譚雨晴，何軒輝，馬濤，宋旭東，陳恒文 *

1.中國中醫(yī)科學院 廣安門醫(yī)院，北京 100053；2.北京中醫(yī)藥大學，北京 100029； 3.寧夏回族自治區(qū)第五人民醫(yī)院，寧夏 石嘴山 753000

黃連性寒，味苦，歸心、脾、胃、肝、膽、大腸經(jīng)，具有清熱燥濕，瀉火解毒等功效，藥用始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》[1]，為中醫(yī)臨床常用中藥。黃連為毛莨科植物黃連CoptischinensisFranch.、三角葉黃連CoptisdeltoideaC.Y.Cheng et Hsiao和云連CoptisteetaWall.的干燥根莖[2]，分別習稱味連、雅連、云連?！侗静菥V目》云：“其根連珠而色黃，故名”，主要分布在川、渝、滇、貴、藏等地[3]。

現(xiàn)代化學成分研究表明，黃連的有效成分主要為以鹽酸鹽形式存在的小檗堿，質(zhì)量分數(shù)達5%～8%。此外還含有黃連堿、巴馬亭、藥根堿、甲基黃連堿、木蘭花堿、表小檗堿等生物堿類成分[4-9]。在現(xiàn)代藥理學研究中，最初發(fā)現(xiàn)小檗堿等生物堿類成分具有抗菌、抗病毒功效，傳統(tǒng)上一直作為清熱解毒和抗感染藥物，由此研發(fā)的黃連素主要用于治療腸道細菌感染性疾病[10]。近年來，隨著臨床藥理學的不斷深入研究，陸續(xù)發(fā)現(xiàn)黃連還有改善充血性心力衰竭、擴張冠狀動脈、抗心律失常、降血糖、降血脂、抗血小板凝集、抗炎、抗腫瘤等藥理作用[11-13]。因此，小檗堿等黃連生物堿的提取對于臨床治療有著重要的意義。

隨著中藥提取純化工業(yè)科技的發(fā)展，近年報道了很多黃連的新提取方法，如超聲提取、微波提取、酶法提取技術(shù)等[14-17]，與傳統(tǒng)酸水法、石灰乳法、醇提法、索氏提取法等相比較，在一定程度上提高了有效成分的溶出速度和溶出量，還避免了高溫加熱對有效成分的破壞，但很多工藝還遠沒有達到工業(yè)化的要求，而且會帶來噪聲、污染等環(huán)保問題，增加企業(yè)的成本，極大地限制了新技術(shù)的應(yīng)用。從目前的企業(yè)生產(chǎn)工藝來看，多數(shù)中藥企業(yè)對含有黃連的中藥復(fù)方制劑依然采用水提、醇提等傳統(tǒng)工藝方法，通過對黃連提取工藝的優(yōu)化，并與其他中藥提取物混合，可以達到中藥復(fù)方的質(zhì)量要求。本實驗結(jié)合生產(chǎn)實際，通過單因素試驗，進而優(yōu)化鹽酸小檗堿等4種黃連生物堿的提取工藝，并經(jīng)過工業(yè)化生產(chǎn)的驗證進一步優(yōu)化提取濃縮干燥的工藝參數(shù)，為黃連及其復(fù)方中藥制劑的工業(yè)化提取及中藥提取由實驗室向生產(chǎn)轉(zhuǎn)化提供參考。

1 材料

1.1 儀器

Agilent 1200 HPLC高效液相色譜色譜儀；BSA124S電子分析天平(德國Sartorius公司，精度0.1 mg)；IKA RV10旋轉(zhuǎn)濃縮蒸發(fā)儀(德國IKA公司)；SHB-Ш型臺式循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長城科工貿(mào)有限公司)；DZF-6050AB真空干燥箱(上?？茣钥茖W儀器有限公司)；GL-20G-Ⅱ冷凍離心機(上海安亭科學儀器廠)；SXKW-500智能控溫電熱套、DZKW-4 電熱數(shù)顯恒溫水浴鍋、101-0AB電熱鼓風干燥箱(北京中興偉業(yè)儀器有限公司)；MG6真空干燥機、RTN3000/1000熱回流提取濃縮機組、WZ1000單效外循環(huán)真空濃縮器(常州德爾松壓力容器有限公司)。

