馬娟 陳俊林 黃飛 徐費(fèi)凡 瞿梅 顧德林

【摘要】 目的：探討Xpert MTB/RIF聯(lián)合SAT技術(shù)（RNA恒溫?cái)U(kuò)增實(shí)時(shí)檢測法，MTB-RNA）快速檢測痰標(biāo)本中耐藥結(jié)核分枝桿菌（MTB）價(jià)值。方法：對(duì)2015年2月-2017年10月在南通市第六醫(yī)人民院就診172例復(fù)治肺結(jié)核患者涂陽痰標(biāo)本分別進(jìn)行Xpert MTB/RIF檢測、SAT檢測、BACTEC MGIT960培養(yǎng)及利福平（RFP）藥敏試驗(yàn)。對(duì)MTB-RNA檢測陽性同時(shí)Xpert MTB/RIF報(bào)告RFP耐藥的痰標(biāo)本予RFP藥物滅菌72 h后再進(jìn)行SAT檢查，將Xpert MTB/RIF聯(lián)合SAT檢測的結(jié)果與BACTEC MGIT960藥敏結(jié)果進(jìn)行對(duì)照分析。結(jié)果：Xpert MTB/RIF檢出耐RFP痰標(biāo)本56例，BACTEC MGIT960鑒定為MTB且耐RFP痰標(biāo)本44例。SAT檢測報(bào)告MTB-RNA陽性同時(shí)Xpert MTB/RIF檢出耐RFP標(biāo)本50例，其中經(jīng)過RFP作用72 h后再進(jìn)行SAT檢測報(bào)告MTB-RNA陽性標(biāo)本僅46例，稍高于BACTEC MGIT960藥敏結(jié)果，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（字2=0.25，P>0.05）。結(jié)論：利用Xpert MTB/RIF聯(lián)合SAT技術(shù)能快速檢測痰標(biāo)本中耐藥MTB，對(duì)及時(shí)精準(zhǔn)制定抗結(jié)核治療方案具有重要參考價(jià)值。

【關(guān)鍵詞】 結(jié)核分枝桿菌 利福平 藥敏試驗(yàn) XpertMTB/RIF RNA恒溫?cái)U(kuò)增實(shí)時(shí)檢測法

[Abstract] Objective： To assess the value of rapid detecting heterogeneity drug resistance mycobacterium tuberculosis （MTB） in sputum specimens by Xpert MTB/RIF joint SAT tests （RNA real-time thermostatic expansion SAT tests，MTB-RNA）. Method： A total of 172 cases sputum smear-positive specimen of recurrent pulmonary tuberculosis patients from February 2015 to October 2017 in Nantong Sixth Peoples Hospital were detected by Xpert MTB/RIF methods， SAT， BACTEC MGIT960 cultivation and rifampicin （RFP） drug sensitive test respectively. The sputum specimens of MTB-RNA positive and RFP resistant which rely on the Xpert MTB/RIF identification at the same time were detected by SAT again After 72 hours of RFP drugs sterilization， the testing results of Xpert MTB/RIF joint SAT were comparison analyzed with BACTEC MGIT960 susceptibility results. Result： A total of 56 cases sputum specimen of RFP resistant were detected by Xpert MTB/RIF， 44 cases RFP resistant MTB in sputum specimens were identified by BACTEC MGIT960. A total of 50 cases sputum specimen of MTB-RNA positive and RFP resistant at the same time were detected by SAT and Xpert MTB/RIF， among only 46 cases sputum specimen of MTB-RNA positive were detected by SAT after 72 hours of RFP action， the results slightly higher than BACTEC MGIT960 susceptibility， there were no statistically significant differences （字2=0.25， P>0.05）. Conclusion： The heterogeneity drug resistance MTB can be quickly detected by MTB/RIF joint SAT technology. It has important reference value for timely and accurate develop anti-tuberculosis treatment scheme.

