貼航，廖峰，薛圣然，張建嶺，蘇寧

(1.中國檢驗檢疫科學研究院，北京 100176；2.中檢科（北京）化妝品技術有限公司，北京 100176；3.國家膠類中藥工程技術研究中心，東阿阿膠股份有限公司，山東東阿，252201)

0 引 言

目前，驢乳以其營養(yǎng)價值和健康效益逐漸引起了人們的關注。與其他原料乳相比，驢乳最重要的特征是其營養(yǎng)成分與母乳類似，且有許多獨特的優(yōu)勢[1]。因此，在牛乳蛋白過敏的情況下，與其他反芻動物乳相比，驢乳是良好的嬰兒營養(yǎng)的替代品[1]。唐代孫思邈《千金要方》和明代李時珍《本草綱目》記載了驢乳的藥用價值，驢乳可治療糖尿病和“瘡”[2]。Hip?pocrates 和Pliny 也記載說明，驢乳可治療肝臟、傳染病、發(fā)燒和哮喘等疾病[3]。在古代，歐洲貴族也有利用驢乳洗澡和敷面以保持容顏和皮膚彈性的記載[4]?，F在藥理研究也表明，驢乳具有降血脂、抗氧化、抗腫瘤、抗菌、抗炎等活性[5]。但是驢乳發(fā)揮功效的分子基礎卻不是很明確。

目前對驢乳的研究主要集中在低致敏性臨床研究、泌乳期特征、化學成分分析、功能性研究等方面，但是缺乏對我國特有品種——德州驢驢乳全成分的系統研究。本文采用超高效液相串聯兩種不同質量分析器的高分辨質譜技術對驢乳粉中的主要營養(yǎng)成分進行定性定量的分析。不僅提高了對驢乳的認識，也為驢乳的深層次開發(fā)提供理論依據。

1 實 驗

1.1 材料與試劑

驢乳粉由東阿阿膠股份有限公司提供。

ACQUITY UPLC HSS T3 柱（Waters）；乙腈、甲醇、甲酸均為質譜純，購自J&K；2-氯苯丙氨酸（GL Biochem(Shanghai)Ltd.）。

1.2 儀器

LC-MS（Thermo，Ultimate 3000LC，Orbitrap Elite）。

2 方 法

2.1 樣品預處理

稱取約50 mg 樣品，加入到800 μL 甲醇溶液中，并加入10 μL內標（3.0 mg/mL，2-氯苯丙氨酸）。將其置于組織研磨儀中65 Hz研磨120 s。水浴超聲30 min而后置于4 ℃離心機中，12 000 rpm 離心15 min，吸取200 μL上清，轉入進樣小瓶中，待LC-MS檢測分析。

2.2 色譜條件

方法參考文獻[6]，略有改動。Waters ACQUITY UPLC HSS T3 柱(2.1 mm×100 mm，1.8 μm)；柱溫為40 ℃，流速恒定0.3 mL/min。流動相組成：A 相，水+0.1%甲酸；B 相，乙腈+0.1%甲酸。進樣量4 μL，自動進樣器溫度4 ℃。流動相梯度洗脫程序見表1。

表1 流動相洗脫程序

2.3 質譜條件

正模式：加熱器溫度300°C；鞘氣流速：45 arb；輔助氣流速：15 arb；尾氣流速：1 arb；電噴霧電壓：3.0KV；毛細管溫度：350°C；S-Lens RF Level,30%。

負模式：加熱器溫度300°C；鞘氣流速：45 arb；輔助氣流速：15 arb；尾氣流速：1 arb；電噴霧電壓：3.2 KV；毛細管溫度：350°C；S-Lens RF Level,60%。

掃描模式：一級全掃描(Full Scan，m/z 50～1000)與數據依賴性二級質譜掃描(dd-MS2，TopN=10)；分辨率：60,000(一級質譜)&17,500(二級質譜)。碰撞模式：高能量碰撞解離（HCD）。

3 結果與分析

應用多質量分析器組合式質譜儀對驢乳粉進行MSn級掃描，最終獲得驢乳粉主要代謝產物信息，形成樣本的營養(yǎng)成分譜庫。圖1 為驢乳粉的總離子流圖。根據Compound Discoverer 軟件處理得到Mass 數據，基于Metlin 進行全譜鑒定。共鑒定出87 種代謝物，詳細信息見表2。代謝物可以分為氨基酸及其衍生物、糖、有機酸、脂質等。

圖1 驢乳粉的總離子圖

3.1 氨基酸及其衍生物

從表2 可知，從驢乳粉中鑒定出16 種氨基酸及其衍生物，其中有6 種必需氨基酸。郭慧媛[7]和李宇[8]等報道，驢乳含有除色氨酸外的8 種必需氨基酸。但是，本試驗卻發(fā)現驢乳含有色氨酸，這與張巖春[9]等人的報道一致。值得注意的是，驢乳富含γ-氨基丁酸、?；撬帷⒔构劝彼?、酪氨酸等活性氨基酸。γ-氨基丁酸是哺乳動物體內一種神經抑質，可減緩機體氧化應激。γ-氨基丁酸可通過激活GSK-3β/Nrf-2 通路保護胰腺組織、減少胰島β細胞損傷和影響mTOR/S6K1/IRS-1 途徑提高肌肉對胰島素的敏感性，進而緩解2 型糖尿病患者的胰腺損傷和胰島素抵抗狀態(tài)[10]。?；撬崾菞l件性必需氨基酸，補充適量?；撬崮軌蚪档吞悄虿游镅撬剑纳铺悄虿“Y狀，且?；撬釤o任何毒副作用[11]。焦谷氨酸不僅具有胰島素樣作用，促進葡萄糖合成脂肪[12]；而且是皮膚的天然保濕因子，也對酪氨酸氧化酶等酶類的活性有一定抑制作用，阻止“類黑素”物質在皮膚中積沉，使皮膚亮白[12-13]。這些物質從分子角度揭示了驢乳防治糖尿病和具有美容養(yǎng)顏功效的分子機制，也為驢乳防治糖尿病機制提供新的思路。

