劉德俊，劉蔚雯，李星，姚紅，沈張奇，汪洋，沈建忠*

Beijing Advanced Innovation Center for Food Nutrition and Human Health, College of Veterinary Medicine, China Agricultural University, Beijing 100193,China

1. 綜述

彎曲菌是一種嗜熱型的革蘭氏陰性菌，是全球引起彎曲菌病這一食源性疾病的主要病原[1,2]?？漳c彎曲菌和結(jié)腸彎曲菌是彎曲菌屬中引起人類胃腸炎最主要的種[3]。此外，空腸彎曲菌還是引起格林巴利綜合征（GBS）與米勒費(fèi)雪癥候群（MFS）的主要誘因[2]。家禽、被污染的水、生牛奶都是其常見的感染源[4]，由于雞的腸道是彎曲菌最適宜生存的環(huán)境，因此，雞是彎曲菌最主要的宿主，并在其感染人類的過程中扮演非常重要的角色[5]。

通常，彎曲菌感染具有自限性，不需要臨床治療，只需補(bǔ)充營養(yǎng)物質(zhì)保證水和電解質(zhì)的平衡即可[6]。而對(duì)于有獲得性免疫缺陷綜合征（AIDS）、癥狀嚴(yán)重或者發(fā)生腸道外感染的病患則需進(jìn)行抗菌藥物治療[6]。氟喹諾酮類藥物和大環(huán)內(nèi)酯類藥物是治療彎曲菌感染的首選藥物[7]，四環(huán)素和慶大霉素則通常治療彎曲菌引起的全身性感染[7]。然而，由于抗菌藥物的廣泛使用，彎曲菌的耐藥性問題（如環(huán)丙沙星和阿奇霉素耐藥性）已成為人醫(yī)和獸醫(yī)臨床上的重要挑戰(zhàn)。2017年歐盟細(xì)菌耐藥性與人畜共患病報(bào)告結(jié)果顯示，57.7%的空腸彎曲菌與63.5%的結(jié)腸彎曲菌已對(duì)環(huán)丙沙星產(chǎn)生耐藥[8]。美國國家腸道細(xì)菌耐藥性監(jiān)測(cè)系統(tǒng)（NARMS）結(jié)果顯示，人源結(jié)腸彎曲菌對(duì)環(huán)丙沙星的耐藥率由2012年的34%上升至2015年的40%，雞源空腸彎曲菌對(duì)環(huán)丙沙星的耐藥率也維持在22%～28%（2012—2015年）[9]。因此，2013年美國疾病預(yù)防控制中心已將耐藥彎曲菌列為危害公共衛(wèi)生安全的重要威脅[10]。世界衛(wèi)生組織也將氟喹諾酮耐藥彎曲菌列為病原優(yōu)先級(jí)2級(jí)（高度威脅）[11]。

與美國和歐洲不同的是，我國仍舊缺乏一個(gè)完善的彎曲菌耐藥性監(jiān)測(cè)網(wǎng)絡(luò)。研究表明，部分地區(qū)分離的彎曲菌對(duì)環(huán)丙沙星的耐藥率已達(dá)到較高水平，如江蘇（85.2%）[12]、北京（87.5%）[13]、深圳（89.7%）[14]以及上海（97.4%）[15]。此外，一項(xiàng)對(duì)2008—2014年五個(gè)省市的彎曲菌耐藥性調(diào)查研究表明，肉雞與生豬中分離的彎曲菌對(duì)環(huán)丙沙星的耐藥率已達(dá)到100%，表明環(huán)丙沙星在這些地區(qū)已無法用于彎曲菌的治療[16]。