1.2 試藥

實驗中所用中藥飲片黃連由北京豐泰金源藥業(yè)有限公司提供，取自中國中醫(yī)科學院廣安門醫(yī)院藥房，產(chǎn)地重慶，批號：20140505，經(jīng)中國中醫(yī)科學院廣安門醫(yī)院王麗霞主任藥師鑒定符合《中華人民共和國藥典》2015版一部藥用標準。

鹽酸小檗堿對照品(批號：110713-201212，純度：96.7%)購于中國食品藥品檢定研究院；95%乙醇(北京鴻志偉達工貿(mào)有限公司)；甲醇、乙腈(美國Fisher 公司，色譜純)；無水乙醇、磷酸二氫鉀等皆為分析純。

2 方法

2.1 黃連生物堿測定方法

色譜條件：安捷倫TC C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱；以乙腈-0.025 mol·L-1磷酸二氫鉀溶液(27∶73)為流動相；檢測波長為345 nm；流速為1.0 mL·min-1；進樣量為10 μL。

對照品溶液的制備：按照2015版《中華人民共和國藥典》黃連項下規(guī)定[2]，精密稱定鹽酸小檗堿對照品適量，加入甲醇制成每1 mL含0.090 5 mg的溶液。分別取0.05、0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0 mL稀釋至10 mL，配制不同濃度的對照品溶液，備用。

計算含量時，以鹽酸小檗堿對照品的峰面積為對照，分別計算小檗堿、表小檗堿、黃連堿和巴馬汀的含量，以鹽酸小檗堿色譜峰的相對保留時間為標準，表小檗堿、黃連堿、巴馬汀、小檗堿的峰保留時間應(yīng)在規(guī)定值的±5%范圍之內(nèi)，即得。

標準曲線的繪制：將配制好的不同濃度的對照品溶液分別進樣，以溶液濃度為橫坐標(X)，以峰面積為縱坐標(Y)，每個樣品平行測定2次，繪制標準曲線。

精密度的測定：取質(zhì)量濃度為0.090 5 mg·mL-1的鹽酸小檗堿對照品溶液，平行測定5次，計算峰面積及RSD。

加樣回收率的測定：精密量取已測含量的黃連提取液9份，每份5 mL，分別加入0.090 5 mg·mL-1鹽酸小檗堿對照品溶液，第1～3份精密加入1 mL，第4～6份加入2 mL，第7～9份加入3 mL，每個樣品平行測定2次，計算回收率及RSD。

2.2 黃連醇提與水提比較分析

稱取黃連飲片50 g加8倍量的水或醇回流提取1.0 h，提取 3次，提取液不合并，分別稀釋25倍，過濾，分別測定。

2.3 乙醇提取單因素考察分析

乙醇濃度考察分析：取50 g黃連飲片分別加入8倍量30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%乙醇，加熱回流提取1 h，提取2次，合并提取液，過濾，定容，測定黃連生物堿含量，每個樣品重復(fù)3次。

料液比考察分析：取50 g黃連飲片分別加入2、4、6、8、10、12倍量60%乙醇，加熱回流提取1 h，提取2次，合并提取液，過濾，定容，測定黃連生物堿含量，每個樣品重復(fù)3次。

提取時間考察分析：取50 g黃連飲片分別加入8倍量60%乙醇，分別加熱回流提取0.5、1.0、1.5、2、2.5 h，提取2次，合并提取液，過濾，定容，測定黃連生物堿含量，每個樣品重復(fù)3次。

