樊龍星，張朝正，趙華

(天津科技大學(xué) 生物工程學(xué)院，工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點實驗室，天津市工業(yè)微生物重點實驗室，天津市微生物代謝與發(fā)酵過程控制技術(shù)工程中心，天津 300457)

紫甘藍原產(chǎn)于地中海沿岸，因其環(huán)境適應(yīng)能力強，現(xiàn)引入中國大范圍種植。它含有豐富的營養(yǎng)成分，因此具有多種保健功效。它具有抗氧化性[1-4]、維護肝臟[5,6]、提高記憶力[7]、抑菌、抗病毒抗癌、抗腫瘤等功效[8-13]。胡蘿卜也具有很高的營養(yǎng)價值、它具有調(diào)節(jié)人體免疫力、提高繁殖能力和促進人體生長發(fā)育等作用[14]。西紅柿成分豐富，功效多樣，具有降膽固醇、降低血脂、抗癌、抗腫瘤、降血壓等療效[15-17]。

植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)，屬于革蘭氏陽性菌株，是一類菌體具有彎桿狀、圓端短桿狀和鏈狀3種形態(tài)，且不產(chǎn)芽孢的兼性乳酸菌[18]。它可以利用葡萄糖、果糖、乳糖和木糖等作為原料進行代謝生長而產(chǎn)酸。其常見于泡菜[19]、酵素和酸奶等發(fā)酵的食品中，可以有效改善腸胃環(huán)境。

本文以紫甘藍、胡蘿卜和西紅柿為培養(yǎng)基進行植物乳桿菌的發(fā)酵產(chǎn)酸。以總酸為指標(biāo)進行單因素實驗和響應(yīng)面實驗，對植物乳桿菌的發(fā)酵條件進行優(yōu)化，為之后的飲料配制奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)：由泡菜中經(jīng)篩選、分離、鑒定所得。

1.1.2 材料

紫甘藍、胡蘿卜、西紅柿：天津濱海新區(qū)市售。

1.1.3 儀器設(shè)備

EX125DZH電子天平 奧豪斯儀器(常州)有限公司；Centrifuge 5418微量離心機 德國Eppendorf公司；ZWER-D2401控溫搖床 上海智能分析儀器制造有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 總酸測定

采用指示劑法檢測樣品中的總酸含量[20]，量取50 mL待測樣品于250 mL錐形瓶中，加入2滴酚酞指示劑?？偹岷康挠嬎惴椒ㄈ缦拢?/p>

式中：X為樣品中總酸含量(以乙酸計)，g/L；C為標(biāo)準(zhǔn)滴定氫氧化鈉溶液實際濃度，mol/L；V1為吸取滴定樣品的體積，mL；V2為滴定消耗的氫氧化鈉溶液的體積，mL；60為乙酸摩爾質(zhì)量數(shù)值，g/mol。

1.2.2 蔬菜汁配比的確定

將新鮮蔬菜處理后，按照料液比為1∶2的比例進行破壁，制作蔬菜汁，并按照不同的配比混合，紫甘藍汁∶西紅柿汁∶胡蘿卜汁為1∶1∶1、2∶1∶1、3∶2∶1、5∶2∶1、5∶3∶1、6∶3∶1、6∶4∶1。將混合蔬菜汁在85 ℃下滅菌15 min，待冷卻至30～35 ℃時，接入3%的植物乳桿菌的種子培養(yǎng)基，再發(fā)酵36 h。以植物乳桿菌發(fā)酵后的感官評價為指標(biāo)，確定3種蔬菜的最佳配比。

主要施工流程：新托架制作→掛設(shè)吊籃→定位鉆孔→清孔→錨固螺栓→安裝新托架→扶正并焊接原托架→拆除吊籃→恢復(fù)原狀。

1.2.3 單因素實驗

以總酸含量為指標(biāo)，分別以接種量(1%、2%、3%、4%、5%)、發(fā)酵溫度(25，30，35，40，45 ℃)和發(fā)酵時間(24，36，48，60，72 h)為影響因素，利用單因素實驗確定各因素的最佳實驗水平，為響應(yīng)面優(yōu)化奠定了基礎(chǔ)。

1.2.4 響應(yīng)面實驗

通過單因素實驗初步確定接種量、發(fā)酵溫度和發(fā)酵時間對總酸產(chǎn)量的影響。利用Box-Behnken進行實驗設(shè)計，試驗因素與水平見表1。

表1 Box-Behnken實驗因素與水平Table 1 Experiential factors and levels for Box-Behnken design

2 結(jié)果與分析

2.1 蔬菜汁配比的確定

以不同比例的3種蔬菜汁配制植物乳桿菌培養(yǎng)基的方案以及感官評分見表2。

表2 蔬菜汁比例和感官評分Table 2 Vegetable juice ratios and sensory scores

由表2可知，植物乳桿菌的最佳配比培養(yǎng)基為6∶3∶1，當(dāng)為此比例時，發(fā)酵后的感官評分最高，可達到74.37分，主要由于發(fā)酵后此產(chǎn)品香氣愉悅突出，顏色鮮艷，而且口感酸爽適宜。

2.2 蔬菜汁發(fā)酵條件的確定

2.2.1 接種量對發(fā)酵作用的影響

將接種量分別為1%、2%、3%、4%、5%的蔬菜汁培養(yǎng)基，在35 ℃下?lián)u床培養(yǎng)48 h，取部分發(fā)酵液離心過濾后，取上清液進行總酸檢測，實驗結(jié)果見圖1。

圖1 接種量對總酸產(chǎn)量的影響Fig.1 Effect of inoculation amount on total acid production

2.2.2 溫度對發(fā)酵作用的影響

接種4%的種子液于蔬菜汁培養(yǎng)基中，分別在25，30，35，40，45 ℃的條件下發(fā)酵48 h，將發(fā)酵液離心過濾，取上清液檢測總酸含量，實驗結(jié)果見圖2。

