張嶺，白天

（南陽(yáng)醫(yī)專第一附屬醫(yī)院，1.胸外科；2.檢驗(yàn)科 河南 南陽(yáng) 473000）

肺癌是全世界發(fā)病率與死亡率最高的惡性腫瘤之一[1]。I-II期肺癌為早期肺癌，以非小細(xì)胞肺癌多見(jiàn)，包括鱗癌、腺癌、大細(xì)胞癌。肺癌早期癥狀不明顯，多數(shù)患者確診時(shí)已為晚期，此時(shí)癌細(xì)胞已病變轉(zhuǎn)移，因此肺癌的早期診斷尤為重要。但因缺少敏感指標(biāo),目前臨床早期篩查并確診肺癌仍較困難[2]。肺癌的形成受原癌基因與抑癌基因表達(dá)的影響,與細(xì)胞凋亡及增殖異常有關(guān)[3]。不良飲食習(xí)慣、長(zhǎng)期吸煙等多種危險(xiǎn)因素均可激活原癌基因,使抑癌基因失活，癌基因突變導(dǎo)致惡性腫瘤形成[4]。程序化細(xì)胞死亡分子5（Programmed cell death 5，PDCD5）蛋白是近年新發(fā)現(xiàn)的一種新抑癌基因[5]。PDCD5蛋白可參與細(xì)胞凋亡調(diào)控過(guò)程,與肺癌形成、發(fā)展及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。且有研究顯示PDCD5蛋白在腫瘤細(xì)胞凋亡過(guò)程中起正調(diào)控作用[6]。本研究通過(guò)觀察PDCD5蛋白在I-II期肺癌患者血清中表達(dá)水平,分析血清PDCD5蛋白在臨床評(píng)估早期肺癌中的作用及與肺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2015年1月-2018年3月本院收治的肺癌患者52例作為觀察組。納入標(biāo)準(zhǔn)：⑴經(jīng)影像學(xué)、組織病理學(xué)檢查確診為肺癌[7]；⑵年齡30～65歲；⑶未出現(xiàn)轉(zhuǎn)移或出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，即TNM分期為I-II期或III-IV期[8]。排除標(biāo)準(zhǔn)：⑴嚴(yán)重心肝腎腦部功能不全；⑵慢性阻塞性肺病等其它肺部疾??；⑶嚴(yán)重貧血；⑷語(yǔ)言及智力障礙。將觀察組患者按照有無(wú)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移分為TNM分期為III-IV期的出現(xiàn)轉(zhuǎn)移組25例與TNM分期為I-II期的未轉(zhuǎn)移組27例。再根據(jù)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移部位個(gè)數(shù)分為轉(zhuǎn)移0個(gè)組27例，1個(gè)組18例，≥2個(gè)組7例。另選擇同期于本院體檢合格者52例作為對(duì)照組。觀察組年齡 31～65 歲，平均（44.72±2.85）歲，男性33例，女性19例，鱗癌21例，腺癌31例。對(duì)照組年齡 27～58 歲，平均（37.21±2.24）歲，男性 28 例，女性24例。觀察組與對(duì)照組患者年齡、性別基礎(chǔ)資料比較無(wú)明顯差異（P＞0.05）。本研究獲得醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有研究對(duì)象對(duì)本研究?jī)?nèi)容充分知曉，自愿簽署知情同意書。

1.2 方法 觀察組于入院第二天清晨，對(duì)照組于體檢時(shí)分別抽取靜脈血3ml，采用乙二胺四乙酸（Ethylenediamine tetraacetic acid，EDTA） 抗凝，經(jīng)TD4Y臺(tái)式低速自動(dòng)平衡離心機(jī) （上海盧湘儀，型號(hào)：TD4Y）離心分離血清，轉(zhuǎn)速設(shè)定 2500r/min，時(shí)間15min,并保存于-80℃冷凍待檢。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn) （enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）檢測(cè)兩組受試者血清PDCD5蛋白水平。ELISA試劑：PDCD5試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司，貨號(hào)：PROTO14737），內(nèi)含 PDCD5 標(biāo)準(zhǔn)品及稀釋液、PDCD檢測(cè)液及稀釋液、顯色劑、洗滌劑、終止劑、微孔板。緩沖溶液：磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline,PBS）（上海莼試，貨號(hào)：CS-0779S）。具體檢測(cè)方法：向PDCD5標(biāo)準(zhǔn)品中加入1mlPDCD5標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液,配制為質(zhì)量濃度40ng/ml的PDCD5標(biāo)準(zhǔn)溶液。將所得PDCD5標(biāo)準(zhǔn)溶液依次稀釋 4、8、16、32、64、128、256 倍。 分別取 PDCD5檢測(cè)溶液 A、B10μl與其對(duì)應(yīng)的稀釋溶液 990μl，充分混勻后稀釋為體積為8.5mlPDCD5檢測(cè)溶液A、B。用黑色馬克筆將微孔板編號(hào)，將PDCD5標(biāo)準(zhǔn)溶液孔編號(hào)為標(biāo)1～7，設(shè)一個(gè)空白對(duì)照孔，編號(hào)為空白，樣本孔按照待檢標(biāo)本數(shù)量從樣1開始編號(hào)。使用加樣槍向空白孔中加入PDCD5標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液100μl，作為空白對(duì)照。向標(biāo)1～7號(hào)孔中依次用加樣槍加入稀釋 4～256倍的 PDCD5標(biāo)準(zhǔn)溶液100μl。樣本孔中加入待測(cè)標(biāo)本量也為100μl。加樣完成后，將微孔板置于37℃恒溫水浴箱（蘇州力意達(dá)儀器科技有限公司，型號(hào)：ST-RT）內(nèi)孵育1h。孵育完成后用洗滌劑洗滌三次,每次洗滌后進(jìn)行拍板。向每個(gè)孔內(nèi)加入顯色劑后置于37℃電熱恒溫培養(yǎng)箱（青島聚創(chuàng)環(huán)保設(shè)備有限公司，型號(hào)：HN）內(nèi)反應(yīng)15～20min。取出微孔板后每孔加50μl終止劑。采用酶標(biāo)分析儀（北京普朗醫(yī)療，型號(hào)：DNM-9606）測(cè)定每孔吸光度,并計(jì)算待測(cè)標(biāo)本質(zhì)量濃度。所有抽血、血液分離與保存、ELISA試驗(yàn)操作均由本院檢驗(yàn)科醫(yī)師完成。