為了確定乙醇提取的最佳工藝條件，筆者擬以L9(34)進行正交試驗，從而確定最優(yōu)工藝，因素水平見表1。

表1 黃連乙醇提取的因素水平

2.4 乙醇提取工藝驗證

為了進一步驗證所選最優(yōu)工藝，取150 kg黃連飲片按照優(yōu)化的工藝進行提取，共3批重復(fù)，過濾，定容，測定提取液中黃連生物堿含量和干膏得率。

2.5 真空干燥工藝的優(yōu)化

提取液采用減壓濃縮，減壓濃縮溫度為60 ℃，分別濃縮至密度為1.12、1.18、1.24，進行真空干燥工藝的優(yōu)化。采用L9(34)進行正交試驗，確定最優(yōu)干燥工藝，主要考察干燥溫度、濃縮液密度、濃縮液厚度對黃連生物堿的影響，正交試驗設(shè)計見表2。

表2 黃連乙醇提取液的真空干燥因素水平

2.6 真空干燥工藝的驗證

為了進一步驗證真空干燥的最優(yōu)工藝條件，取3批相同樣品，每批取10 L密度為1.18的濃縮液，平鋪于真空干燥盤中，鋪設(shè)濃縮液厚度為2 mm，控制真空干燥溫度為60 ℃，進行減壓干燥，干燥后測定黃連生物堿的含量。

2.7 干膏含量的測定

黃連經(jīng)工業(yè)化乙醇提取、減壓濃縮、真空干燥后，測定其干膏率、黃連生物堿含量及轉(zhuǎn)移率，驗證工藝的合理性。

3 結(jié)果與分析

3.1 標準曲線的繪制及方法學考察

本實驗按照《中華人民共和國藥典》標準，采用HPLC測定鹽酸小檗堿等黃連生物堿，其鹽酸小檗堿的HPLC圖和黃連提取液中黃連生物堿的HPLC圖見圖1～2，用待測成分色譜峰與鹽酸小檗堿色譜峰的相對保留時間的比值確定各成分的具體峰位。表小檗堿(0.73)、黃連堿(0.79)、巴馬汀(0.91)、小檗堿(1.000)相對保留時間在規(guī)定值的±5%范圍之內(nèi)，符合《中華人民共和國藥典》黃連項下規(guī)定[2]。以鹽酸小檗堿對照品的峰面積為對照，分別計算表小檗堿、黃連堿、巴馬汀和小檗堿的含量。HPLC測定鹽酸小檗堿的標準曲線為Y=45 834X+145.91，r=0.999 9，線性范圍0.45～90.50 μg·mL。精密度測定結(jié)果顯示精密度良好,RSD為0.14%，加樣回收率結(jié)果顯示回收率為99.5%～101.6%，且RSD為0.71%，顯示回收率良好，方法準確可行。

3.2 黃連醇提與水提比較分析

黃連藥材中4種生物堿質(zhì)量分數(shù)為11.47%，通過對黃連乙醇提取和水提取的比較分析，發(fā)現(xiàn)黃連中4種生物堿在60%乙醇中的總提取率為85.34%，高于水的提取率(74.36%)，4種生物堿的提取率均高于水的提取率，且提取2次即可達到提取的效果，結(jié)果見表3。

圖1 鹽酸小檗堿對照品HPLC圖

圖2 黃連提取液中黃連生物堿的HPLC圖

表3 黃連生物堿醇提和水提比較分析

提取溶劑提取次數(shù)/次有效成分質(zhì)量分數(shù)/%表小檗堿黃連堿巴馬汀小檗堿總生物堿提取率/%60%乙醇11.121.180.993.827.1161.9820.310.380.291.032.0117.5230.090.150.090.340.675.84合計1.521.711.375.199.7985.34水10.680.680.622.234.2142.0220.310.380.291.402.3823.7630.100.140.110.510.868.58合計1.091.201.024.147.4574.36