圖2 溫度對總酸產(chǎn)量的影響Fig.2 Effect of temperature on total acid production

由圖2可知，隨著溫度的升高，總酸含量出現(xiàn)先上升后下降的趨勢。溫度適合微生物代謝生長時，其代謝活動旺盛，總酸可得到積累。而溫度過高或者過低時，不適合微生物生長，都會影響總酸的產(chǎn)量。由圖2可知，35 ℃時總酸含量最高，即35 ℃為最佳發(fā)酵溫度。

2.2.3 發(fā)酵時間對發(fā)酵作用的影響

接種4%的種子液于蔬菜汁培養(yǎng)基中，在35 ℃的溫度下，分別發(fā)酵36，48，60，72，84 h，將發(fā)酵液離心過濾，取上清液檢測總酸含量，實驗結(jié)果見圖3。

圖3 發(fā)酵時間對總酸產(chǎn)量的影響Fig.3 Effect of fermentation time on total acid production

由圖3可知，隨著發(fā)酵時間的不斷延長，總酸含量在不斷增加。當(dāng)發(fā)酵時間為72 h時，總酸的含量達到11.87 g/L。當(dāng)發(fā)酵時間為84 h時，總酸含量達到11.92 g/L，僅增長了0.42%。因此，選擇最佳發(fā)酵時間為72 h。

2.2.4 響應(yīng)面實驗

結(jié)合以上單因素實驗結(jié)果，使用Design-Expert 10.0軟件對蔬菜汁發(fā)酵工藝進行響應(yīng)面設(shè)計優(yōu)化，以總酸產(chǎn)量為指標(biāo)，實驗設(shè)計與結(jié)果見表3。

表3 響應(yīng)面實驗的設(shè)計與結(jié)果Table 3 Design and results of Box-Behnken experiment

對表3進行回歸分析，得到的回歸方程為：

Y=-48.779+5.296X1+2.171X2+0.250X3+0.090X1X2-1.146×10-3X1X3-7.083×10-4X2X3-1.019 X12-0.034X22-1.395×10-3X32。

該回歸模型的方差分析和可信度分析結(jié)果見表4。

表4 回歸方程方差分析Table 4 Variance analysis of regression equation

注：P<0.05表示差異顯著；P<0.01表示差異極顯著。

由軟件Design-Expert 10.0擬合的方程可知，所有二次項前的符號皆為負數(shù)，即拋物線的開口向下，因此理論上應(yīng)存在極大值點。由方差分析表4可知，模型極顯著(P<0.0001)，失擬項不顯著(P=0.0653>0.05)，表明回歸方程擬合良好。且模型R2=0.9938，調(diào)整后的R2=0.9827，表明模型99.38%的變化均來源于自變量，實驗值與模型預(yù)測值接近，誤差較小，可用于本實驗總酸含量的分析與預(yù)測。且變異系數(shù)C.V.=1.24%，證明該實驗較穩(wěn)定。

由表4可知，各因素均對總酸產(chǎn)量具有一定的影響。其中，X1(接種量)、X2(溫度)、X3(發(fā)酵時間)、X12、X22和X32對總酸的產(chǎn)量具有極顯著影響(P< 0.01)，且由F值可得，各因素對總酸產(chǎn)量影響的主次：為接種量>發(fā)酵時間>溫度。在交互項中只有接種量(X1)和溫度(X2)之間具有極其顯著的交互作用(P=0.0007<0.01)，其他均不存在顯著的交互作用。

綜上所述，該模型可用于本實驗的分析與預(yù)測，由此得出各因素相互作用的響應(yīng)面分析圖，見圖4。

圖4 各因素交互作用對總酸產(chǎn)量的影響Fig.4 Response surface plots and contour plots for the interaction effects of different factors on total acid production

各因素之間的交互作用對總酸產(chǎn)量的影響見圖4，和方差分析的結(jié)果一致。使用軟件Design-Expert 10.0，得到該模型的極大值點，即蔬菜汁的最佳發(fā)酵條件：接種量為4.164%，溫度為35.886 ℃，發(fā)酵時間為77.108 h，得到最大總酸產(chǎn)量為11.244 g/L?？紤]實際實驗操作方便性，調(diào)整優(yōu)化發(fā)酵條件：接種量為4.2%，溫度為36 ℃，發(fā)酵時間為77 h，根據(jù)模型的回歸方程預(yù)測總酸產(chǎn)量為11.242 g/L。利用優(yōu)化后的實驗條件進行3次驗證實驗，得到的總酸產(chǎn)量為11.238 g/L，與模型預(yù)測值接近，說明該模型可很好地預(yù)測總酸的產(chǎn)量。

3 結(jié)論

本文先確定以紫甘藍∶胡蘿卜∶西紅柿為6∶3∶1的蔬菜汁比例為植物乳桿菌的培養(yǎng)基，再利用單因素實驗確定接種量、溫度和發(fā)酵時間分別對植物乳桿菌產(chǎn)酸的最優(yōu)條件，并在此基礎(chǔ)上，進行響應(yīng)面實驗，最終確定植物乳桿菌的最佳發(fā)酵產(chǎn)酸條件：接種量為4.2%，溫度為36 ℃，發(fā)酵時間為77 h，此時模型預(yù)測值為11.242 g/L。最終經(jīng)過驗證表明，在此最優(yōu)發(fā)酵條件的基礎(chǔ)上產(chǎn)酸總量為11.238 g/L，與模型預(yù)測值相近，則此模型可用于預(yù)測植物乳桿菌的最佳發(fā)酵條件，為進一步配制飲料奠定了基礎(chǔ)。