沈忠杰，李 亮，吳石奇，廖文波

1.廣西壯族自治區(qū)第二人民醫(yī)院脊柱外科，桂林 541002

2.遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院脊柱外科，遵義 563003

脊髓損傷（SCI）可造成損傷平面以下運(yùn)動和感覺功能不同程度喪失[1-2］，損傷后脊髓微環(huán)境的改變可導(dǎo)致軸突回縮及再生低下[3］。雖然SCI 不會顯著影響患者壽命，但可能導(dǎo)致患者產(chǎn)生生理和心理問題，高昂的治療費(fèi)用也給患者家庭及社會帶來沉重負(fù)擔(dān)[4］。SCI 的治療現(xiàn)仍是世界醫(yī)學(xué)難題[5］。目前干細(xì)胞移植治療SCI 已成為組織工程研究的熱點。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSC）具有來源豐富、易于培養(yǎng)擴(kuò)增、免疫排斥反應(yīng)弱且在特定條件下可向神經(jīng)細(xì)胞分化等優(yōu)點[6-12］，是SCI 研究中比較理想的種子細(xì)胞。本研究采用改良Allen 撞擊裝置制備T9SCI 模型后，立即通過微量注射將自體BMSC 移植到損傷處，觀察自體移植的BMSC 存活及向神經(jīng)細(xì)胞分化情況，為臨床應(yīng)用自體BMSC 治療SCI 提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物和試劑

雄性SD 大鼠36 只，由陸軍軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心提供，動物生產(chǎn)許可證號:SCXK（渝）2017-0002。隨機(jī)分為PBS 注射組（PBS 組）和BMSC自體移植組（BMSC 組），每組18 只。主要試劑:L-DMEM培養(yǎng)基（Gibco，美國）；胎牛血清（Hyclone，美國）；Ficoll-Paque 分離液（Pharmacia，美國）；胰蛋白酶、Hoechst33342、小鼠抗大鼠膠質(zhì)纖維酸性蛋白（GFAP）單克隆抗體（Sigma，日本）；兔抗大鼠微管相關(guān)蛋白2（MAP-2）多克隆抗體（Abcam，英國）；羊抗小鼠FITC-IgG 及羊抗兔TRITC-IgG（武漢博士德公司，中國）；抗大鼠CD29、CD45、CD90 單克隆抗體（BioLegend，美國）。

1.2 BMSC 的分離培養(yǎng)、鑒定及標(biāo)記

用3%戊巴比妥鈉（30 mg/kg）腹腔注射麻醉大鼠，用脫毛劑對大鼠后肢進(jìn)行脫毛處理，之后進(jìn)行嚴(yán)格消毒鋪巾。在無菌條件下，用裝有肝素鈉生理鹽水的注射器從雙側(cè)大鼠股骨處抽取骨髓液，得到混有肝素生理鹽水的骨髓液1.5 ～ 2.0 mL，之后加入10.0 mL PBS 混勻，1 000 r/min（離心半徑為15 cm）離心5 min 后棄上清；沉淀物用5 mL L-DMEM 液重懸后緩慢疊加到等量的Ficoll-Paque 分離液上層，2 000 r/min（離心半徑為6 cm）離心20 min；收集單核細(xì)胞層，即為BMSC。用含10%胎牛血清的L-DMEM 重懸后按3×104/mL 的密度接種于底面積為25 cm2的培養(yǎng)瓶中，細(xì)胞接近70%融合時進(jìn)行傳代。用流式細(xì)胞術(shù)檢測第4 代BMSC 細(xì)胞膜抗原CD90、CD29、CD45。待第4 代BMSC 接近80%融合時，按照謝興文等[13］的方法使用終濃度為5 μg/mL的Hoechst33342 避光孵育30 min，消化、離心后收集細(xì)胞，制成細(xì)胞密度為5×106/mL 的細(xì)胞懸液，4℃保存?zhèn)溆?。待建立SCI 模型（用時15 ～ 20 min）后立即進(jìn)行自體移植。

