郭勤衛(wèi)，張 婷，劉慧琴，章心惠，李朝森，項小敏，趙東風(fēng)，萬紅建

(1.衢州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，浙江 衢州 324000；2.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 蔬菜研究所，浙江 杭州 310021)

絲瓜，屬葫蘆科，絲瓜屬，一年生攀援性草本植物，原產(chǎn)于東印度，主要分布在亞洲的熱帶和亞熱帶地區(qū)[1]。絲瓜自宋代、明代引入我國以來，由南至北，普遍栽培，逐漸形成具有地方特色的絲瓜種質(zhì)，種質(zhì)資源(尤其是地方資源)比較豐富[2]，為絲瓜新品種選育工作提供了種質(zhì)基礎(chǔ)。絲瓜因其味道鮮美，營養(yǎng)豐富，含有黃酮類、生物堿類等活性物質(zhì)，具有消炎、抗菌等作用，其種子中還含有能抑制艾滋病毒的物質(zhì)，可作為一種藥食兩用的蔬菜[3]在中國南北方地區(qū)廣泛種植，也是中國主要的夏季蔬菜之一。

種質(zhì)資源的遺傳多樣性研究是絲瓜育種工作的重要組成部分。廣泛收集和整理絲瓜的種質(zhì)資源，分析絲瓜種質(zhì)資源的親緣關(guān)系，能夠為絲瓜種質(zhì)資源的收集、保存、鑒定、創(chuàng)新和合理利用提供科學(xué)數(shù)據(jù)，已成為絲瓜育種工作者的重要工作[4]。近幾年，國內(nèi)外學(xué)者開展了絲瓜種質(zhì)資源的收集鑒定和評價工作，Singh等[5]對14個絲瓜親本自交系和其雜交1代的第一雌花節(jié)位，第一坐果節(jié)位，果長寬等14個農(nóng)藝性狀進(jìn)行了鑒定評價。Choudhary等[6]在干旱條件下對6份印度絲瓜地方材料15個農(nóng)藝性狀和品質(zhì)性狀進(jìn)行了鑒定評價。Varalakshmi等[7]對51份絲瓜的產(chǎn)量性狀和品質(zhì)性狀進(jìn)行了鑒定。Ramesh等[8]對32份印度絲瓜的11個特征性狀進(jìn)行了鑒定，并就其遺傳多樣性進(jìn)行了分析。李國景等[9]編制了絲瓜種質(zhì)資源描述規(guī)范和數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)，對絲瓜種質(zhì)資源的描述及分級標(biāo)準(zhǔn)做了規(guī)定，利于絲瓜種質(zhì)資源鑒定的標(biāo)準(zhǔn)化和數(shù)字化。廣東省農(nóng)科院蔬菜研究所對收集到的62份絲瓜地方種質(zhì)材料進(jìn)行了植物學(xué)特征和生物學(xué)特性鑒定[10]。江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所調(diào)用我國普通絲瓜地方品種資源以及當(dāng)前生產(chǎn)上主栽品種102份，并對普通絲瓜種質(zhì)資源部分質(zhì)量性狀的鑒定和評價[11]。湖南省蔬菜研究所對43份湖南省絲瓜地方品種材料的植物學(xué)性狀和農(nóng)業(yè)生物學(xué)特性進(jìn)行了鑒定，并對其自然分布規(guī)律作了探索[12]。

在傳統(tǒng)的育種工作中，常常以視覺識別外部特征對外在遺傳性狀進(jìn)行分析和選配，這種方式容易受到環(huán)境等因素的影響，具有很大的局限性[13]。分子標(biāo)記能直接從DNA水平反映種質(zhì)之間的遺傳差異，是研究植物遺傳多樣性的有效工具[4]。簡單序列重復(fù)區(qū)間擴(kuò)增多態(tài)性(ISSR)，由于其穩(wěn)定性好，易操作等優(yōu)點，被廣泛應(yīng)用在品種鑒定、物種分類與系統(tǒng)學(xué)比較以及物種的進(jìn)化關(guān)系等研究中[1，14-19]。蘇小俊等[1]通過ISSR分子標(biāo)記技術(shù)將43份來源不同的絲瓜種質(zhì)資源材料進(jìn)行親緣關(guān)系分析，獲得9條多態(tài)性ISSR引物，多態(tài)位點率為78.3%，種質(zhì)間遺傳相似系數(shù)變化范圍在0.37～0.98，劃分成了與形態(tài)學(xué)分類吻合的6大類群，還發(fā)現(xiàn)與地理來源也有較高的相關(guān)。葉新如等[13]利用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)分析福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供的60份高代自交系材料的親緣關(guān)系，獲得了12條多態(tài)性ISSR引物，遺傳相似系數(shù)在0.493 5～0.961 0，多態(tài)性比例92.9%，同時將其分為4類，分別為短圓筒普通絲瓜、長圓筒普通絲瓜、短棍棒有棱絲瓜和長棍棒有棱絲瓜，同樣與形態(tài)學(xué)分類比較吻合。林琿等[20]應(yīng)用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)對所收集的30份絲瓜資源分為普通絲瓜和有棱絲瓜兩類，也與形態(tài)學(xué)分類相一致。本研究以浙西地區(qū)絲瓜地方種質(zhì)資源和國家蔬菜種質(zhì)資源庫中引種的代表性絲瓜種質(zhì)資源為試材，應(yīng)用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)分析絲瓜種質(zhì)資源遺傳多樣性，為絲瓜種質(zhì)資源的收集、保存、創(chuàng)新和新品種的選育，提供DNA分子水平上的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

