Ⅱ級>Ⅲ級，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義。不同等級種子在適宜的播種密度下，即單株生長不受空間限制的情況下，根系生長狀況差異無統(tǒng)計學(xué)意義，主要因保存株數(shù)不同導(dǎo)致同等面積藥材產(chǎn)量的差異有統(tǒng)計學(xué)意義，優(yōu)質(zhì)種子因保苗率高而使藥材產(chǎn)量也增加。

2.3.3不同等級知母種子種植2年對知母藥材質(zhì)量的影響 為了解不同等級種子種植后對收獲藥材品質(zhì)的影響，不同等級知母種子種植2年后收獲知母根莖，清洗干凈后，60 ℃烘干后粉碎，過60目篩(4號篩)，按照《中國藥典》方法進行藥材性狀和有效成分含量測定，結(jié)果見表9。

《中國藥典》規(guī)定知母藥材水分不超過12.0%，總灰分不超過9.0%，酸不溶性灰分不超過4.0%，芒果苷不得少于0.7%，知母皂苷BⅡ不得少于3.0%。由上表所列結(jié)果知，知母種子在北京地區(qū)分級種植2年后，各項指標(biāo)如水分、總灰分、酸不溶性灰分以及知母皂苷BⅡ含量均能達到《中國藥典》標(biāo)準(zhǔn)，且在不同等級知母種子種植后的藥材間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。但不同等級種子種植后，植株根莖中芒果苷的含量雖未達到《中國藥典》標(biāo)準(zhǔn)，但不同等級種子間差異有統(tǒng)計學(xué)意義，表現(xiàn)為Ⅰ>Ⅱ>Ⅲ。

表8 不同等級種子種植后2年植株根系生長和藥材產(chǎn)量狀況

表9 不同等級種子種植2年后對收獲藥材質(zhì)量的影響 %

總之，田間對比種植結(jié)果表明，質(zhì)量好的種子種植1年能夠提高知母育苗生產(chǎn)中單位面積合格種苗的產(chǎn)苗率。種植2年在適當(dāng)播種密度，即單株生長空間不受限制的情況下，單株根系狀況差異無統(tǒng)計學(xué)意義，最終會通過植株保存率不同而顯著影響知母藥材的產(chǎn)量。

2.4 知母種子質(zhì)量分級標(biāo)準(zhǔn)的確定

結(jié)合知母種子商品市場流通特性、實踐操作的可能性以及生產(chǎn)中對知母種子的質(zhì)量要求，在知母種子質(zhì)量等級初步劃分基礎(chǔ)上進行適當(dāng)調(diào)整，確定了知母種子質(zhì)量分級標(biāo)準(zhǔn)見表10。

表10 知母種子質(zhì)量分級標(biāo)準(zhǔn)

Ⅲ級以外為不合格種子建議不作為生產(chǎn)使用。按照最低定級原則制定知母種子質(zhì)量分級標(biāo)準(zhǔn)，即任何一項指標(biāo)不符合規(guī)定標(biāo)準(zhǔn)都不能作為相應(yīng)等級的合格種子。

3 結(jié)論與討論

知母種子是知母藥材規(guī)范化生產(chǎn)的首要條件和基礎(chǔ)，優(yōu)質(zhì)種子對穩(wěn)定和提高知母藥材的產(chǎn)量和質(zhì)量起著極為關(guān)鍵的作用。開展知母種子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究，對從源頭控制知母藥材及其產(chǎn)品的質(zhì)量有著重要意義。本研究依據(jù)知母種子的自身特征，將不同來源地20份知母種子進行了真實性、凈度、千粒質(zhì)量、含水量、生活力及發(fā)芽率等方面檢測研究，通過統(tǒng)計分析將知母種子初步分為3 個質(zhì)量等級，并通過田間試驗驗證了分級標(biāo)準(zhǔn)的科學(xué)性和可行性。結(jié)合知母種子商品市場流通特性、實踐操作的可能性，最終確定知母種子的質(zhì)量分級標(biāo)準(zhǔn)：Ⅰ級知母種子發(fā)芽率不低于85%，千粒質(zhì)量不低于7.5，凈度不低于95%；Ⅱ級知母種子發(fā)芽率不低于70%，千粒質(zhì)量不低于7.0，凈度不低于85%；Ⅲ級知母種子發(fā)芽率不低于65%，千粒質(zhì)量不低于6.0，凈度不低于80%，各級種子含水量均小于10%。本標(biāo)準(zhǔn)的制定，綜合考慮了影響知母種子質(zhì)量的各種因素，科學(xué)體現(xiàn)各因素的重要性。發(fā)芽率大小決定了種子的田間利用價值，可根據(jù)種子的發(fā)芽率計算田間實際播種量，發(fā)芽率是決定性指標(biāo)。知母種子成熟期長導(dǎo)致種子飽滿度和成熟度差異顯著，種子飽滿度與種子發(fā)芽率、種苗生長勢及抗性密切相關(guān)。千粒質(zhì)量反映了種子的飽滿度及成熟度，千粒質(zhì)量為知母種子質(zhì)量分級的重要指標(biāo)。凈度反映了種子的清潔度，主要影響種子的商品性狀，且會影響貯藏中種子的壽命。收集的20份知母種子樣品中，凈度差異及其顯著，特別是市場收集的樣品，凈度明顯偏低，為進一步規(guī)范知母種子生產(chǎn)、經(jīng)營以及提升種子交易過程中的整體質(zhì)量，將凈度作為重要參考指標(biāo)。種子含水量影響種子的安全貯藏和活力，所以含水量也為參考指標(biāo)。本標(biāo)準(zhǔn)在兼顧我國當(dāng)前知母種子標(biāo)準(zhǔn)化發(fā)展現(xiàn)實情況的同時，也考慮到未來的發(fā)展趨勢和需求，并通過田間試驗，驗證了標(biāo)準(zhǔn)的科學(xué)性和可行性，對于盡快實現(xiàn)知母種子標(biāo)準(zhǔn)化，保證知母栽培用種的質(zhì)量，規(guī)范知母種子的市場流通，從源頭保證知母規(guī)范化種植和優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)栽培具有現(xiàn)實可行的指導(dǎo)意義。