利福平（RFP）是目前最重要的一線抗結(jié)核藥物，但近年來耐RFP結(jié)核病有逐年上升趨勢，國內(nèi)外對(duì)耐RFP結(jié)核病非常重視，并將其列入耐多藥結(jié)核病診治范疇（簡稱RR-TB）[1-2]。如果能早期診斷耐RFP結(jié)核病并即時(shí)調(diào)整治療方案，可能會(huì)避免低頻率、低耐藥MTB逐步演變成高耐藥、耐多藥甚至全部耐藥MTB，從而提高治愈率，降低治療成本和減輕患者身心痛苦。相對(duì)于檢測耗時(shí)過長的羅氏培養(yǎng)及比例法藥敏技術(shù)和價(jià)格昂貴、推廣受到限制的自動(dòng)化表型藥敏檢測技術(shù)BACTEC MGIT960[3]，目前已推廣并廣泛應(yīng)用至國內(nèi)地市級(jí)以下醫(yī)院的Xpert MTB/RIF檢測技術(shù)，僅需要幾小時(shí)就能自動(dòng)篩查出標(biāo)本中是否存在MTB及RFP耐藥情況，即使存在比例較低異質(zhì)性耐RFP的MTB也能被有效檢測到，已成為早期快速診斷耐RFP結(jié)核病最有效的自動(dòng)化分子藥敏檢測技術(shù)[4-5]。但在檢測臨床標(biāo)本過程中發(fā)現(xiàn)Xpert MTB/RIF和表型藥敏檢測結(jié)果方面存在一定差異[6]，可能會(huì)對(duì)制訂抗結(jié)核方案帶來困惑。筆者嘗試?yán)肵pert MTB/RIF聯(lián)合SAT技術(shù)（RNA恒溫?cái)U(kuò)增實(shí)時(shí)檢測法）來快速檢測痰標(biāo)本中耐藥MTB，來彌補(bǔ)Xpert MTB/RIF檢測不足，報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

1.1.1 菌株來源 MTB標(biāo)準(zhǔn)株（H37Rv ATCC27294）購自國家菌種保藏中心，172例涂陽痰標(biāo)本來自2015年2月-2017年10月在南通市第六人民醫(yī)院就診的復(fù)治肺結(jié)核患者。其中男110例，女62例，年齡22～82歲，平均（49.5±2.0）歲。對(duì)每例復(fù)治肺結(jié)核患者均詳細(xì)記錄用藥史、癥狀及胸部影像學(xué)檢查情況。

1.1.2 主要試劑和儀器 iddlebrook 7H9培養(yǎng)基干粉、OADC營養(yǎng)添加劑、Bactec MGIT檢測儀、Bactec MGIT試劑[購自美國BD（Becton Dickinson）公司];RFP購自美國Fluka公司;GNP-92700隔水式培養(yǎng)箱購自上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;Gene Xpert儀器及Xpert MTB/RIF檢測試劑盒購自美國Cepheid公司;MTB核酸檢測試劑盒（RNA恒溫?cái)U(kuò)增，商品名TB-SAT）、分枝桿菌超聲破碎儀購自上海仁度生物科技有限公司;ABI 7500型熒光定量PCR儀（美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司生產(chǎn)）。

1.2 方法

1.2.1 抗酸染色涂片 檢測操作按照文獻(xiàn)[7]《結(jié)核病診斷實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)程》中的標(biāo)準(zhǔn)化操作程序進(jìn)行操作。痰抗酸桿菌菌量按萎-尼染色鏡檢結(jié)果菌量分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)以1+、2+、3+、4+記錄，其中20例標(biāo)本1+，37例標(biāo)本2+，63例標(biāo)本3+，52例標(biāo)本4+。

1.2.2 標(biāo)本處理 取干酪樣或膿樣晨痰1 ml于試管內(nèi)，加入4%NaOH 4 ml并進(jìn)行振蕩使痰液充分消化，移入37 ℃水浴箱，15 min后用1 mmol/L的磷酸鹽緩沖液中和，3 000 r/min離心，30 min后移入37 ℃水浴電熱恒箱內(nèi)。