1.3 SCI 模型的建立及細(xì)胞移植

36只SD大鼠均用3%戊巴比妥鈉（30 mg/kg）腹腔注射麻醉，麻醉生效后俯臥位固定，術(shù)區(qū)消毒、鋪巾，以T9棘突為中心做1個長約4 cm的切口，暴露T8～10棘突和椎板，咬除T9棘突和椎板以暴露該節(jié)段的脊髓，采用改良Allen法[14］（40 g重物自5 cm高度垂直打擊）制備SCI模型。評價造模成功的標(biāo)準(zhǔn)[15］:大鼠雙后肢及軀體回縮樣撲動后雙后肢癱瘓，尾部出現(xiàn)痙攣性擺動，局部脊髓表面迅速水腫并淤血。

建立模型后，即刻使用微量注射器在BMSC 組大鼠損傷中心處微量注射細(xì)胞懸液5 μL，PBS 組在相同位置注射等量PBS。注射過程應(yīng)盡量緩慢。徹底止血后依次縫合肌肉、皮下、皮膚。術(shù)后2 周內(nèi)因協(xié)助排尿膀朧破裂死亡及術(shù)區(qū)感染死亡大鼠各2 只，均予補(bǔ)齊進(jìn)行實驗。在術(shù)后2、3、5 周采用 Basso-Beattie-Bresnahan（BBB）評分法[16］對大鼠雙后肢運(yùn)動功能恢復(fù)情況進(jìn)行評分。

1.4 脊髓標(biāo)本的制備

每組分別于移植后2、3、5周各取6只大鼠，用3%戊巴比妥鈉（30 mg/kg）腹腔注射麻醉，用300 mL預(yù)冷4%多聚甲醛經(jīng)左心耳灌注固定（灌注速度宜先快后慢），切取以T9損傷處為中心、向頭尾端共長1 cm 的脊髓，于4℃ 4%多聚甲醛中固定12 h 后進(jìn)行連續(xù)冠狀冰凍切片，片厚10 μm，每隔4 張取1張，每個標(biāo)本各留取40 張。切片直接貼于經(jīng)多聚賴氨酸處理過的載玻片上，置于暗盒-20℃保存。

1.5 損傷處BMSC 存活計數(shù)

BMSC 組每只大鼠移植后2、3、5 周各取5 張切片，在熒光顯微鏡下（400 倍），在每張切片的細(xì)胞移植區(qū)隨機(jī)選取2 個視野，計數(shù)每只大鼠10 個視野中被Hoechst33342 標(biāo)記的BMSC 總數(shù)，取其均值作為BMSC 組每只大鼠每個視野BMSC 存活數(shù)量。計數(shù)時以發(fā)藍(lán)色熒光、呈橢圓形或圓形、大小較均一的細(xì)胞核作為存活BMSC 的細(xì)胞核。

1.6 損傷處BMSC 分化情況及組織學(xué)變化

BMSC組每只大鼠移植后2、3、5周各取5張切片，室溫復(fù)溫10 min，用0.01 mol/L PBS清洗3次，每次5 min；加入體積分?jǐn)?shù)為3%的H2O2作用10 min，用0.01 mol/L PBS清洗3次，每次5 min；加入體積分?jǐn)?shù)為0.3%的TritonX-100 作用30 min，用0.01 mol/L PBS清洗3次，每次5 min；滴加10%正常山羊血清室溫封閉30 min，甩掉血清；分別滴加稀釋的小鼠抗大鼠GFAP 單抗（1∶400）及兔抗大鼠MAP-2 多抗（1∶200）一抗，4℃濕盒中過夜，用0.01 mol/L PBS 清洗3 次，每次5 min；分別滴加稀釋的羊抗小鼠IgG-FITC（1∶64）及羊抗兔IgG-TRITC（1∶64）二抗，濕盒中37℃孵育1 h，用0.01 mol/L PBS 清洗2次，每次5 min；用抗熒光衰減劑封片后，在熒光顯微鏡下觀察、拍照。細(xì)胞核發(fā)藍(lán)色熒光、胞質(zhì)發(fā)紅色熒光的細(xì)胞表示移植存活的BMSC 分化為神經(jīng)細(xì)胞，細(xì)胞核發(fā)藍(lán)色熒光、胞質(zhì)發(fā)綠色熒光的細(xì)胞表示移植存活的BMSC 分化為星形膠質(zhì)細(xì)胞。