73份絲瓜種質(zhì)資源(表1)，其中41份為收集到的浙西地區(qū)地方品種，11份其他地區(qū)的地方品種或商品種，由衢州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院收集和提供，21份為國家蔬菜種質(zhì)資源庫中代表性的絲瓜種質(zhì)資源，從中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所國家蔬菜種質(zhì)資源中期庫中引種。

1.2 試驗方法

1.2.1 絲瓜基因組DNA的提取

選擇長勢健壯的絲瓜幼嫩葉片為材料，采用改良的CTAB法進(jìn)行基因組DNA提取。1)在65 ℃水浴鍋中預(yù)熱CTAB提取液；2)在液氮中迅速研磨樣品，將粉末狀材料轉(zhuǎn)入2 mL離心管中，加入預(yù)熱的CTAB提取液(每克樣品加入3～5 mL的提取液)，65 ℃保溫30～60 min，每隔10 min輕輕顛倒混勻；3)10 000×g條件下離心5 min，取上清轉(zhuǎn)入新離心管；4)加入等體積酚/氯仿(1∶1)，充分混勻，11 350×g離心10 min，取上清轉(zhuǎn)入新離心管；5)加入等體積氯仿，充分混勻，10 000×g離心10 min，取上清轉(zhuǎn)入新離心管；6)重復(fù)步驟4、5；7)加入2/3體積的異丙醇混勻，室溫放置，沉淀15 min；8)10 000×g條件下離心6 min，棄上清；9)將沉淀用70%的乙醇漂洗一次，室溫條件下10 000×g離心2 min，棄上清，重復(fù)洗一次；10)提取產(chǎn)物取2～3 μL用2.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，其余置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 絲瓜種質(zhì)資源來源