1.2.3 BACTEC MGIT960 按照BACTEC MGIT960操作說明，進(jìn)行分枝桿菌液體培養(yǎng)、菌型鑒定及RFP藥敏試驗(yàn)（培養(yǎng)基的RFP藥物終濃度為1.0 μg/ml），儀器在一定時(shí)間內(nèi)自動(dòng)報(bào)告敏感與耐藥結(jié)果。質(zhì)量控制：每次藥敏試驗(yàn)均采用H37Rv標(biāo)準(zhǔn)株作為陽性參照。

1.2.4 Xpert MTB/RIF核酸擴(kuò)增檢測 按試劑說明書將之前處理后標(biāo)本加入檢測反應(yīng)盒，上機(jī)進(jìn)行檢測，系統(tǒng)自動(dòng)進(jìn)行檢測和結(jié)果判斷，2 h內(nèi)判斷標(biāo)本內(nèi)是否存在MTB及是否對(duì)RFP耐藥，反應(yīng)結(jié)束后在檢測系統(tǒng)窗口下直接觀察測試結(jié)果。結(jié)果報(bào)告為：MTB檢出或未檢出，檢出菌量報(bào)告結(jié)果為高、中、低、極低;MTB檢出報(bào)告同步顯示RFP耐藥的結(jié)果：△CT≥3.5，RFP耐藥;△CT<3.5，RFP敏感（CT是指探針循環(huán)域值，△CT指探針早期CT值與晚期CT值之差），耐藥檢測探針分別為：probe A、probe B、probe C、probe D、probe E。

1.2.5 TB-SAT檢測 根據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行操作，將液化好的結(jié)核標(biāo)本進(jìn)行稀釋，再用超聲波處理儀進(jìn)行超聲處理15 min。超聲結(jié)束后，取2 μl處理標(biāo)本加入30 μl擴(kuò)增檢測液中，開啟恒溫?zé)晒鈾z測儀器進(jìn)行檢測。

1.2.6 其他 痰標(biāo)本RFP處理后再進(jìn)行TB-SAT檢測，流程參照文獻(xiàn)[8]進(jìn)行：取0.5 ml痰處理標(biāo)本分別接種至對(duì)照管（不含藥物）及加藥管（RFP終濃度為1 μg/ml）的7H9液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)管總體積為1 ml，37 ℃培養(yǎng)72 h，進(jìn)行SAT檢測。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 13.0軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)數(shù)資料采用率（%）表示，兩組間比較采用字2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 172例涂陽痰標(biāo)本檢測結(jié)果

BACTEC MGIT960培養(yǎng)報(bào)告陰性標(biāo)本18例，陽性標(biāo)本154例;4例鑒定為非結(jié)核分枝桿菌，150例鑒定為MTB，藥敏結(jié)果顯示耐RFP 44例。Xpert MTB/RIF檢測到167例，檢出菌量報(bào)告結(jié)果為高87例，中38例，低34例，極低8例;檢出耐RFP 56例，菌量報(bào)告結(jié)果為高20例，中16例，低14例，極低6例;probe D及probe E檢測結(jié)果共40例，占71.4%。SAT檢測報(bào)告MTB-RNA陽性154例。56例耐RFP標(biāo)本中菌量與探針結(jié)果關(guān)系見表1。

2.2 Xpert MTB/RIF、Xpert MTB/RIF+SAT與BACTEC MGIT960在檢測RFP耐藥結(jié)果的差異比較

單獨(dú)利用Xpert MTB/RIF檢測到耐RFP標(biāo)本56例，與BACTEC MGIT960診斷RFP耐藥有差異性標(biāo)本13例，多見于耐藥基因突變，多為探針A、B、C探查結(jié)果或者含二線方案治療中>3個(gè)月的患者痰標(biāo)本，見表2;Xpert MTB/RIF檢測到耐RFP標(biāo)本56例中同時(shí)SAT檢測報(bào)告MTB-RNA陽性有50例，將這50例MTB-RNA陽性標(biāo)本經(jīng)過RFP作用72 h后再進(jìn)行SAT檢測，報(bào)告MTB-RNA陽性標(biāo)本46例，與BACTEC MGIT960同時(shí)診斷RFP耐藥為43例，有差異性標(biāo)本4例，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（字2=0.25，P>0.05），見表3。