于移植后2、3、5 周，取BMSC 組和PBS 組大鼠脊髓組織切片進(jìn)行HE 染色，觀察脊髓組織學(xué)變化。1.7 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 20.0 軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料以s 表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t 檢驗；以P ＜ 0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 BMSC 分離培養(yǎng)及鑒定

分離的細(xì)胞接種24 h 內(nèi)逐漸貼壁，72 h 后貼壁細(xì)胞增多，細(xì)胞形態(tài)以長梭形和多角形為主（圖1a）。隨著培養(yǎng)時間的延長，大部分貼壁細(xì)胞伸展開，邊緣伸出較長的突起，與周圍細(xì)胞相連接，至第5 天時細(xì)胞數(shù)量明顯增多，有形成細(xì)胞集落的趨勢，細(xì)胞形態(tài)以短梭形為主（圖1b）。流式細(xì)胞術(shù)檢測提示第4 代BMSC 細(xì)胞膜抗原CD90、CD29 表達(dá)陽性，CD45 表達(dá)陰性（圖2），表明分離培養(yǎng)的目標(biāo)細(xì)胞主要是BMSC。

圖1 BMSC 形態(tài)學(xué)觀察（×100）Fig. 1 Morphology of BMSC（×100）

圖2 流式細(xì)胞術(shù)檢測第4 代BMSC 表面標(biāo)志物的表達(dá)Fig. 2 Flow cytometry detecting expression of surface markers of 4th generation BMSC

2.2 移植后各時間點2組大鼠BBB 評分的比較

移植后2、3、5 周，BMSC 組大鼠BBB 評分均高于PBS 組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜ 0.05，表1）。

2.3 BMSC 在損傷處的存活和分化情況

熒光顯微鏡下可觀察到BMSC 組大鼠損傷處脊髓有不同數(shù)量Hoechst33342 標(biāo)記的細(xì)胞存活，移植后2、3、5 周BMSC 存活數(shù)量分別為40.58±6.67、25.32±4.34、7.56±4.13，其中2 周時細(xì)胞存活較多，5 周時細(xì)胞存活較少。移植后2、3 周時未檢測到BMSC 組大鼠損傷處移植存活的BMSC MAP-2及GFAP 免疫反應(yīng)陽性，而在5 周時檢測到少量移植存活的BMSC MAP-2 及GFAP 免疫反應(yīng)陽性（圖3）。

表1 移植后各時間點2組大鼠BBB 評分Tab. 1 BBB scores in 2 groups at each time point after transplantation

表1 移植后各時間點2組大鼠BBB 評分Tab. 1 BBB scores in 2 groups at each time point after transplantation

注:*與PBS 組比較，P ＜ 0.05。Note:* P ＜ 0.05，compared with PBS group.