彎曲菌對(duì)氟喹諾酮類藥物的耐藥機(jī)制主要包括DNA促旋酶A亞基GyrA中氟喹諾酮耐藥決定區(qū)的位點(diǎn)突變以及由三部分組成的多重耐藥外排泵Cme-ABC [17,18]。CmeABC屬于耐藥結(jié)節(jié)化細(xì)胞分化家族（RND），包括一個(gè)胞質(zhì)融合蛋白（CmeA）、一個(gè)內(nèi)膜藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（CmeB）以及一個(gè)外膜蛋白（CmeC）[19]。作為彎曲菌的一種重要的外排泵，CmeABC可以泵出對(duì)細(xì)菌有害的各種物質(zhì)，其中包括多種類型的抗生素，如氟喹諾酮類、酰胺醇類、大環(huán)內(nèi)酯類、四環(huán)素類等[20]。近期，有研究發(fā)現(xiàn)了一種新型的CmeABC變異體，命名為RE-CmeABC [21]，通過基于局部比對(duì)算法的搜索工具（BLAST）發(fā)現(xiàn)，該變異體中的CmeB與野生型的CmeB只有80.5%～81.2%的氨基酸同源性，功能性研究發(fā)現(xiàn)其可以提高多種藥物的耐藥水平。尤為重要的是，RE-CmeABC不僅可以在藥物壓力下提高彎曲菌中GyrA中氟喹諾酮耐藥決定區(qū)位點(diǎn)的突變頻率，還可與gyrA突變協(xié)同介導(dǎo)對(duì)環(huán)丙沙星的高水平耐藥[最小抑菌濃度（MIC）≥ 128 mg·L-1] [21]。

自2014年首次發(fā)現(xiàn)RE-cmeABC以來，尚未有對(duì)其大范圍的流行病學(xué)調(diào)查報(bào)道。因此本研究調(diào)查了2014—2016年連續(xù)三年間我國的山東、上海和廣東等三個(gè)重點(diǎn)養(yǎng)殖區(qū)養(yǎng)殖場(chǎng)與屠宰場(chǎng)分離的RE-cmeABC陽性彎曲菌的流行與耐藥性現(xiàn)狀。

2. 材料與方法

2.1. RE-cmeABC陽性彎曲菌的分離鑒定、基因與耐藥突變篩選

本研究調(diào)查了2014—2016年連續(xù)三年間我國山東、上海和廣東等三個(gè)重點(diǎn)養(yǎng)殖區(qū)食品動(dòng)物源RE-cmeABC陽性彎曲菌的流行趨勢(shì)。我們復(fù)蘇了1088株彎曲菌（931 株結(jié)腸彎曲菌與157株空腸彎曲菌），其中，2014年的部分菌株先前已經(jīng)報(bào)道[21]。這些菌株由本實(shí)驗(yàn)室年度的動(dòng)物源細(xì)菌耐藥性監(jiān)測(cè)計(jì)劃采集，主要來源于豬和雞的腸內(nèi)容物、糞便和肉。首先，所有菌株劃線接種于MH（Sigma-Aldrich, Inc., USA）平板上，置于42 ℃微需氧條件下（5% O2, 10% CO2, 85% N2）生長18～24 h。隨后使用RE-cmeBF (5′-CGTATTGCACGATTATTTG GAC-3′)和RE-cmeBR (5′-ATCGTTATCAAACCCTCTAT GTGCC-3′)引物檢測(cè)RE-cmeB基因的存在。為了驗(yàn)證環(huán)丙沙星高水平耐藥是否與DNA解旋酶基因gyrA點(diǎn)突變和RE-cmeABC相關(guān)，運(yùn)用多重錯(cuò)配擴(kuò)增突變?cè)囼?yàn)聚合酶鏈反應(yīng)（multiplexmismatch amplification mutation assay-polymerase chain reaction, MAMA-PCR）以檢測(cè)gyrA單位點(diǎn)突變的流行情況（C-257 to T）[22]。

2.2. 藥物敏感性測(cè)試

對(duì)所有彎曲菌按照臨床試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)研究所（CLSI）M45 (2016)推薦的瓊脂稀釋法測(cè)定其對(duì)臨床常用抗菌藥物的敏感性，受試藥物如下：慶大霉素、紅霉素、環(huán)丙沙星、四環(huán)素和克林霉素[23]。CLSI未設(shè)定彎曲菌在瓊脂稀釋法測(cè)定中氟苯尼考的耐藥折點(diǎn)，因此在本研究中選擇參照NARMS推薦的標(biāo)準(zhǔn)展開試驗(yàn)[24]。空腸彎曲菌ATCC 33560作為質(zhì)控菌株。