3 討論

耐RFP結(jié)核病有賴于早期診斷和有效治療，但耐RFP結(jié)核病形成是一個(gè)緩慢的過程，即低耐藥MTB從零星出現(xiàn)逐步演變成高暴露、高耐藥MTB過程，對(duì)這個(gè)過程中不同時(shí)間的痰標(biāo)本進(jìn)行檢測可能出現(xiàn)分子藥敏和表型藥敏不一致性[9]，因此如果能早期檢測出復(fù)治肺結(jié)核患者痰標(biāo)本MTB中低頻率的RFP異質(zhì)性耐藥菌，可能成為提高其治愈率、減輕致殘率的關(guān)鍵。常規(guī)MTB藥敏試驗(yàn)方法，如羅氏培養(yǎng)及藥敏試驗(yàn)耗時(shí)過長不能滿足臨床需要，自動(dòng)化BACTEC MGIT960表型藥敏檢測方法因價(jià)格問題無法推廣應(yīng)用。而近年來臨床廣泛應(yīng)用檢測MTB及RFP耐藥的Xpert MTB/RIF分子藥敏技術(shù)采用半巢式PCR，針對(duì)rpo B基因81 bp RFP）耐藥決定區(qū)設(shè)計(jì)了5個(gè)分子信標(biāo)探針（以probe A、probe B、probe C、probe D、probe E命名），以檢測標(biāo)本中是否存在MTB及是否對(duì)RFP耐藥，是將MTB的DNA提取、PCR擴(kuò)增和熒光檢測結(jié)合在一起，并自動(dòng)報(bào)告結(jié)果的檢測系統(tǒng)，國內(nèi)外應(yīng)用Xpert MTB/RIF檢測MTB及其RFP耐藥報(bào)道較多[10-12]。

筆者在臨床應(yīng)用過程中發(fā)現(xiàn)利用Xpert MTB/RIF診斷RFP耐藥雖然快速，僅需要3 h就能得到結(jié)果，但利用Xpert MTB/RIF檢測的結(jié)果與BACTEC MGIT960仍然有一定差異。進(jìn)一步對(duì)檢測耐RFP的MTB分子信標(biāo)探針結(jié)果進(jìn)行對(duì)比發(fā)現(xiàn)，probe D及probe E探針結(jié)果共40例，占71.4%，probe A、probe B及probe C探針結(jié)果共15例，而probe A、probe B探針檢測到基因突變片段可能為低耐藥或無意義突變[13];同時(shí)在實(shí)際檢測過程中發(fā)現(xiàn)患者送檢痰標(biāo)本的時(shí)間節(jié)點(diǎn)不盡相同，即部分患者留取痰標(biāo)本前可能進(jìn)行了有效用藥，長時(shí)間、廣覆蓋的治療可能會(huì)造成涂陽痰標(biāo)本中MTB狀態(tài)多樣性，如活菌、DNA未降解的死菌，L型MTB等;而Xpert MTB/RIF是基于MTB的DNA提取、PCR擴(kuò)增為基礎(chǔ)的，意味著對(duì)患者痰標(biāo)本中各種狀態(tài)的MTB都能進(jìn)行有效檢測，不能區(qū)別死菌和活菌;同時(shí)Xpert MTB/RIF檢測標(biāo)本中異質(zhì)性耐藥結(jié)核菌存在一定閾值限制，本實(shí)驗(yàn)組通過臨床實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，如標(biāo)本中RFP耐藥MTB低于15%的比例，Xpert MTB/RIF檢測rpo B基因突變的能力明顯減低。因此Xpert MTB/RIF能快速檢測到標(biāo)本中MTB存在rpo B基因突變，單獨(dú)依靠Xpert MTB/RIF檢測結(jié)果來制定治療方案存在一定的風(fēng)險(xiǎn)。