圖3 移植后BMSC 在損傷處的存活和分化情況（×400）Fig. 3 Survival and differentiation of BMSC in SCI site after transplantation（×400）

2.4 2 組損傷處脊髓組織學(xué)變化

HE 染色結(jié)果顯示，PBS 組大鼠注射后2 周，損傷處脊髓組織結(jié)構(gòu)紊亂明顯，神經(jīng)細(xì)胞變性壞死，有較多炎性細(xì)胞浸潤；注射后5 周，脊髓有明顯的空洞及膠質(zhì)瘢痕形成。BMSC 組大鼠移植后2 周，損傷處脊髓組織結(jié)構(gòu)較規(guī)整，輕度充血水腫，神經(jīng)細(xì)胞渾濁但未見變性和壞死，有少量炎性細(xì)胞浸潤；移植后5 周，脊髓無明顯的空洞形成，有少量膠質(zhì)瘢痕形成（圖4）。

圖4 2 組大鼠損傷處脊髓組織學(xué)變化（HE染色，×200）Fig. 4 Histological changes of SCI site in 2 groups（HE staining，×200）

3 討 論

作為組織工程的種子細(xì)胞，BMSC 在細(xì)胞替代治療、基因治療以及組織器官的再造中具有重要的研究意義及臨床應(yīng)用價值，被廣泛應(yīng)用于組織工程研究中[17-18］。Hofstetter 等[19］于大鼠SCI 1 周后對損傷處脊髓進(jìn)行BMSC 移植，5 周后觀察到少許移植細(xì)胞表達(dá)神經(jīng)元標(biāo)志物NeuN，通過BBB 評分及組織學(xué)檢測證明BMSC 移植后可在一定程度上改善SCI 后截癱動物的預(yù)后。Huang 等[20］在大鼠SCI 1 周后于損傷處脊髓移植BMSC 和神經(jīng)生長因子混懸液，2 個月后觀察到植入損傷部位的BMSC 不僅能夠分化為神經(jīng)元和星形膠質(zhì)樣細(xì)胞，而且表達(dá)神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞的蛋白標(biāo)志物NeuN 和GFAP，并在SCI 部位形成細(xì)胞導(dǎo)向引導(dǎo)神經(jīng)纖維的再生，起到橋接作用，使再生的神經(jīng)軸突可以順利地通過損傷處。陳秉耀等[21］在大鼠損傷脊髓處注射異體BMSC，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在損傷處存活下來的細(xì)胞中有少量細(xì)胞表達(dá)神經(jīng)元標(biāo)志物MAP-2或星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物GFAP。高瑞等[22］將GFP 轉(zhuǎn)基因大鼠的BMSC異體移植于SCI 大鼠體內(nèi)，通過體內(nèi)示蹤和免疫熒光共定位發(fā)現(xiàn)，外源性BMSC 能聚集于SCI 部位并分化為神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)前體細(xì)胞。Ye等[23］的研究發(fā)現(xiàn)，在體外誘導(dǎo)BMSC 向神經(jīng)細(xì)胞分化后，再移植到大鼠損傷脊髓處，能促進(jìn)損傷脊髓修復(fù)。上述異體移植BMSC 的實驗研究表明，BMSC移植于中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷處后，部分移植細(xì)胞可存活并有少量細(xì)胞表達(dá)神經(jīng)元和星形膠質(zhì)樣細(xì)胞標(biāo)志物，并在一定程度上改善SCI情況。本研究在建立大鼠SCI模型后立即在損傷部位移植自體BMSC，移植后2、3及5周在損傷處脊髓均觀察到移植細(xì)胞存活，并且BMSC自體移植組BBB評分均高于PBS注射組，顯示部分移植的BMSC能在SCI后不利的局部微環(huán)境下存活，對SCI后運(yùn)動功能的恢復(fù)有一定作用。

本研究結(jié)果顯示，移植細(xì)胞于2周時存活較多、5 周時存活較少，提示自體移植的BMSC 在損傷脊髓內(nèi)存活的數(shù)量隨著時間的延長而減少。分析其原因:①標(biāo)記細(xì)胞的Hoechst33342 熒光染料隨著細(xì)胞分裂其熒光強(qiáng)度逐漸遞減或消失[24］；②SCI 2 周后，損傷處仍可見炎性細(xì)胞浸潤，而炎性細(xì)胞所分泌的一些有害細(xì)胞因子可使前期存活下來的BMSC死亡；③SCI 5 周時，損傷處及其附近形成少量的瘢痕組織及空洞，會造成局部血供不足，影響了BMSC 的存活；④術(shù)后大鼠進(jìn)食欠佳，至術(shù)后5 周時大鼠極為消瘦，營養(yǎng)不良亦會影響B(tài)MSC的存活。