Table 1Luffagermplasm resources

種質(zhì)編號Material No.種質(zhì)名稱Name of germplasm來源/原產(chǎn)地Geographical origin種質(zhì)編號Material No.種質(zhì)名稱Name of germplasm來源/原產(chǎn)地Geographical originL1糯米絲瓜-1 Nuomisigua-1建德市 JiandeL38八角絲瓜-3 Bajiaosigua-3衢江區(qū)QujiangL2糯米絲瓜-2 Nuomisigua-2建德市JiandeL39江山絲瓜-1 Jiangshansigua-1江山市JiangshanL3八角絲瓜-1 Bajiaosigua-1衢江區(qū)QujiangL40仙居絲瓜 Xianjusigua仙居市XianjuL4八角絲瓜-2 Bajiaosigua-2衢江區(qū)QujiangL41常熟絲瓜Changshusigua常熟市ChangshuL5常山絲瓜-1 Changshansigua-1常山縣ChangshanL42湘絲瓜-1 Xiangsigua-1長沙市ChangshaL6常山絲瓜-2 Changshansigua-2常山縣ChangshanL43湘絲瓜-2 Xiangsigua-2長沙市ChangshaL7常山絲瓜-3 Changshansigua-3常山縣ChangshanL44江山絲瓜-2 Jiangshansigua-2江山市JiangshanL8常山絲瓜-4 Changshansigua-4常山縣ChangshanL45嶺洋絲瓜-1 Lingyangsigua-1衢江區(qū)QujiangL9常山絲瓜-5 Changshansigua-5常山縣ChangshanL46嶺洋絲瓜-2 Lingyangsigua-2衢江區(qū)QujiangL10香絲瓜-1 Xiangsigua-1姜堰市 JiangyanL47青浦香絲瓜 Qingpuxiangsigua青浦區(qū)QingpuL11香絲瓜-2 Xiangsigua-2姜堰市 JiangyanL48衢絲1號 Qusi No.1柯城區(qū)KechengL12建德絲瓜-1 Jiandesigua-1建德市JiandeL49下傅絲瓜 Xiafusigua衢江區(qū)QujiangL13建德絲瓜-2 Jiandesigua-2建德市JiandeL50白玉絲瓜 Baiyusigua臺灣TaiwanL14建德絲瓜-3 Jiandesigua-3建德市JiandeL51臺絲1號 Taisi No.1臺州市TaizhouL15開化絲瓜-1 Kaihuasigua-1開化縣KaihuaL52肉絲瓜-1 Rousigua-1合江縣HejiangL16開化絲瓜-2 Kaihuasigua-1開化縣KaihuaL53肉絲瓜-2 Rousigua-2金堂縣JintangL17開化絲瓜-3 Kaihuasigua-1開化縣KaihuaL54線絲瓜-1 Xiansigua-1雅安市YaanL18開化絲瓜-4 Kaihuasigua-1開化縣KaihuaL55黑子線絲瓜 Heizixiansigua延邊市 YanbianL19開化絲瓜-5 Kaihuasigua-1開化縣KaihuaL56永安短絲瓜 Yonganduansigua福州市FuzhouL20開化絲瓜-6 Kaihuasigua-1開化縣KaihuaL57短絲瓜 Duansigua福州市FuzhouL21開化絲瓜-7 Kaihuasigua-1開化縣KaihuaL58大肉絲瓜 Darousigua陽山縣YangshanL22開化絲瓜-8 Kaihuasigua-1開化縣KaihuaL59奧農(nóng)絲瓜 Aonongsigua廣州市g(shù)uangzhouL23常山絲瓜-6 Changshansigua-6常山縣ChangshanL60雅崗絲瓜 Yagangsigua廣州市g(shù)uangzhouL24常山絲瓜-7 Changshansigua-7常山縣ChangshanL61夏優(yōu)絲瓜 Xiayousigua廣州市g(shù)uangzhouL25常山絲瓜-8 Changshansigua-8常山縣ChangshanL62長身墨綠絲瓜 Changshenmolusigua東莞市DongwanL26常山絲瓜-9 Changshansigua-9常山縣ChangshanL63長絲瓜-1 Changsigua-1東莞市DongwanL27常山絲瓜-10 Changshansigua-10常山縣ChangshanL64扶綏絲瓜 Fusuisigua扶綏縣FusuiL28青山絲瓜Qingshansigua開化縣KaihuaL65棱絲瓜 Lengsigua灤南縣LuannanL29鐵皮絲瓜Tiepisigua蕭山區(qū)XiaoshanL66長絲瓜-2 Changsigua-2灤縣LuanL30中長絲瓜-1 Zhongchangsigua-1蕭山區(qū)XiaoshanL67洛陽絲瓜 Luoyangsigua洛陽市 LuoyangL31中長絲瓜-2 Zhongchangsigua-2蕭山區(qū)XiaoshanL68線絲瓜-2 Xiansigua-2沙市區(qū) ShashiL32八棱絲瓜Balengsigua蕭山區(qū)XiaoshanL69竹灣青絲瓜 Zhuwanqingsigua梧州市 WuzhouL33長絲瓜Changsigua蕭山區(qū)XiaoshanL70香絲瓜-3 Xiangsigua-3姜堰市 JiangyanL34巨絲1號 Jusi No.1臺灣TaiwanL71五葉香絲瓜 Wuyexiangsigua姜堰市 JiangyanL35七里絲瓜-1 Qilisigua-1柯城區(qū)KechengL72開化絲瓜-9 Kaihuasigua-9開化縣KaihuaL36七里絲瓜-2 Qilisigua-2柯城區(qū)KechengL73開化絲瓜-10 Kaihuasigua-10開化縣KaihuaL37七里絲瓜-3 Qilisigua-3柯城區(qū)Kecheng

1.2.2 ISSR-PCR反應(yīng)和檢測

PCR擴(kuò)增體系(25 μL)為：DNA模板約50 ng，10×Buffer 2.5 μL，引物0.3 μmol·L-1，4種dNTPs各0.25 μmol·L-1，MgCl221.5 mmol·L-1，TaqDNA聚合酶1.25 U。

PCR擴(kuò)增程序為：94 ℃預(yù)變性5 min，然后進(jìn)行35個循環(huán)：94 ℃變性45 s，55～62 ℃復(fù)性45 s，72 ℃延伸1.5 min，循環(huán)結(jié)束后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。