筆者就如何快速解決這一問題進(jìn)行了認(rèn)真探索，發(fā)現(xiàn)利用SAT-TB檢測技術(shù)檢測痰標(biāo)本中MTB-RNA能有效彌補(bǔ)Xpert MTB/RIF不足?，F(xiàn)正在推廣使用檢測MTB-RNA的新技術(shù)SAT-TB[14-15]，是以MTB特異的16srRNA為檢測靶標(biāo)，通過恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)擴(kuò)增RNA靶標(biāo)片段，對(duì)熒光標(biāo)記的探針與靶標(biāo)片段的擴(kuò)增產(chǎn)物雜交后釋放出熒光信號(hào)進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測，從痰標(biāo)本處理到最終報(bào)告結(jié)果僅需幾小時(shí)，能快速準(zhǔn)確地診斷檢測樣本中是否存在MTB，且SAT-TB只能檢測活的MTB，因?yàn)镸TB死亡后RNA能快速降解[16]，不同于雙鏈結(jié)構(gòu)的DNA有1～2個(gè)月才降解的超長平臺(tái)期。從本組利用SAT-TB檢測數(shù)據(jù)看，Xpert MTB/RIF檢測到耐RFP標(biāo)本56例中同時(shí)SAT檢測報(bào)告MTB-RNA陽性有50例，表明有6例標(biāo)本中MTB基本為死菌。將50例標(biāo)本使用RFP殺菌72 h，即將標(biāo)本中敏感MTB殺滅后再利用SAT檢測，結(jié)果有46例痰標(biāo)本MTB-RNA為陽性，提示這46例標(biāo)本中存在RFP耐藥MTB且為活菌，接近于BACTEC MGIT960藥敏結(jié)果（字2=0.25，P>0.05）。利用基于DNA的Xpert MTB/RIF聯(lián)合基于RNA的SAT-TB分子藥敏技術(shù)方案來快速檢測痰標(biāo)本中RFP耐藥MTB，可以較準(zhǔn)確判斷標(biāo)本中MTB對(duì)RFP耐藥程度、耐藥菌是否為活菌，類似于分子藥敏結(jié)合表型藥敏技術(shù)，對(duì)快速制定抗結(jié)核治療方案和綜合評(píng)估治療效果有非常大的幫助，能基本滿足臨床的需要。

本檢測方案不足之處在于Xpert MTB/RIF僅能涵蓋rpoB基因81 bp RFP耐藥決定區(qū)，對(duì)可能存在耐藥決定區(qū)外少見基因突變或其他因素導(dǎo)致耐藥沒有鑒定能力[17-18];少量非優(yōu)勢耐藥菌群活性差，利用RFP殺滅不活躍MTB可能要延長藥物作用時(shí)間后才能進(jìn)行SAT-TB檢測，可能需要嘗試聯(lián)合其他實(shí)用、經(jīng)濟(jì)的檢測技術(shù)或者優(yōu)化相關(guān)檢測流程來完善檢測方案?？傊?，對(duì)于缺少像BACTEC MGIT960這種快速檢測MTB藥敏表型藥敏檢測儀器的基層單位，Xpert MTB/RIF聯(lián)合SAT檢測可以成為快速精準(zhǔn)診斷RFP異質(zhì)性耐藥優(yōu)選方案之一。

參考文獻(xiàn)

[1] World Health Organization.Treatment Guidelines for Drug-resistant Tuberculosis[S].2016 Update.WHO/HTM/TB/2016.04.Geneva：World Health Organization，2016.

[2] Herve C，Bergot E，Veziris N，et al.Tuberculosis in 2015：From diagnosis to the detection of multiresistant cases[J].Rev Mal Respir，2015，32（8）：784-790.

[3]郭蘇珊，林健雄，郭金鎮(zhèn)，等.BACTEC MGIT 960用于結(jié)核分枝桿菌直接藥敏試驗(yàn)的研究[J].中國病原生物學(xué)雜志，2014，9（10）：946-948，952.