2.3. 分子分型

97株攜帶RE-cmeABC的代表性菌株用于脈沖場(chǎng)凝膠電泳分型（PFGE），儀器型號(hào)為CHEF-DR III，試驗(yàn)方法參考彎曲菌PFGE標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行[25]。彎曲菌的總DNA經(jīng)SmaI酶切，沙門菌H9812作為Marker，經(jīng)XbaI酶切。凝膠電泳結(jié)果分析軟件為InfoQuest FP 4.5 (Bio-Rad Laboratories, Inc., USA)。

2.4. 數(shù)據(jù)收集與統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

流行病學(xué)數(shù)據(jù)整理與分析（包括95%置信區(qū)間計(jì)算）由Excel 2016 (Microsoft, USA)完成。RE-cmeABC、彎曲菌及MIC耐藥水平的單變量分析由Prism 7.0 (GraphPad Software, USA)完成，以P≤ 0.05為差異顯著。用比值比（OR）檢驗(yàn)RE-cmeABC陽性菌株數(shù)與各變量之間的相關(guān)性。用X2或Fisher精確檢驗(yàn)以判定上述比率之間的差異。

3. 結(jié)果與討論

3.1. 彎曲菌中RE-cmeABC的流行

1088株彎曲菌中共篩選到122株（11.2%, 95% CI:9.4～13.2）RE-cmeABC陽性菌株，所有菌株均分離自雞。122株陽性菌株包括111株（111/157, 70.7%, 95% CI:62.9～77.7）空腸彎曲菌與11株（11/931, 1.2%, 95% CI:0.6～2.1）結(jié)腸彎曲菌。RE-cmeABC陽性空腸彎曲菌的流行率顯著高于RE-cmeABC陽性結(jié)腸彎曲菌（70.7% vs.1.2%,P＜ 0.0001）[圖1（a）]，與2012—2014年報(bào)道的趨勢(shì)相似[21]。另外，RE-cmeABC在空腸彎曲菌中的陽性率由2012—2014年的34.7% (189/544) 上升至2014—2016年的70.7% (111/157) (P＜ 0.0001)，而結(jié)腸彎曲菌中的陽性率則由3.2% (47/1458)降至1.2% (11/931) (P＜0.0001)。上述結(jié)果表明RE-cmeABC的主要宿主已逐漸集中于空腸彎曲菌，空腸彎曲菌已成為RE-cmeABC的最主要攜帶種屬。由于家禽是空腸彎曲菌的主要宿主，這也在一定程度上解釋了RE-cmeABC為何均分離自雞[26]。由于RE-cmeABC陽性結(jié)腸彎曲菌數(shù)量較少，無法得到較為可信的統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果，因此我們重點(diǎn)比較不同年份間三地區(qū)RE-cmeABC陽性空腸彎曲菌的流行與耐藥特征。

圖1（a）顯示了RE-cmeABC陽性彎曲菌每年在三地區(qū)的整體流行情況。RE-cmeABC陽性菌株維持了一個(gè)較高的流行率，且在三年中并無顯著性變化（P ＞0.05）。廣東與上海地區(qū)的RE-cmeABC陽性菌株在三年間有略微上升[圖1（b）]；山東地區(qū)在2014年與2015年一直維持在較低的流行水平，2016年卻突然增加至76.1%(35/46, 95% CI: 61.2～87.4) [圖1（b）]。上述結(jié)果表明RE-cmeABC陽性菌株已在這些地區(qū)的畜禽中出現(xiàn)了較高的流行率，對(duì)公共衛(wèi)生帶來了潛在威脅。