注：有效成分質(zhì)量分數(shù)為有效成分質(zhì)量/藥材質(zhì)量×100%，藥材中4種黃連生物堿質(zhì)量分數(shù)為11.47%。

3.3 乙醇提取單因素結(jié)果

通過對黃連進行乙醇提取工藝中乙醇濃度、加醇量、提取時間等單因素的考察，發(fā)現(xiàn)乙醇濃度在50%、60%、70%時黃連生物堿提取率較高，超過70%提取率有所降低(見圖3)；對料液比的考察中發(fā)現(xiàn)隨著加醇量的增加，黃連生物堿的含量逐漸增高，當加醇量超過6倍時，黃連生物堿提取量不再明顯增加，保持穩(wěn)定(見圖4)；對提取時間考察發(fā)現(xiàn)，隨著時間的延長黃連生物堿提取量顯著增加，超過1.0 h后增加不顯著，當提取時間超過2.0 h，隨著乙醇的蒸發(fā)及提取時間的延長，黃連生物堿受到破壞，含量反而有所降低(見圖5)。因此后續(xù)正交試驗設(shè)計中，加入乙醇的濃度選擇50%、60%、70% 3個水平，料液比選擇6倍、8倍、10倍3個水平，提取時間選擇1.0、1.5、2.0 h 3個水平。

圖3 乙醇濃度對黃連生物堿提取的影響

圖4 料液比對黃連生物堿提取的影響

圖5 提取時間對黃連生物堿提取的影響

3.4 乙醇提取工藝條件的優(yōu)化

對黃連進行乙醇提取，參考本課題組前期多指標綜合評分法優(yōu)化提取中藥復(fù)方工藝的方法[17-18]，賦予提取指標比重為：干膏率50%、黃連生物堿質(zhì)量分數(shù)50%，計算綜合得分。結(jié)果分析見表4～6。

表4 黃連L9(34)乙醇提取正交試驗設(shè)計與結(jié)果分析

表5 黃連乙醇提取工藝參數(shù)均值響應(yīng)

注：Delta為每個因子的最大平均響應(yīng)值和最小平均響應(yīng)值之差。

表6 黃連乙醇提取工藝參數(shù)方差分析

注：SeqSS為連續(xù)平方和；AdjSS為校正平方和；AdjMS為校正均方。下同。

由正交試驗結(jié)果可以得出，黃連乙醇提取的最佳工藝條件為A3B2C2，即加入8倍70%乙醇，提取1.5 h，提取2次。提取時間影響差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，乙醇濃度、料液比影響差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。根據(jù)實際生產(chǎn)情況、節(jié)省能源及正交試驗方差結(jié)果分析，最佳工藝條件調(diào)整為：加入8倍60%乙醇，提取1.5 h，提取2次。

按最優(yōu)工藝參數(shù)提取3批樣品，每批5000 g，加入8倍60%乙醇，提取1.5 h，提取2次，過濾，定容，分別計算干膏率和黃連生物堿的含量，并計算綜合得分，為98.37、99.05、98.55，平均得分為98.66，RSD為0.36%，因此確定的黃連乙醇提取工藝參數(shù)可行。

3.5 真空干燥工藝的優(yōu)化

黃連提取過程中發(fā)現(xiàn)，干燥工藝對干膏量的影響不大，但對于黃連生物堿含量影響較大，因此采用正交試驗優(yōu)化真空干燥條件對黃連生物堿的影響，包括干燥溫度、濃縮液密度、料液厚度，結(jié)果見表7～9。由正交試驗結(jié)果可以得出，真空干燥最佳工藝條件為A3B3C1，即溫度70 ℃，濃縮液密度為1.24，物料鋪設(shè)厚度為1 mm。影響真空干燥的顯著因素是濃縮液密度(P<0.01)、料液鋪設(shè)厚度(P<0.05)，干燥溫度影響差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。根據(jù)實際生產(chǎn)情況，從對黃連生物堿的破壞、節(jié)省能源的角度考慮，結(jié)合正交工藝方差分析結(jié)果，干燥溫度調(diào)整為60 ℃，濃縮液密度調(diào)整為1.18，料液鋪設(shè)厚度為2 mm。按最優(yōu)真空干燥工藝驗證該工藝對黃連生物堿的影響，即溫度60 ℃，濃縮液密度為1.18，物料鋪設(shè)厚度為2 mm，所得3批樣品黃連生物堿的質(zhì)量分數(shù)分別為8.99%、9.10%、8.95%，平均質(zhì)量分數(shù)為9.01%，RSD為0.86%，因此該工藝可行。