PCR結(jié)束后，將PCR產(chǎn)物在2.0%的瓊脂糖凝膠電泳中檢測。

1.2.3 ISSR多態(tài)引物的篩選

選擇農(nóng)藝性狀差異性較大的2個有棱絲瓜和2個普通絲瓜的基因組DNA為模板，隨機(jī)選擇加拿大哥倫比亞大學(xué)(UBC)公布的100條ISSR通用引物中的60條進(jìn)行篩選，以獲得多態(tài)性好、穩(wěn)定的ISSR引物。

1.3 數(shù)據(jù)分析

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳位置在凝膠的某個相同遷移率位置上有DNA條帶記為1，無DNA條帶記為0。使用EXCEL形成ISSR的表型數(shù)據(jù)矩陣，使用NTSYS2.10e軟件計算相似系數(shù)(DICE系數(shù))，并且按照遺傳距離進(jìn)行UPGMA聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 多態(tài)引物篩選

本研究通過選用4份農(nóng)藝性狀差異性較大的絲瓜種質(zhì)資源基因組DNA作為模板，對60條ISSR引物進(jìn)行篩選。最終篩選出15條穩(wěn)定性高，重復(fù)性好、條帶清晰的引物(表2)，利用這15條ISSR引物對73份絲瓜種質(zhì)資源進(jìn)行分析。

表2 十五條多態(tài)ISSR引物信息

Table 2 Information of 15 pairs of polymorphic ISSR primers

引物名稱Primer name引物序列Primer sequence(5′-3′)ISSR7CTCCTCCTCCTCCTCCTCISSR40CTCTCTCTCTCTCTCTRGISSR38ACACACACACACACACYTISSR43GAGAGAGAGAGAGAGACTISSR26GAAGAAGAAGAAGAAGAAUBC888BDBCACACACACACACAUBC810GAGAGAGAGAGAGAGATUBC842GAGAGAGAGAGAGAGAYGISSR12GACACACACACACACACS17GAGAGAGAGAGAGGS19CTGGTGTGTGTGTGTGTGTISSR31AGAGAGAGAGAGAGAGYCISSR32AGAGAGAGAGAGAGAGYGISSR23GAGAGAGAGAGAGAGAAISSR24GTGTGTGTGTGTGTGTYG

R=A/T；Y=C/G；B=C/G/T；D=A/G/T。

2.2 多態(tài)ISSR引物在73份絲瓜材料上擴(kuò)增

根據(jù)15條多態(tài)ISSR引物在73份絲瓜材料上的擴(kuò)增結(jié)果(圖1)，共擴(kuò)增出99條清晰可辨的條帶，平均每條引物擴(kuò)增出6.6條(表3)，其中，多態(tài)性條帶92條，非多態(tài)性條帶7條。各引物的多態(tài)性比例范圍在66.67%～100%，平均多態(tài)性比例為92.9%。擴(kuò)增條帶最多的為UBC842，擴(kuò)增出10條，擴(kuò)增條帶最少的為UBC888，只擴(kuò)增出3條。UBC888、UBC810在73份材料上分別擴(kuò)增3條、6條，多態(tài)性百分比最低，為66.67%。結(jié)果表明，ISSR引物在絲瓜上多態(tài)性比例較高，平均多態(tài)性比例達(dá)92.90%，適用于絲瓜種質(zhì)資源的遺傳多樣性分析。此外，還發(fā)現(xiàn)多態(tài)性比例的高低與擴(kuò)增條帶的數(shù)目沒有直接的關(guān)系。

2.3 基于ISSR的絲瓜種質(zhì)資源聚類分析

根據(jù)15條ISSR引物在73份絲瓜種質(zhì)資源上的擴(kuò)增結(jié)果，使用EXCEL構(gòu)建01矩陣，使用NTSYS2.10e軟件計算73份絲瓜種質(zhì)資源間的遺傳相似系數(shù)(GS值)，得到遺傳相似矩陣。由遺傳相似矩陣可知，73份絲瓜種質(zhì)間的遺傳相似系數(shù)在0.454 5～0.959 6，其中L13和L60的遺傳相似系數(shù)最小，為0.454 5，兩份材料的遺傳距離最遠(yuǎn)，L5和L8相似系數(shù)最大，為0.959 6，兩種質(zhì)間的親緣關(guān)系最近。