圖1. 不同年份間三地區(qū)RE-cmeABC陽性菌株的流行率。（a）不同年份間三地區(qū)結(jié)腸彎曲菌與空腸彎曲菌中RE-cmeABC的流行率比較；（b）不同年份間三地區(qū)RE-cmeABC陽性空腸彎曲菌的流行率。誤差條代表95%置信區(qū)間（95% CI）。

3.2. 耐藥表型

藥物敏感性測(cè)試結(jié)果表明所有RE-cmeABC陽性空腸彎曲菌均對(duì)環(huán)丙沙星耐藥，其次為四環(huán)素（99.1%）、氟苯尼考（74.8%）、慶大霉素（45.9%）、克林霉素（13.5%）和紅霉素（11.7%）（表1）。為進(jìn)一步驗(yàn)證RE-cmeABC在空腸彎曲菌中的耐藥功能，我們補(bǔ)充了RE-cmeABC陰性彎曲菌的MIC結(jié)果以整合分析。RE-cmeABC陽性空腸彎曲菌與RE-cmeABC陰性空腸彎曲菌對(duì)氟苯尼考、克林霉素和紅霉素的耐藥率有顯著差異（P＜ 0.05），而對(duì)環(huán)丙沙星、四環(huán)素和慶大霉素的耐藥率無顯著差異（表1）。RE-cmeABC陽性菌株對(duì)氟苯尼考的耐藥率顯著高于RE-cmeABC陰性菌株（74.8% vs. 39.1%,P＜ 0.0001）。RE-cmeABC陽性菌株對(duì)氟苯尼考的相關(guān)性（OR = 4.61）顯著高于RE-cmeABC陰性菌株（表1）。酰胺醇類的氟苯尼考未被批準(zhǔn)用于臨床，而在獸醫(yī)臨床則被廣泛用于治療食品動(dòng)物疾病[27]。因此，在畜禽養(yǎng)殖過程中，氟苯尼考對(duì)RE-cmeABC陽性菌株的篩選可能具有重要作用。與氟苯尼考耐藥情況不同的是，RE-cmeABC陽性菌對(duì)克林霉素和紅霉素耐藥率的相關(guān)性則顯著低于RE-cmeABC陰性菌性（OR = 0.32和0.34）（表1）。盡管RE-cmeABC可以將菌株對(duì)紅霉素的耐藥水平提高四倍，但若沒有23S rRNA點(diǎn)突變存在的情況，仍不足以達(dá)到耐藥水平[28]。這表明RE-cmeABC不是空腸彎曲菌中對(duì)克林霉素和紅霉素的主要耐藥機(jī)制。

與野生型cmeABC相比，RE-cmeABC已被證明具有更強(qiáng)的泵出功能，可將氟喹諾酮類、酰胺醇類、大環(huán)內(nèi)酯類、四環(huán)素類等藥物泵出細(xì)胞[21]。盡管有無RE-cmeABC對(duì)環(huán)丙沙星、四環(huán)素和慶大霉素的耐藥率無顯著差異，然而，攜帶RE-cmeABC的菌株可以使環(huán)丙沙星與四環(huán)素對(duì)彎曲菌的MIC值分布趨于更高水平范圍（圖2），這與此前的研究結(jié)果一致[21]。有趣的是，對(duì)環(huán)丙沙星與四環(huán)素高水平耐藥（≥16倍MIC折點(diǎn)）的RE-cmeABC陽性菌株數(shù)顯著高于RE-cmeABC陰性菌株數(shù)（P＜ 0.0001和P= 0.0004）。上述結(jié)果同樣表明RE-cmeABC可以提高彎曲菌對(duì)抗生素的整體耐藥水平[21]。為了驗(yàn)證對(duì)環(huán)丙沙星的高水平耐藥機(jī)制，我們檢測(cè)了gyrA基因的單位點(diǎn)核苷酸突變（C-257 to T）。然而，所有的RE-cmeABC陽性菌株均存在C257T突變，佐證了RE-cmeABC可以促進(jìn)gyrA的突變頻率。目前尚未闡明的是藥物MIC水平是否與RE-cmeABC的表達(dá)水平有關(guān)，RE-cmeABC受其上游調(diào)控基因cmeR的負(fù)反饋調(diào)控，而cmeR則位于RE-cmeABC的啟動(dòng)子區(qū)域，是一種轉(zhuǎn)錄抑制因子[29]，RE-cmeABC引起菌株對(duì)抗生素高水平耐藥的機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