表7 黃連L9(34)真空干燥正交試驗設(shè)計與結(jié)果分析

注：黃連生物堿質(zhì)量分數(shù)為4種黃連生物堿質(zhì)量/藥材質(zhì)量×100%。

表8 黃連真空干燥工藝參數(shù)均值響應(yīng)

注：Delta為每個因子的最大平均響應(yīng)值和最小平均響應(yīng)值之差。

表9 黃連真空干燥工藝參數(shù)方差分析

3.6 干膏率及有效成分測定

采用最優(yōu)提取、濃縮、干燥工藝進行大生產(chǎn)后，對所得的干燥提取物進行干膏率、黃連生物堿及轉(zhuǎn)移率的測定，結(jié)果見表10。由結(jié)果可以看出，優(yōu)化工藝生產(chǎn)的提取物干膏量及有效成分轉(zhuǎn)移率均較高[19-21]，有效成分損失較少，達到生產(chǎn)的要求。

表10 黃連提取物干膏率及有效成分的測定 /%

注：黃連生物堿質(zhì)量分數(shù)為4種黃連生物堿質(zhì)量/干膏質(zhì)量×100%；提取率為干膏中4種黃連生物堿質(zhì)量/藥材中的4種黃連生物堿質(zhì)量×100%。

4 討論

黃連生物堿作為黃連的主要有效成分，由于水溶性較低，其提取、濃縮、干燥工藝一直是生產(chǎn)的重點和難點，作為生產(chǎn)企業(yè)希望能摸索出具有簡單、安全、成本低、提取率高等優(yōu)勢的適合工業(yè)化生產(chǎn)的工藝，雖然目前有一些黃連超聲提取、微波提取、酶法提取技術(shù)的報道，但對含有黃連中藥制劑的工業(yè)化提取還不成熟，因此本實驗通過實驗室工藝摸索與工業(yè)生產(chǎn)相結(jié)合，確定了黃連及其中藥復(fù)方乙醇提取的工藝，具有切實的可行性。

整個實驗過程中采用飲片投料，避免提取過程中粉碎太細造成的糊底、過濾難、增加繁瑣的工作量等難題，更符合實際的工業(yè)化生產(chǎn)；提取過程中，第一次提取時加入乙醇后應(yīng)浸泡0.5 h，讓飲片充分浸潤再進行提取，可以使有效成分提取更完全；在濃縮過程中，當乙醇蒸發(fā)后，黃連生物堿會大量析出，此時應(yīng)將沉淀物過濾后再進行濃縮，以免時間過長破壞黃連生物堿的成分，同時避免結(jié)塊現(xiàn)象的發(fā)生；在工業(yè)化生產(chǎn)中如有塊狀物出現(xiàn)，應(yīng)檢測分析是否是黃連生物堿，切不可隨意丟棄；真空干燥時應(yīng)避免濃縮物鋪設(shè)過厚，以2 mm為宜，干燥溫度控制在60 ℃，此條件下干燥時間不會超過12 h，對黃連生物堿損失較小。

黃連經(jīng)過乙醇提取濃縮、真空干燥工藝優(yōu)化后，黃連生物堿轉(zhuǎn)移率可達到85%，完全達到工業(yè)化生產(chǎn)的要求，為黃連及其中藥制劑的工業(yè)化提取提供實驗依據(jù)。