1.3 觀察指標(biāo) ⑴觀察組與對(duì)照組血清 PDCD5蛋白水平；⑵出現(xiàn)轉(zhuǎn)移組與未轉(zhuǎn)移組血清 PDCD5蛋白水平；⑶不同轉(zhuǎn)移部位個(gè)數(shù)組血清PDCD5蛋白表達(dá)水平。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS21.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,計(jì)量資料組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),組內(nèi)比較采用配對(duì)樣本t檢驗(yàn)。P＜0.05為比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 觀察組與對(duì)照組受試者血清PDCD5蛋白表達(dá)水平比較 觀察組患者血清PDCD5蛋白水平明顯低于對(duì)照組（P＜0.05），見(jiàn)表 1。

2.2 觀察組中出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移組與未轉(zhuǎn)移組血清PDCD5蛋白表達(dá)水平比較 觀察組患者中出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移組血清PDCD5蛋白水平低于未出現(xiàn)轉(zhuǎn)移組（P＜0.05），見(jiàn)表 2。

表1 觀察組與對(duì)照組受試者血清PDCD5蛋白表達(dá)水平比較

表2 觀察組中出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移組與未轉(zhuǎn)移組血清PDCD5蛋白表達(dá)水平比較

出現(xiàn)轉(zhuǎn)移組中 III、IV期患者血清 PDCD5蛋白表達(dá)水平分別為（0.63±0.28） ng/ml、（0.54±0.33）ng/ml。未轉(zhuǎn)移組中 I、II期患者血清 PDCD5蛋白表達(dá)水平 分別為（1.10±0.16）ng/ml、（0.98±0.27）ng/ml。

2.3 不同轉(zhuǎn)移部位個(gè)數(shù)組血清 PDCD5蛋白表達(dá)水平比較 觀察組患者中轉(zhuǎn)移0個(gè)組血清PDCD5蛋白水平明顯高于轉(zhuǎn)移1個(gè)組及轉(zhuǎn)移≥2個(gè)組（P＜0.05）；轉(zhuǎn)移1個(gè)組血清PDCD5蛋白水平高于轉(zhuǎn)移2 個(gè)組（P＜0.05），見(jiàn)表 3。

表3 不同轉(zhuǎn)移部位個(gè)數(shù)組血清PDCD5蛋白表達(dá)水平比較

3 討論

I-II期肺癌屬于早期肺癌，目前臨床治療早期肺癌主要采用化學(xué)治療方式殺傷腫瘤細(xì)胞,降低腫瘤細(xì)胞增殖速度[9]。有研究顯示，約1%早期肺癌患者通過(guò)化療能達(dá)到痊愈,但大多數(shù)患者不能被治愈，只能通過(guò)化療延長(zhǎng)生命[10]?；熓歉鶕?jù)肺癌患者不同癌變類型選擇不同化療藥物及采用不同方案進(jìn)行治療[11]。化療能夠殺傷腫瘤細(xì)胞，但同時(shí)會(huì)對(duì)正常細(xì)胞產(chǎn)生損害，長(zhǎng)期化療會(huì)出現(xiàn)貧血等不良癥狀。此外，若癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移侵犯其它組織器官，患者全身各部位均有可能出現(xiàn)不同臨床并發(fā)癥狀。癌細(xì)胞增殖速度加快，但受患者身體狀況影響，臨床化療速度跟不上癌細(xì)胞擴(kuò)散轉(zhuǎn)移速度,導(dǎo)致肺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移至更遠(yuǎn)的淋巴結(jié)、胸膜、腎臟、骨髓、消化道、心臟或神經(jīng)系統(tǒng)，整體治療療效降低。因此早期發(fā)現(xiàn)確診癌變并及時(shí)接受治療對(duì)患者而言尤為重要。

