吳侃 王浩然 吳玉森 蘭蘭 熊芬 謝林怡 王洪陽 關(guān)靜 王大勇 王秋菊

中國人民解放軍總醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科醫(yī)學部，國家耳鼻咽喉疾病臨床醫(yī)學研究中心，解放軍耳鼻咽喉研究所，聾病教育部重點實驗室；聾病防治北京市重點實驗室（北京100853）

雙側(cè)遲發(fā)型聽力損失是一種特殊的聽力損失類型，其預后較差，臨床表現(xiàn)多樣，病因復雜，血管、腫瘤、中毒、傳染病、全身伴隨疾病等因素可能與之相關(guān)[1]。此外，免疫因素和遺傳因素也不容忽視。近年來，NLRP3基因變異導致的雙側(cè)遲發(fā)型聽力損失以其特殊的炎性反應(yīng)臨床表現(xiàn)和顯著的遺傳學傾向受到越來越多的關(guān)注。

NLRP3基因（OMIM:*606416）全稱NLR family pyrin domain containing 3，編碼cryopyrin樣蛋白參與NLRP3炎性小體復合物的構(gòu)成，后者在炎癥、免疫反應(yīng)和凋亡的調(diào)控中發(fā)揮作用。該基因變異引起IL-1β的生成過多，從而啟動免疫級聯(lián)反應(yīng)、一系列炎性因子的釋放和細胞凋亡[2]，導致冷凍蛋白相關(guān)周期綜合征（cryopyrin-associated periodic syndrome，CAPS）。CAPS根據(jù)癥狀輕重分為3種亞型，他們之間互相重疊，構(gòu)成連續(xù)的疾病譜，大約42%～89%的患者可以出現(xiàn)進展性感音神經(jīng)性聽力損失(sensorineural hearing loss，SNHL)[3-5]。NLRP3 也被認為是DFNA34的致病基因[6]。本研究發(fā)現(xiàn)3例特殊臨床表現(xiàn)的雙側(cè)遲發(fā)型聽力損失病例，通過臨床資料的分析和新一代測序技術(shù)的檢測，明確為NLRP3基因變異相關(guān)性耳聾，并且回顧復習了52篇相關(guān)文獻，以尋求有效的藥物治療方案。

1 材料與方法

1.1 研究對象

病例1為2016年3月首診于我院耳內(nèi)科門診的雙側(cè)混合性聽力損失患者，出現(xiàn)反復發(fā)熱、皮疹、炎性標志物增高等特殊臨床表現(xiàn)，通過新一代測序技術(shù)明確為NLRP3基因變異相關(guān)性耳聾，其后回顧雙側(cè)遲發(fā)型聽力下降患者基因檢測結(jié)果，又發(fā)現(xiàn)2例攜帶該基因變異的病例。

1.2 研究方法

1.2.1 病史采集

回顧3個病例的病史采集表，內(nèi)容包括一般情況、現(xiàn)病史、既往史、個人史、出生史、家族史等，通過電話回訪對免疫系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、骨骼肌肉系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)、視覺系統(tǒng)等病史進行重點問診。

1.2.2 聽力學檢查

聽力學檢查主要包括：純音測聽（Astera headphone）、聲導抗檢查（GSI Tympstar）、言語識別率（解放軍總醫(yī)院自主研發(fā)）、畸變耳聲發(fā)射（MADSEN Capella 2）、聽性腦干反應(yīng)潛伏期（HIS 6376），以上儀器均定時按國際標準進行校準。依據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)1997年制定的標準進行聽力損失分級標準，按500、1000、2000、4000Hz四個頻率的平均聽閾進行分級：正常：≤25 dB HL；輕度：26～40 dB HL；中度：41～60 dB HL；重度：61～80 dB HL；極重度：≥81 dB HL。

1.2.3 其他輔助檢查

病例1輔助檢查包括血常規(guī)、尿常規(guī)、血生化、血沉（ESR）、C反應(yīng)蛋白（CRP）、自身免疫抗體、腦脊液檢查、眼底照相、角膜地形圖、光學相干斷層成像等；病例2輔助檢查包括血常規(guī)、血生化、ESR、CRP、凝血四項、自身免疫抗體、血清白介素測定、顱腦CT、顱腦MRI等；病例3僅接受了血清白介素測定檢查。