在BMSC 移植后第5 周，采用免疫熒光染色法檢測到少量的移植細(xì)胞表達(dá)MAP-2 及GFAP，這說明移植細(xì)胞在局部微環(huán)境作用下，存活的BMSC 可向神經(jīng)元和星形膠質(zhì)樣細(xì)胞方向分化。但目前尚無證據(jù)證實這些分化細(xì)胞就是功能成熟的細(xì)胞。有學(xué)者認(rèn)為，MAP-2 及GFAP 等標(biāo)志物并非是神經(jīng)元和星形膠質(zhì)樣細(xì)胞的特異性標(biāo)志物，因為發(fā)育過程中的肌纖維和心肌細(xì)胞等非神經(jīng)細(xì)胞亦可表達(dá)這些標(biāo)志物[25］。目前的實驗研究大多停留在分化的BMSC具有神經(jīng)元或星形膠質(zhì)樣細(xì)胞的形態(tài)特征和表達(dá)神經(jīng)元或星形膠質(zhì)樣細(xì)胞的特異性標(biāo)志物這一層面，而缺少具有神經(jīng)元或星形膠質(zhì)樣細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和電生理學(xué)特征的證據(jù)。本實驗亦缺少這方面的證據(jù)，故不能證實這些分化細(xì)胞就是功能成熟的細(xì)胞。至于這些分化后的細(xì)胞能否真正有效地取代受損的神經(jīng)元、促進(jìn)神經(jīng)纖維的再生進(jìn)而促進(jìn)大鼠脊髓功能的恢復(fù)，需進(jìn)一步的實驗研究予以闡明。

目前，關(guān)于SCI 后BMSC 移植時機(jī)的選擇尚未達(dá)成共識。本研究選擇在SCI 后立即進(jìn)行BMSC 移植，能避免SCI 后一段時間進(jìn)行局部移植BMSC 再次麻醉的不良作用及再次手術(shù)的打擊，保證大鼠的存活率，利于后續(xù)實驗的進(jìn)行；且在SCI 后急性炎性反應(yīng)期進(jìn)行移植可能通過改善損傷后脊髓的內(nèi)部環(huán)境阻斷某些惡性循環(huán)，分泌有利神經(jīng)再生的因子，填充損傷脊髓區(qū)域的空腔，從而減輕SCI 早期出現(xiàn)的大量神經(jīng)細(xì)胞凋亡及減輕脊髓繼發(fā)性損傷，加速大鼠后肢功能的恢復(fù)[26-28］。在此基礎(chǔ)上，后續(xù)實驗擬對比SCI 后在損傷處脊髓即刻移植BMSC，與損傷后3、7 及14 d 移植BMSC 的結(jié)果進(jìn)行對比，進(jìn)一步摸索自體BMSC 移植治療SCI 的最佳時機(jī)。

本研究結(jié)果顯示，僅少量存活細(xì)胞分化為神經(jīng)細(xì)胞，而多數(shù)存活的細(xì)胞是否分化為其他細(xì)胞，并且這些細(xì)胞對損傷脊髓功能的修復(fù)起到促進(jìn)還是阻礙的作用，這些問題有待進(jìn)一步深入研究。本研究通過對細(xì)胞移植5 周后的損傷處脊髓組織進(jìn)行HE染色，觀察到BMSC 移植組損傷處脊髓有少量膠質(zhì)瘢痕組織形成，推測這些膠質(zhì)瘢痕組織可能是由BMSC 分泌的類膠原細(xì)胞外基質(zhì)形成的，提示存活下來的BMSC 可向結(jié)締組織方向分化，這一推測有待進(jìn)一步實驗研究予以證實。