白 璐 王 濤 張 喆 貢 雪 朱秀坤 姜彥多

（1 沈陽金域醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所有限公司，遼寧 沈陽 110000；2 中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院病理科，遼寧 沈陽 110000；3 中國人民解放軍第202醫(yī)院病理科，遼寧 沈陽 110000）

乳腺癌發(fā)病率位居女性惡性腫瘤首位，目前仍舊是世界性難題。轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致乳腺癌患者治療失敗的重要原因，預(yù)示著腫瘤患者的復(fù)發(fā)和較差的預(yù)后狀態(tài)[1]。閉合蛋白（Occludin）是一種緊密連接蛋白，在多種腫瘤中低表達(dá)[2-4]，并與惡性生物學(xué)行為轉(zhuǎn)移相關(guān)，然而目前尚無Occludin蛋白在乳腺癌中的報(bào)道。本文通過免疫組化方法，初步探索了Occludin蛋白在乳腺癌中的表達(dá)水平及在乳腺癌進(jìn)展過程中的潛在作用。

1 資料與方法

1.1 主要試劑：鼠抗人單克隆抗體購自美國Santa cruz公司（SC-434）；免疫組織化學(xué)染色試劑盒、抗原修復(fù)液、蘇木素染料、PBS緩沖液均購自北京中杉金橋公司。

1.2 患者情況：本實(shí)驗(yàn)選用中國醫(yī)科大學(xué)附屬第二臨床學(xué)院2011年～2014年在乳腺外科接受手術(shù)治療的乳腺浸潤性導(dǎo)管癌患者118例，患者年齡平均31～77歲中位年齡53歲，選用乳腺腺病患者20例作為對照組。其中乳腺浸潤性導(dǎo)管癌Ⅰ級3例，Ⅱ級98例，Ⅲ級17例。淋巴結(jié)情有轉(zhuǎn)移53例，沒有轉(zhuǎn)移65例。

1.3 免疫組織化學(xué)染色方法：組織切片為3 μm厚，切片烤片后再二甲苯中進(jìn)行切片浸泡脫蠟，隨后經(jīng)過酒精水化去除多余二甲苯；采用EDTA抗原修復(fù)液進(jìn)行高壓熱修復(fù)；采用過氧化氫溶液封閉內(nèi)源性過氧化物酶；Occludin蛋白的稀釋濃度為1∶100，每張切片滴加100 μL后4 ℃隔夜孵育；次日用二抗反應(yīng)40 min；DAB顯色劑現(xiàn)用現(xiàn)配，在顯微鏡下觀察顯色強(qiáng)度并及時(shí)終止反應(yīng)。蘇木素染核后用中性樹膠封片。

1.4 結(jié)果判讀：Occludin蛋白的陽性為細(xì)胞膜呈線條狀棕黃色染色。染色強(qiáng)度的評分采用色強(qiáng)度與面積的乘積分析。染色強(qiáng)度0分為無染色，1分為淡黃色，2分為深黃色，3分為棕褐色；染色面積1分為≤10%細(xì)胞膜陽性，2分為11%～50%細(xì)胞膜陽性，3分為51%～74%細(xì)胞膜陽性，4分為＞75%細(xì)胞膜陽性。乘積結(jié)果以0～3分為陰性，4～12分為陽性。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析：應(yīng)用統(tǒng)計(jì)分析軟件SPSS22.0進(jìn)行分析，陽性率之間比較使用卡方檢驗(yàn)，臨床病理指標(biāo)與Occludin蛋白之間的相關(guān)性采用斯皮爾曼等級相關(guān)，檢驗(yàn)水平為α=0.05，P＜0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 Occludin蛋白在乳腺正常組織中及乳腺浸潤性導(dǎo)管癌組織中的表達(dá)：Occludin蛋白的免疫組織化學(xué)染色結(jié)果見圖1。在118例乳腺浸潤性導(dǎo)管癌患者中有60例陽性，而在20例乳腺腺病患者中有18例陽性。Occludin蛋白在乳腺癌組織中的陽性率（50.84%）顯著低于癌旁組織(90.00%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.001，χ2=10.668）。