1.2.4 遺傳學檢測

簽署知情同意書后抽取病例1，及父母、胞妹4人，病例2及其父母3人，病例3及其父母3人，共10人的外周靜脈血5～10ml，提取DNA樣本，采用Illumina HiSeq2500平臺，對所有樣本進行全外顯子組測序(whole exome sequencing，WES)。目標區(qū)域平均測序深度108X，其中目標序列的96%深度達20X以上。對病例3家系其他成員（祖父母、叔姑等4人）進行候選基因變異位點的Sanger驗證。

2 結(jié)果

2.1 一般資料

病例1，女，9歲，雙耳漸進性聽力下降6年。既往史：出生后半年開始患兒反復出現(xiàn)夜間發(fā)熱伴紅色風團樣皮疹，其后聽力及視力逐漸下降，頭痛、發(fā)熱、皮疹、眩暈等癥狀反復發(fā)作，因分泌性中耳炎曾于外院行鼓膜切開置管術(shù)。言語發(fā)育正常，出生史無異常，無家族遺傳病史，有一胞妹無聽力及其他系統(tǒng)異常。治療：確診后長期于外院口服激素、曲尼司特、沙利度胺等藥物治療，病情反復。

病例2，男，32歲，雙耳漸進性聽力下降6年余、伴高調(diào)耳鳴。無眩暈等。有反復口腔潰瘍、蕁麻疹、濕疹、結(jié)膜炎病史，無反復發(fā)作的發(fā)熱等病史，否認關(guān)節(jié)病、肌無力等病史。否認耳毒性藥物及噪聲接觸史。否認家族遺傳病史，父母聽力均正常。患者聽力下降較快，于2019年開始佩戴助聽器。治療：按突發(fā)性耳聾收入我科治療2個療程，給予激素、鼠神經(jīng)生長因子、甲鈷胺、銀杏葉提取物、前列地爾等藥物，效果不明顯。

病例3，男，24歲，雙耳漸進性聽力下降4年。否認眩暈、口腔潰瘍、蕁麻疹、濕疹、關(guān)節(jié)病、肌無力等病史。有聽力下降家族遺傳史，祖父、父親均為20歲左右開始雙耳漸進性聽力下降，因個人原因其父親及祖父未行聽力學檢查。治療：于外院門診按突發(fā)性耳聾間斷給予甲鈷胺、胞磷膽堿、單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷等藥物治療，效果不明顯。

2.2 聽力學檢查結(jié)果及變化

病例1首診時為雙耳混合性聽力損失，46個月后低中頻骨導聽力明顯提高，左耳骨導平均閾值為23.75dB HL，右耳骨導平均閾值為21.25dB HL，轉(zhuǎn)變?yōu)殡p側(cè)傳導性耳聾。病例2和病例3為雙耳漸進性高頻下降型SNHL。首診時病例2和病例3聽力損失程度分別為中度和輕度。病例2在56個月內(nèi)左耳平均聽閾升高11.25dB，右耳平均聽閾升高21.25dB，聽閾變化速率左耳2.25dB/year，右耳4.25dB/year，聽力受損頻率從高頻累及全頻，言語識別率左耳下降16%，右耳下降24%；病例3在52個月內(nèi)左耳平均聽閾升高28.75dB，右耳平均聽閾升高15dB，聽閾變化速率左耳5.75dB/year，右耳3dB/year，高頻區(qū)域聽力下降明顯（圖1）。

2.3 其他輔助檢查結(jié)果

病例1有白細胞計數(shù)、CRP的反復升高，腦脊液檢查提示高顱壓，眼科檢查提示視神經(jīng)萎縮，其余輔助檢查均正常。病例2視力檢查、血常規(guī)、尿常規(guī)、血生化、凝血四項、紅細胞沉降率、自身抗體、白介素測定、內(nèi)聽道水成像等指標均正常。病例3白介素測定正常。

2.4 遺傳學檢測結(jié)果

WES結(jié)果顯示：病例1攜帶NLRP3(NM_001243133.1):c.907G＞A(p.D303N)，WES 未 發(fā)現(xiàn)其父母及胞妹攜帶該變異。病例2攜帶NLRP3(NM_001243133.1):c.2753G＞A(p.R918Q)，在其父母DNA樣本W(wǎng)ES結(jié)果中未發(fā)現(xiàn)該變異。病例3攜帶NLRP3(NM_001243133.1):c.1562T＞C(p.M521T)，在其父親DNA樣本W(wǎng)ES結(jié)果中發(fā)現(xiàn)該變異，母親未發(fā)現(xiàn)該變異，通過Sanger測序在其祖父DNA樣本中發(fā)現(xiàn)該變異，在其祖母、叔姑3人DNA樣本中未發(fā)現(xiàn)該變異（圖2）。