表2 驢乳粉LC-MS全譜鑒定

（續(xù)表2）

（續(xù)表2）

3.2 糖類

因驢乳是目前發(fā)現的最接近母乳的天然替代物，因此國內外學者對驢乳中的乳糖及低聚木糖含量研究較多，但是對驢乳中其他糖類的表征研究較少[14]。Murgia 等[14]利用GC-MS 技術發(fā)現驢乳中含有果糖、葡萄糖、半乳糖、巖藻糖、帕拉金糖等糖類。本文利用ESI-多重質譜技術鑒定出驢乳含有6 種糖類，分別是木糖酸、己糖、糖醇、葡萄糖酸、海藻糖和N-乙酰-α-氨基葡萄糖-1-磷酸酯，首次在驢乳中鑒別出海藻糖。但是，海藻糖廣泛存在于細菌、真菌、酵母、植物和低等動物中，哺乳動物不具備海藻糖合成能力[15]，因此需進一步驗證驢乳中是否存在海藻糖。

3.3 有機酸類

乳制品存在有機酸是正常產奶動物的生化代謝過程，比如檸檬酸、馬尿酸、尿酸、乳清酸等。但是目前國內外學者對驢乳有機酸的研究較少。Murgia等[14]利用GC/MS 發(fā)現驢乳中含有乳酸、蘋果酸、琥珀酸、檸檬酸等11 種有機酸。本文利用LC/MS 技術檢測到驢乳含有乳酸、蘋果酸、檸檬酸、水楊酸、尿酸、馬尿酸等11 種有機酸。其中，尿酸、馬尿酸是首次在驢乳中發(fā)現的有機酸。尿酸作為乳中的抗氧化劑，可能對新生仔驢腸道黏膜具有局部保護作用[16]。檸檬酸能顯著抑制仔豬腸道乳桿菌屬和雙歧桿菌屬的增殖，但是低劑量的乳酸能顯著促進乳桿菌屬和雙歧桿菌屬的增殖，檸檬酸、蘋果酸、乳酸等均能有效抑制病原菌的增殖[17]。因此，乳中有機酸對調節(jié)飲用乳制品人群的腸道菌群平衡有著重要的意義。

3.4 脂質類

Martini[18]、Antonella[19]和豆智華[20]等學者對驢乳脂肪酸譜進行了廣泛的研究。相比于牛乳，驢乳中的脂類更接近母乳中脂類成分：必需脂肪酸的含量高，低飽和脂肪酸的含量低。通過LC/MS 檢測到驢乳粉共有46 種脂類物質，其中大多數的脂類是不飽和脂肪酸，且不飽和脂肪酸含量很高。驢乳粉中癸酸和月桂酸的含量較高，而棕櫚酸和硬脂酸的含量較低，這與Barlowska 等[21]的報道一致。利用LC/MS 首次在驢乳粉中檢出杜鵑花酸，杜鵑花酸對表皮葡萄球菌、頭狀葡萄球菌、皮屑芽孢菌等細菌有很好的抗菌效果[23]。杜鵑花酸也對治療色素沉著和痤瘡有很好的效果[22]，這從分子角度解釋了驢乳在美容和治療“瘡”方面的功效。

3.5 其他

利用多重質譜在驢乳粉中還鑒定出黃嘌呤、丙二醛、磷酸、尿囊素、香葉酸、肌肽、雄甾烯醇7 種成分。尿囊素是尿酸的衍生物，用途十分廣泛。在醫(yī)藥方面，尿囊素具有促進細胞生長、加快傷口愈合、軟化角質蛋白等生理功能，是皮膚創(chuàng)傷的良好愈合劑和抗?jié)兯巹?，對糖尿病、痤瘡均有較好的療效；在化妝品方面，尿囊素具有殺菌、抗氧化作用，能使皮膚保持水分，廣泛用于雀斑霜、粉刺液等產品[23]。肌肽可通過抗氧化、抑制端粒縮短和線粒體損傷、抗糖基化等作用抑制衰老[24]。肌肽也作為主要的抗氧化成分廣泛應用于化妝品中。也有研究表明[25]，肌肽可能通過降低左心室氧化應激和炎癥反應改善1 型糖尿病大鼠心功能障礙。這些成分的存在，從分子水平解釋了驢乳“防消渴”等功效。

4 結 論

利用HPLC 串聯多重質譜的手段鑒定出驢乳粉中的87 種代謝物，主要有氨基酸及其衍生物類、糖類、有機酸類、脂質類和其他5 大類。驢乳粉不僅含有6種必需氨基酸，而且含有γ-氨基丁酸、?；撬帷⒔构劝彼岬然钚园被?，從分子基礎上揭示了驢乳防治糖尿病和美容養(yǎng)顏的潛在功效。首次在驢乳粉中鑒定出海藻糖、尿酸和馬尿酸等成分。但還需進一步確認驢乳粉中海藻糖的存在。驢乳富含多不飽和脂肪酸，這為驢乳發(fā)揮降血脂等功效提供了物質基礎。杜鵑花酸的存在為驢乳美白、治療痤瘡等功效的分子機制研究提供了思路。驢乳也富含尿囊素和肌肽等生物活性成分，進一步從分子水平解釋了驢乳在美容養(yǎng)顏和防治糖尿病的機制。本研究對驢乳粉進行了較為系統的化學成分和生物活性成分研究，為闡明驢乳粉的化學組成及擴大其效用范圍提供了科學數據與理論依據。