圖1 乳腺浸潤性導(dǎo)管癌組織中Occludin蛋白的免疫組織化學(xué)染色（PV，×200）

2.2 Occludin蛋白與乳腺浸潤性導(dǎo)管癌患者臨床病理指標(biāo)的相關(guān)性：以病理報(bào)告為準(zhǔn)統(tǒng)計(jì)臨床病理指標(biāo)，相關(guān)性分析結(jié)果見表1。結(jié)果發(fā)現(xiàn)Occludin蛋白與患者年齡、腫瘤最大徑、組織學(xué)分級、PR、Her2及Ki67無關(guān)。Occludin蛋白的表達(dá)與患者雌激素受體ER（P＜0.05）、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況（P＜0.05）、脈管癌栓（P＜0.05）呈負(fù)相關(guān)，Occludin蛋白表達(dá)缺失更多出現(xiàn)于淋巴結(jié)有轉(zhuǎn)移患者中（62.26% vs 38.46%）。見表1。

表1 Occludin蛋白與乳腺浸潤性導(dǎo)管癌患者臨床病理指標(biāo)的相關(guān)性[n（%）]

3 討論

在我國乳腺癌發(fā)病率位居女性惡性腫瘤首位，年新發(fā)病例約20余萬，死亡病例達(dá)6萬，成為嚴(yán)重威脅女性健康的重大疾病[1]。一旦腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移或早期入血變成循環(huán)的腫瘤細(xì)胞，術(shù)后就存在復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的可能，因此浸潤轉(zhuǎn)移是影響乳腺癌患者預(yù)后的關(guān)鍵因素。深入探討乳腺癌的轉(zhuǎn)移機(jī)制，探尋治療的新策略，將大大改善患者的預(yù)后。

細(xì)胞間緊密連接（TJ）表現(xiàn)出復(fù)雜的分子結(jié)構(gòu)，涉及ZO-1、Claudins、Occludin等的共同作用，為上皮和內(nèi)皮組織提供結(jié)構(gòu)完整性[5]。大量研究表明，Occludin蛋白在維持細(xì)胞屏障功能方面發(fā)揮著重要作用，參與調(diào)控肌動蛋白、維持細(xì)胞極性以及調(diào)控各種信號傳導(dǎo)途徑轉(zhuǎn)錄。Occludin 蛋白廣泛的生理學(xué)功能意味著其表達(dá)缺失會產(chǎn)生嚴(yán)重后果，緊密連接的失調(diào)參與了許多疾病的發(fā)生發(fā)展過程，是一種重要的病理生理學(xué)標(biāo)志[6]。研究中發(fā)現(xiàn)，Occludin的蛋白表達(dá)水平在食管癌[2]、子宮內(nèi)膜癌[3]、口腔鱗狀細(xì)胞癌[4]等多腫瘤組織中顯著下調(diào)。目前Occludin蛋白在乳腺癌組織中的研究鮮見報(bào)道，我們的研究結(jié)果表明：癌組織中Occludin 蛋白的表達(dá)水平顯著低于正常乳腺組織，提示Occludin蛋白在乳腺癌的發(fā)生過程中可能發(fā)揮著抑制性的作用，與大部分學(xué)者在其他腫瘤中的研究結(jié)論一致。

腫瘤細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)移是一個(gè)涉及多因素復(fù)雜的調(diào)控過程，腫瘤細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)移的前提是腫瘤細(xì)胞間連接減弱，單個(gè)腫瘤細(xì)胞從原發(fā)灶或轉(zhuǎn)移灶脫落進(jìn)入外周血循環(huán)形成循環(huán)腫瘤細(xì)胞，發(fā)生腫瘤播散或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[7]。Occludin蛋白作為細(xì)胞間連接的重要組成部分，可能參與調(diào)控了腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移過程。有研究表明Occludin蛋白的表達(dá)缺失介導(dǎo)了腫瘤的骨轉(zhuǎn)移[8]。在本研究中，我們通過分析臨床病理參數(shù)，證實(shí)了在乳腺浸潤性導(dǎo)管癌腫瘤組織中Occludin蛋白的表達(dá)與患者腫瘤轉(zhuǎn)移狀態(tài)呈顯著的負(fù)相關(guān)，與既往文獻(xiàn)報(bào)道的Occludin蛋白缺失促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移的結(jié)論一致。

綜上所述，Occludin蛋白在乳腺癌組織中低表達(dá)，且與患者ER狀態(tài)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、脈管癌栓密切相關(guān)，提示Occludin蛋白在乳腺癌的進(jìn)展過程中發(fā)揮著重要的作用，且可能參與調(diào)控了乳腺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。臨床檢測Occludin蛋白可能對患者預(yù)后做出更為精準(zhǔn)的預(yù)判。