2.5 突變致病性分析

p.D303N、p.R918Q是各自病例家庭中的新發(fā)變異，且均為已報道的致病變異[6,7]。病例3所攜帶變異p.M521T既往未見報道，根據(jù)ACMG指南，該變異被判斷為疑似致病變異（PM1+PM2+PP1-moderate+PP2）：PM1：位于熱點突變區(qū)域，ESP數(shù)據(jù)庫、千人數(shù)據(jù)庫、EXAC數(shù)據(jù)庫中正常對照人群中未發(fā)現(xiàn)的變異；PM2：在ESP6500、千人、EXAC、GnomAD等數(shù)據(jù)庫中人群頻率均為0；PP1-moderate：突變與疾病在家系中共分離（在家系多個患者中檢測到此變異，升級為moderate）；PP2：對某個基因來說，如果這個基因的錯義變異是造成某種疾病的原因，并且這個基因中良性變異所占的比例很小，在這樣的基因中所發(fā)現(xiàn)的新的錯義變異。

圖1 NLRP3相關(guān)聽力損失病例首診與復診聽力圖Fig.1 Audiogram of first and second visit of NLRP3 related hearing loss cases

圖2 病例家系圖譜Fig.2 Pedigrees of cases in this study

3 討論

NLRP3基因變異引起的CAPS是罕見的遺傳性疾病，發(fā)病率在美國為1/100萬，在德國為3.43/100萬，在法國為1/36萬，不同性別與種族不存在差異[8,9]。CAPS包括三種亞型：癥狀最輕的家族性寒冷性自身炎癥綜合征（familial cold autoinflammatory syndrome，F(xiàn)CAS），表現(xiàn)為間歇性寒冷誘導的發(fā)熱、蕁麻疹樣皮疹、關(guān)節(jié)痛和結(jié)膜炎；中間表型Muckle-Wells 綜 合 征 (Muckle-Wells syndrome，MWS)，表現(xiàn)為皮疹、淀粉樣變性和高頻受累的SNHL，占青少年CAPS的三分之二[10]；癥狀最嚴重的新生兒起病多系統(tǒng)炎癥疾?。╪eonatal-onset multisystem in flammatory disease，NOMID），又被稱為慢性嬰兒神經(jīng)系統(tǒng)皮膚和關(guān)節(jié)綜合征（chronic infantile neurologic,cutaneous and articular syndrome，CINCA），癥狀包括嬰兒起病的進行性雙側(cè)SNHL、慢性無菌性腦膜炎、周期性發(fā)熱、頭痛、癲癇、結(jié)膜炎、葡萄膜炎和/或視神經(jīng)萎縮。本研究中病例1起病于新生兒期，臨床表現(xiàn)嚴重，多系統(tǒng)受累，反復發(fā)熱、皮疹、頭痛，漸進性聽力損失，視神經(jīng)萎縮等，根據(jù)臨床表現(xiàn)、輔助檢查和WES結(jié)果，診斷為CINCA。該病例長期伴有分泌性中耳炎，純音測聽提示混合性聽力損失，類似病例如首診于耳鼻喉科，專科醫(yī)師如缺乏對CAPS的足夠認識，可能出現(xiàn)漏診誤診。2017年Nakanishi等[6]鑒定NLRP3變異可以引起非綜合征型常染色體顯性遺傳性耳聾DFNA34。病例2和病例3均發(fā)病于20歲以后，臨床表現(xiàn)單一，雙耳聽力損失以高頻聽閾為主，逐漸累及低中頻，與文獻[6]報道相符，無明顯全身炎性反應(yīng)，無其他系統(tǒng)受累，結(jié)合WES結(jié)果，診斷為NLRP3相關(guān)的非綜合征型耳聾。這2例病例聽力閾值變化速率(病例2：左2.25dB/year，右4.25dB/year；病例3：左 5.75dB/year，右 3dB/year)高于文獻[6]報道的 0.9～1.5 dB/year，可能與環(huán)境等其他因素有關(guān)。