根據(jù)遺傳相似系數(shù)矩陣，利用UPGMA法對73份絲瓜種質(zhì)資源進(jìn)行聚類分析，結(jié)果如圖2。以0.59為閾值時，將73份絲瓜種質(zhì)材料分為2類，一類為有棱絲瓜，另一類為普通絲瓜，這一結(jié)果與傳統(tǒng)的分類方式一致。以0.66為閾值時，將73份絲瓜種質(zhì)分為4類，有棱絲瓜和普通絲瓜均被分為2個亞類，有棱絲瓜中的第1個亞類由L3、L4、L19、L32和L38組成，均來自浙西地區(qū)，瓜形均為短棍棒形，第2個亞類由L58、L59、L60、L61、L62、L63、L64、L65和L69，除L65來自河北地區(qū)，瓜形為紡錘形，其他材料均來自于兩廣地區(qū)，瓜形均為長棍棒，普通絲瓜第1個亞類由L7組成，來自常山縣，瓜形為長圓筒，瓜色為花斑色(瓜上部為綠色，下部為白色)，第2亞類由除L7以外的其他普通絲瓜組成，瓜色均為綠色或淡綠色。

3 結(jié)論與討論

M，DL2000 marker。圖1 ISSR引物S19在73份絲瓜材料上的擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 The amplification results of S19 on 73 Luffa germplasm resources

表3 十五對引物擴(kuò)增結(jié)果分析

Table 3 The amplification of 15 pairs of ISSR primers

引物名稱Primername總條帶數(shù)Totalbands差異性條帶Differencebands基本帶Basicbands多態(tài)性百分?jǐn)?shù)Polymorphism/%ISSR7550100.00ISSR40770100.00ISSR38770100.00ISSR43990100.00ISSR2698188.89UBC88832166.67UBC81064266.67UBC84210100100.00ISSR1254180.00S17550100.00S19440100.00

續(xù)表3 Continued Table 3

利用分子標(biāo)記技術(shù)分析作物種質(zhì)資源遺傳關(guān)系，不僅可以開展系統(tǒng)進(jìn)化生物學(xué)研究，也可為資源的開發(fā)利用和優(yōu)良品種的選育提供理論支撐。ISSR分子標(biāo)記因穩(wěn)定性好，易操作等特點，已經(jīng)廣泛的應(yīng)用于蔬菜作物的遺傳多樣性分析[21-24]。本研究通過篩選獲得穩(wěn)定性好，多態(tài)性高的15條ISSR引物并用于擴(kuò)增73個絲瓜種質(zhì)資源，擴(kuò)增出DNA條帶99條，其中多態(tài)性條帶92條，各引物多態(tài)性比例在66.67%～100%，平均多態(tài)性比例為92.90%，遺傳相似系數(shù)在0.454 5～0.959 6，結(jié)果表明，73份絲瓜種質(zhì)資源的遺傳多樣性較為豐富，這與葉新如等[13]研究60份高代自交系材料的的遺傳多樣性分析中，平均多態(tài)性比例和遺傳相似系數(shù)范圍幾乎一致。但較蘇小俊等[1]對43份來源不同的絲瓜種質(zhì)資源材料進(jìn)行親緣關(guān)系分析不太一致，可能是由于本研究的研究材料多數(shù)來源于浙西地區(qū)，地理區(qū)域范圍窄，區(qū)域間絲瓜種質(zhì)資源交流較為頻繁而造成的。

圖2 七十三份絲瓜種質(zhì)資源聚類分析(UPGMA)Fig.2 Dendrogram of 73 Luffa germplasm resources

本研究以遺傳相似系數(shù)0.59為閾值，將73份絲瓜種質(zhì)資源聚類分為2大類，分別為有棱絲瓜和普通絲瓜，這一結(jié)果與傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)分類方式一致，也與葉新如等[13]和林琿等[20]的研究結(jié)果一致。以遺傳相似系數(shù)0.66為閾值時，分為4個亞類，分別為浙西地區(qū)的短棍棒有棱絲瓜；廣西、廣東地區(qū)的長棍棒有棱絲瓜；常山花斑普通絲瓜和綠色或淡綠色普通絲瓜。分類結(jié)果與蘇小俊等[1]的研究結(jié)果類似，既與形態(tài)學(xué)分類較為吻合，還與地理來源有很大的相關(guān)性。

對現(xiàn)有絲瓜種質(zhì)資源進(jìn)行分類，并在合理情況下，利用親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的種質(zhì)進(jìn)行雜交組合的配制，是提高優(yōu)良組合選育的有效手段之一。在本研究結(jié)果的基礎(chǔ)上和部分性狀互補(bǔ)的情況下，能夠快速、準(zhǔn)確地選育符合本地市場的優(yōu)良絲瓜新品種。