PDCD5是北京大學(xué)人類疾病基因研究中心發(fā)現(xiàn)的一種新型程序性細(xì)胞死亡相關(guān)基因[12]。PDCD5基因進(jìn)化保守，編碼蛋白由125個(gè)氨基酸組成，胞內(nèi)定位于細(xì)胞核[13]。重組人PDCD5蛋白可結(jié)合組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶Tip60及p53，致DNA受損，進(jìn)而促進(jìn)多種腫瘤細(xì)胞凋亡[14]。PDCD5的mRNA在人體多種組織內(nèi)均可表達(dá),胚胎期表達(dá)水平低于成人,在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)水平顯著低于正常細(xì)胞[14]。北京大學(xué)人類疾病基因研究中心利用熒光標(biāo)記的PDCD5蛋白進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)化試驗(yàn),結(jié)果表明人重組PDCD5蛋白可通過(guò)網(wǎng)格蛋白（Clathrin）非依賴型途徑將生物大分子攜帶進(jìn)細(xì)胞內(nèi),在體內(nèi)導(dǎo)入治療中起重要作用[15]。其原理是PDCD5蛋白可作為人細(xì)胞穿膜蛋白，發(fā)揮類似HIVTAT蛋白載體功能，并且有效避免TAT蛋白免疫原性干擾。該試驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)重組PDCD5蛋白可增強(qiáng)肝癌、乳腺癌、肺癌、胃癌、宮頸癌等多種腫瘤細(xì)胞對(duì)不同種類凋亡誘導(dǎo)劑的敏感性，表明PDCD5蛋白可增強(qiáng)化療過(guò)程中藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用[15]。同時(shí)，北京大學(xué)人類疾病基因研究中心體內(nèi)外試驗(yàn)表明,很多腫瘤細(xì)胞因PDCD5蛋白表達(dá)水平低下而對(duì)化療藥物敏感性降低，在給予人體補(bǔ)充PDCD5蛋白后可恢復(fù)腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性[16]。并且PDCD5只能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡,不具有誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡作用，這意味著PDCD5在體內(nèi)表達(dá)時(shí)不會(huì)出現(xiàn)凋亡誘導(dǎo)效應(yīng),表示PDCD5蛋白對(duì)正常細(xì)胞毒性較小，臨床應(yīng)用安全性會(huì)更高。PDCD5蛋白因其結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，無(wú)二硫鍵，無(wú)糖基，屬于人源性蛋白，易于產(chǎn)業(yè)化及大規(guī)模生物制藥的特點(diǎn),已成為目前臨床抗腫瘤的熱點(diǎn)研究對(duì)象[17]。

本研究結(jié)果顯示,觀察組肺癌患者血清PDCD5表達(dá)水平明顯低于對(duì)照組健康者,與北京大學(xué)人類疾病基因研究中心實(shí)驗(yàn)室的PDCD5在腫瘤細(xì)胞中低表達(dá)的結(jié)果相符。且觀察組中出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的肺癌患者血清PDCD5表達(dá)水平顯著低于未出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移患者。表明血清PDCD5表達(dá)水平可隨肺癌病情加重而降低。觀察組中出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移2個(gè)或2個(gè)以上部位患者血清PDCD5表達(dá)水平明顯低于出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移1個(gè)部位及未出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移肺癌患者,表明肺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移擴(kuò)散會(huì)影響血清PDCD5表達(dá)水平，其大小可隨轉(zhuǎn)移部位增加而降低。

綜上所述，血清PDCD5蛋白表達(dá)水平與 I-II期肺癌患者病情及癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移 擴(kuò)散程度密切相關(guān)，癌細(xì)胞擴(kuò)散轉(zhuǎn)移部位越多的患者血清PDCD5表達(dá)水平越低，血清PDCD5持續(xù)低表達(dá)可提示患者有癌轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)或已經(jīng)發(fā)生轉(zhuǎn)移。

通過(guò)對(duì)接受肺癌篩查的患者血清PDCD5表達(dá)水平的檢測(cè)，可評(píng)估患者是否癌變或癌變程度，以便及時(shí)給予針對(duì)性治療，提高臨床肺癌治療有效率。但本研究未能對(duì)PDCD5蛋白可增強(qiáng)化療過(guò)程中藥物殺傷腫瘤細(xì)胞的作用進(jìn)行探究，在后續(xù)研究中，還需采用PDCD5蛋白干預(yù)臨床給藥治療過(guò)程，以深入探討PDCD5對(duì)肺癌治療的影響。