慢性耳蝸炎癥和Corti器的變性壞死是可能NLRP3變異相關(guān)耳聾的組織學病因，聽力損失較重的情況下也罕見前庭功能的損傷，據(jù)此，有研究[4]推測病變可能位于螺旋韌帶和血管紋病變；CAPS患者釓造影MRI成像呈現(xiàn)耳蝸基底部異常強化且IL-1抑制劑治療后強化減輕[5,6,11]，印證了耳蝸慢性炎癥導致聽力損失的假說。病例1炎性指標C反應(yīng)蛋白、纖維蛋白原、白細胞計數(shù)等指標隨發(fā)熱反復升高，提示活躍的全身炎性反應(yīng)，下一步需要補充血清白介素檢測和釓造影MRI成像來更好地評估全身和局部的炎性反應(yīng)。病例2和病例3炎性反應(yīng)指標和血清白介素檢測均正常，可完善釓造影MRI成像檢查來評估內(nèi)耳炎性反應(yīng)情況。與病例1相比，病例2和病例3為何只有內(nèi)耳局部受累而沒有全身炎性反應(yīng)？仍然需要更深入的研究。

迄今為止（2020年2月7日）共有230個NLRP3基因序列變異被發(fā)現(xiàn)，其中19個為CAPS相關(guān)致病變異，79個為CAPS相關(guān)的疑似致病變異，1個為DFNA34相關(guān)的致病變異（https://infevers.umai-montpellier.fr/web/search.php?n=4），這些變異在NLRP3基因示意圖上所對應(yīng)的位置及表型匯總詳見圖3。病例1和病例3所攜帶的變異均位于3號外顯子，病例2所攜帶的變異位于7號外顯子，不同變異位點引起的表型異質(zhì)性是NLRP3相關(guān)疾病的研究熱點：①不同變異位點造成耳聾的風險不同，如p.E311K、p.T348M變異攜帶者發(fā)生聽損的風險比p.V198M攜帶者高[4]；②不同變異位點造成聽力損失程度不同[12]，如p.T348M導致的聽力損失較重，p.A439V導致聽力損失程度相對較輕；③不同變異位點引起綜合征累及的器官數(shù)量也不同，如Caifeng Li等[13]報道，在15例出生2天至6歲的中國CAPS患兒中p.D305N攜帶者表現(xiàn)出多臟器受累的嚴重表型，而p.F311S攜帶者則沒有重要臟器的損傷；④不同變異位點導致外顯率不同，如一些p.V198M，p.Q703K和p.R488K攜帶者不發(fā)病或表現(xiàn)為輕微的遲發(fā)病變，顯示出較低的外顯率[14,15]。不同位點引起不同表型的具體機制仍然有待研究。

NLRP3基因的新發(fā)變異在CINCA患者中較為多見[16,17]，尚未在非綜合征型遺傳性耳聾患者中發(fā)現(xiàn)。本研究中病例1和病例2所攜帶的變異均為新發(fā)變異，這提示我們：對無家族遺傳史的雙側(cè)SNHL患者，特別是出現(xiàn)全身炎性反應(yīng)表現(xiàn)的雙側(cè)耳聾患者，應(yīng)重視對NLRP3基因變異的篩查。病例3攜帶變異c.1562T＞C，符合家系內(nèi)常染色體顯性遺傳模式，Sanger測序提示在家系其他成員中共分離，根據(jù)ACMG指南可得到3個中等強度證據(jù)，1個支持證據(jù)，判定為疑似致病變異，仍需要進一步功能研究，以獲得更充分的致病性證據(jù)。