[4]劉亞芹，楊振斌，馮冬霞，等.GeneXpert法檢測結(jié)核分枝桿菌及其對(duì)利福平耐藥性的研究[J/OL].中華實(shí)驗(yàn)和臨床感染病雜志：電子版，2015，9（4）：524-527.

[5] Walters Elisabetta，van der Zalm Marieke Magrieta，Palmer Megan， et al.

Xpert MTB/RIF on stool is useful for the rapid diagnosis of tuberculosis in young children with severe pulmonary disease[J].The Pediatric Infectious Disease Journal，2017，36（9）：837-843.

[6]陳俊林，黃飛，徐費(fèi)凡，等.Xpert MTB/RIF與BACTEC MGIT960檢測結(jié)核分枝桿菌及利福平耐藥差異性[J].中國醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2018，15（1）：49-52.

[7]中國防癆協(xié)會(huì)基礎(chǔ)專業(yè)委員會(huì).結(jié)核病診斷實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)程[M].北京：中國教育文化出版社，2006.

[8]程松，李園園，陸俊梅，等.RNA恒溫?cái)U(kuò)增實(shí)時(shí)檢測技術(shù)對(duì)結(jié)核分枝桿菌利福平耐藥性的研究[J].中華結(jié)核和呼吸雜志，2014，37（5）：328-331.

[9]高旭，李靜，柳清云，等.異質(zhì)性耐藥對(duì)結(jié)核分枝桿菌表型和基因型耐藥檢測結(jié)果的影響[J].中華結(jié)核和呼吸雜志，2014，37（4）：260-265.

[10] Sah A K，Joshi B，Khadka D K，et al.Comparative study of GeneXpert MTB/RIF assay and multiplex PCR assay for direct detection of mycobacterium tuberculosis in suspected pulmonary tuberculosis patients[J].Curr Microbiol，2017，74（9）：1026-1032.

[11]徐禮鋒，余旭良，張鋒，等.液體MGIT培養(yǎng)聯(lián)合XpertMTB/RIF快速檢測結(jié)核分枝桿菌及其耐藥性研究[J].中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2016，39（4）：272-276.

[12]紀(jì)麗微，林健雄，彭東東，等.Xpert MTB/RIF技術(shù)用于結(jié)核分枝桿菌聯(lián)合檢測的研究[J].國際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2017，38（10）：1391-1394.

[13] Mathys V，van de Vyvere M，de Droogh E，et al.Positive rifampicin resistance on Xpert MTB/RIF caused by a silent mutation in the rpoB gene[J].Int J Tuberc Lung Dis，2014，18（10）：1255-1257.

[14]葛燕萍，張青.痰標(biāo)本RNA恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)對(duì)活動(dòng)性肺結(jié)核的臨床診斷價(jià)值[J].中國防癆雜志，2016，38（9）：742-746.

[15]羅賢，張臘紅，洪理泉，等.恒溫?cái)U(kuò)增實(shí)時(shí)熒光檢測技術(shù)在肺結(jié)核患者診斷中的應(yīng)用[J].中華實(shí)驗(yàn)和臨床病毒學(xué)雜志，2015，29（2）：183-185.

[16] Cui Z，Li Y，Cheng S，et al.Direct identification and discernment of Mycobacterium avium and Mycobacterium intracellulare using a real-time RNA isothermal amplification and detection method[J].Tuberculosis，2015，95（6）：764-769.

[17] Somoskovi A，Deggim V，Ciardo D，et al.Diagnostic implications of inconsistent results obtained with the Xpert MTB/Rif assay in detection of Mycobacterium tuberculosis isolates with an rpoB mutation associated with low-level rifampin resistance[J].J Clin Microbiol，2013，51（9）：3127-3129.

[18]張愛梅，李鋒，劉旭暉，等.結(jié)核分枝桿菌/利福平耐藥實(shí)時(shí)熒光定量核酸擴(kuò)增檢測在肺外結(jié)核中的診斷價(jià)值[J].中華傳染病雜志，2016，34（3）：174-179.

（收稿日期：2019-10-21） （本文編輯：何玉勤）