表1 RE-cmeABC陽性與陰性空腸彎曲菌的MIC特征

圖2. RE-cmeABC 陽性菌株與陰性菌株對(duì)環(huán)丙沙星與四環(huán)素的MIC分布比較。（a）空腸彎曲菌對(duì)環(huán)丙沙星的MIC分布；（b） 空腸彎曲菌對(duì)四環(huán)素的MIC分布。

3.3. 分子分型

本研究選取了97株RE-cmeABC陽性空腸彎曲菌代表株（上海37株、廣東25株和山東35株）用于PFGE分型分析。以80%的相似度劃分PFGE克隆亞型，RE-cmeABC陽性空腸彎曲菌共分為30個(gè)PFGE克隆型，包括13個(gè)獨(dú)特型和17個(gè)克隆簇（圖3）。上海地區(qū)克隆型最多，包括8個(gè)克隆簇和7個(gè)獨(dú)特型；其次為廣東地區(qū)，包括11 個(gè)克隆簇和6個(gè)獨(dú)特型；最后為山東，包括5個(gè)克隆簇。上海和廣東地區(qū)菌株除了A型（27.0%, 10/37）和W型（20%, 5/25）外無其他流行克隆，表明上海及廣東地區(qū)的RE-cmeABC陽性空腸彎曲菌仍以水平擴(kuò)散為主。相反，B型（65.7%, 23/35）是山東地區(qū)流行的最主要克隆，表明該地區(qū)主要以B型的克隆擴(kuò)散為主。另外，有三株R型菌株同時(shí)在上海和廣東被分離到，有3株U型菌株同時(shí)在廣東和山東被分離到。同時(shí)，分離自上海和廣東的3株菌表現(xiàn)出100%的同源性；而分離自上海和山東的4株L型菌株也表現(xiàn)出100%的同源性。上述結(jié)果表明，某些具有相同PFGE譜型的RE-cmeABC陽性空腸彎曲菌已在不同地區(qū)開始流行，且具有穩(wěn)定的水平傳播與適應(yīng)能力。

圖3. 2014—2016年97株RE-cmeABC陽性空腸彎曲菌代表株的PFGE分型。菌株經(jīng)由SmaI酶切。地區(qū)包括山東（SD）、上海（SH）與廣東（GD）。

4. 結(jié)論

本研究調(diào)查了2014—2016年連續(xù)三年間我國山東、上海和廣東等三個(gè)重點(diǎn)養(yǎng)殖區(qū)食品動(dòng)物源RE-cmeABC陽性彎曲菌的流行與耐藥性現(xiàn)狀。與2012—2014年的數(shù)據(jù)相比，雞源的RE-cmeABC陽性空腸彎曲菌逐漸超過結(jié)腸彎曲菌成為主要菌種。RE-cmeABC陽性菌株對(duì)氟苯尼考的耐藥率顯著高于RE-cmeABC陰性菌株，對(duì)環(huán)丙沙星與四環(huán)素的耐藥率則無顯著性差異。然而，攜帶RE-cmeABC的菌株可以使環(huán)丙沙星和四環(huán)素對(duì)彎曲菌的MIC值分布趨于更高水平范圍。另外，在上海與廣東及廣東與山東還分離到了相同PFGE譜型的RE-cmeABC陽性空腸彎曲菌。這些發(fā)現(xiàn)表明RE-cmeABC已在我國食品動(dòng)物源彎曲菌中廣泛流行，對(duì)公共衛(wèi)生安全具有重要威脅。

致謝

本研究得到國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（2017YFC1601501）、中國博士后科學(xué)基金（2018M631638）與國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31802247）資助。

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