圖3 已知變異在NLRP3基因上的分布圖Fig.3 Distribution of known NLRP3 variations

回顧文獻筆者發(fā)現(xiàn)：IL-1生成增多是CAPS和DFNA34共同病因，抗IL-1治療就成為了這類疾病治療的主要方案[18]。目前在歐美已批準上市用于臨床治療CAPS的藥物包括canakinumab（IL-1β單克隆抗體），anakinra（IL-1α和IL-1β受體拮抗劑），rilonacept（IL-1α和IL-1β誘導性受體），以上3種藥物對CAPS系統(tǒng)癥狀和全身炎性反應(yīng)都有著良好的緩解率，可以維持聽力穩(wěn)定。目前上述藥物在我國尚未批準上市，但國外已對3種藥物進行了療效、不良反應(yīng)等的臨床研究，為3種藥物的選擇提供了參考。筆者從患者年齡、經(jīng)濟承受能力、是否有中樞神經(jīng)系統(tǒng)的損害、對藥物注射的依從性等方面對3種藥物的特點歸納總結(jié)詳見表1?？梢钥隙ǖ氖菍LRP3相關(guān)性疾病的患者應(yīng)該早期干預以延緩聽力損失和預防聽力器官損傷。canakinumab作為一種長效制劑，患者只需要每8周接受1次皮下注射，依從性更好，有研究[12]顯示其對于炎性癥狀的總體緩解率高于anakinra（93%＞75%）；而anakinra體內(nèi)半衰期只有4～6小時，需要每天注射才能達到控制炎性癥狀的作用，但其對控制中樞神經(jīng)系統(tǒng)的炎癥效果較好[19]，適用年齡更小（年齡≥8月，體重≥10kg），緩解聽力損失效果更確切[11,20]，年花費較少。rilonacept注射頻率介于上述兩者之間，對聽力的作用不確切，使用限制較大（＞12歲）。3種藥物對CAPS都有著較輕的副作用：anakinra和rilonacept主要是每日皮下注射引起的局部皮膚反應(yīng)和輕度呼吸道感染[20,21]；canakinumab主要是眩暈，泌尿、呼吸、消化系統(tǒng)的輕度感染，頭痛等，少數(shù)患者因為上述不良反應(yīng)住院治療[22]；而研究較多的anakinra，一些病例[20]連續(xù)使用5年后仍然沒有見到嚴重的不良反應(yīng)?？笽L-1治療對CAPS患者系統(tǒng)癥狀和全身炎性反應(yīng)都有著良好的緩解率。癥狀日記得分、外周血（WBC）、血小板（PLT）、血清淀粉酶（SAA）、C反應(yīng)蛋白（CRP）、血沉（ESR）、聽力測試、視力及眼底檢查、膝關(guān)節(jié)CT、內(nèi)耳釓造影磁共振、腦脊液（WBC、白蛋白、腦脊液壓力）、內(nèi)毒素刺激體外培養(yǎng)的外周血單核細胞分泌IL-1β水平等均可以作為病情評估指標[6,11,20,22]。

NLRP3基因相關(guān)的聽力損失治療效果報道不多，有學者[4]認為這種慢性炎癥對聽力的損傷在早期是可逆的，如在本研究中，病例1首診時呈混合性聽力損失，其后長期使用激素等控制全身炎性反應(yīng)，46個月后復診低中頻骨導聽力恢復正常，存在感音神經(jīng)性聽力損失逆轉(zhuǎn)的可能，筆者推測在CINCA患者中通過藥物控制全身炎性反應(yīng)對聽力的維持甚至逆轉(zhuǎn)有著積極的作用。前瞻性隊列研究[6,11,20]結(jié)果顯示抗IL-1治療后，患者聽力提高或維持穩(wěn)定，但只有少數(shù)病例聽力可以恢復到正常，文獻曾經(jīng)報道過2名MWS成人患者[23,24]，2名MWS患兒[25,26]，和1名NOMID/CINCA青少年[27]達到了聽力學痊愈；對DFNA34型耳聾家系皮下注射anakinra3個月后聽力維持穩(wěn)定[6]，但對聽力長期的保護甚至逆轉(zhuǎn)作用仍需要長期觀察來證明?？傮w而言，聽力損失恢復程度與年齡相關(guān)，年齡較小聽力損失恢復更明顯[6,28,29]；不同的NLRP3變異位點也可能影響抗IL-1的療效：如Kuemmerle-Deschner等[12]對攜帶3種不同變異的MWS綜合征患者進行抗IL-1治療后聽力恢復情況的比較，發(fā)現(xiàn)攜帶p.E311K突變的MWS患者聽力提高程度較p.V198M或p.T348M攜帶者更為明顯。

表1 抗-IL-1藥物特點匯總表Table 1 Anti-il-1 drug characteristics

總之，本研究發(fā)現(xiàn)NLRP3基因變異可引起不同類型的雙側(cè)遲發(fā)型聽力損失，部分病例伴有全身炎癥反應(yīng)等特殊的臨床表現(xiàn)，聽力下降速度快，不同位點變異表型異質(zhì)性大，新發(fā)變異多見，增加了遺傳學診斷的難度，既往文獻顯示抗IL-1治療是有效的藥物治療方案。NLRP3相關(guān)性耳聾應(yīng)該得到耳鼻喉科醫(yī)師的重視。筆者推測該基因變異也可能是部分雙側(cè)突發(fā)性耳聾、梅尼埃、自身免疫性內(nèi)耳病等內(nèi)耳疾病的潛在致病基礎(chǔ)，我們應(yīng)借助新一代測序技術(shù)，在這類不明原因的雙側(cè)耳聾患者中開展NLRP3基因的篩查工作，并積極推動抗IL-1藥物在我國的上市和臨床應(yīng)用。