周丹，何進(jìn)才，黃濤，李惠貞，張德明，谷大偉，羅勝華

（深圳市中醫(yī)院檢驗(yàn)科,廣東 深圳 518033）

新冠肺炎（corona virus disease 19,COVID-19）是由新型冠狀病毒[1，2]（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2,簡(jiǎn)稱新冠病毒）感染所致的肺部炎癥，人群普遍易感，自2019年12月在武漢被發(fā)現(xiàn)以來，迅速蔓延至全中國(guó)乃至全球，截至2月28日24時(shí)，31個(gè)?。ㄗ灾螀^(qū)、直轄市）以及新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)累計(jì)確診病例79251例[3]。新冠病毒是冠狀病毒β屬的新成員，屬于單鏈RNA病毒，可引起人類呼吸道感染，其基因特征與重癥急性呼吸綜合征（SARSr-CoV）和中東呼吸綜合征（MERSr-CoV）有明顯區(qū)別[4]。新冠肺炎診療方案（試行第六版）中提到，病原學(xué)證據(jù)是新冠肺炎診斷的金標(biāo)準(zhǔn)。臨床病例或疑似病例具備實(shí)時(shí)熒光RT-PCR新冠病毒核酸陽性或病毒基因測(cè)序與已知的新冠病毒高度同源,即為確診病例[4]。然而病毒測(cè)序?qū)?shí)驗(yàn)室技術(shù)、人員、設(shè)備等要求較高，因此熒光RT-PCR是目前新冠肺炎確診中使用最廣泛的方法?，F(xiàn)將實(shí)時(shí)熒光RT-PCR在本院病例檢測(cè)中的應(yīng)用情況及實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病例來源 選取2020年1月30日－2020年2月28日就診于本院發(fā)熱門診的患者 （包括發(fā)熱患者、湖北旅居者以及密切接觸者、外地返深人員）,共 1844 例。

1.1.2 試劑與儀器 試劑采用湖南圣湘生物科技有限公司生產(chǎn)的核酸提取試劑盒及新型冠狀病毒核酸檢測(cè)試劑盒。儀器使用安捷倫MX3000P熒光定量PCR儀和羅氏cobas z480熒光定量PCR儀。

1.2 方法

1.2.1 樣本采集 采用預(yù)約模式集中采樣,每天分兩個(gè)時(shí)段，上午和下午各一批，由發(fā)熱門診經(jīng)過生物安全培訓(xùn)合格并穿戴生物安全三級(jí)防護(hù)的醫(yī)生進(jìn)行采樣，每個(gè)病例采集口咽拭子。對(duì)多次檢測(cè)陰性或高度疑似的患者,由臨床醫(yī)生根據(jù)需要采集鼻咽拭子、肺泡灌洗液、痰液或肛拭子等。

1.2.2 樣本包裝、運(yùn)送及接收 樣本采集后放入帶螺旋蓋有墊圈、耐冷凍的病毒保存管，擰緊，管外貼條形碼。樣本管噴灑75%酒精消毒后放入密封袋，每袋限一份樣本。收集樣本后豎置放于樣本運(yùn)送盒,蓋緊蓋子，置于感染性樣本運(yùn)輸箱進(jìn)行運(yùn)輸，運(yùn)輸箱上標(biāo)明“新冠檢測(cè)”。樣本由經(jīng)過生物安全培訓(xùn)合格的專人送至實(shí)驗(yàn)室。接收人員用75%酒精噴灑樣本運(yùn)輸箱外表面后打開,再用75%酒精噴灑樣本運(yùn)送盒,最后取出樣本運(yùn)送盒放入生物安全柜中打開，核對(duì)樣本數(shù)量，檢查樣本有無泄漏。

1.2.3 樣本核酸提取及擴(kuò)增 采用磁珠法提取核酸RNA，試劑盒包含裂解液、磁珠結(jié)合液、磁珠洗滌液、磁珠、洗脫液等。核酸擴(kuò)增以新冠病毒開放讀碼框 1ab（open reading frame,ORF1ab）及編碼核衣殼蛋白（nucleoprotein,N）基因的特異性的保守序列為靶區(qū)域，設(shè)計(jì)雙靶標(biāo)基因。配以PCR反應(yīng)液，于熒光定量PCR儀上通過熒光信號(hào)的變化實(shí)現(xiàn)RNA的檢測(cè)。

1.2.4 結(jié)果解讀分析 實(shí)驗(yàn)采用的PCR檢測(cè)體系包含內(nèi)源性的內(nèi)標(biāo)引物（IC），通過檢測(cè)內(nèi)標(biāo)是否正常來監(jiān)測(cè)樣本采集、核酸提取及擴(kuò)增過程，避免假陰性結(jié)果。每批次實(shí)驗(yàn)中設(shè)置3個(gè)陰性質(zhì)控和1個(gè)臨界陽性質(zhì)控，隨機(jī)插入樣本中同步檢測(cè)，監(jiān)控實(shí)驗(yàn)結(jié)果是否有效。結(jié)果分析時(shí)應(yīng)先查看陰、陽性質(zhì)控品結(jié)果,陰性質(zhì)控品FAM、ROX通道均無Ct值或Ct＞40；陽性質(zhì)控品FAM、ROX通道及內(nèi)標(biāo)（HEX）通道Ct≤35，若質(zhì)控品的結(jié)果均滿足以上要求,此批次實(shí)驗(yàn)有效,否則實(shí)驗(yàn)無效,需重新檢測(cè)。

每個(gè)檢測(cè)樣本的結(jié)果需參照試劑盒說明書要求，結(jié)果分析如下：⑴對(duì)于FAM或ROX通道檢測(cè)到典型的S型擴(kuò)增曲線，且Ct≤40，可報(bào)告為樣本SARS-CoV-2核酸陽性。⑵對(duì)于FAM且ROX通道均未檢測(cè)到典型的S型擴(kuò)增曲線（No Ct），或Ct＞40，HEX通道有擴(kuò)增曲線，且Ct≤40的樣本，可判斷為樣本SARS-CoV-2核酸陰性。⑶對(duì)于FAM、ROX、HEX通道均未檢測(cè)到典型的S型擴(kuò)增曲線（No Ct）或 Ct＞40，表示樣本細(xì)胞含量太低或者有干擾物質(zhì)抑制反應(yīng)，該樣本檢測(cè)結(jié)果無效，需查找并排除原因，并對(duì)此樣本重新采樣進(jìn)行重復(fù)試驗(yàn)。

1.2.5 實(shí)驗(yàn)室生物安全防護(hù) 實(shí)驗(yàn)室生物安全管理嚴(yán)格按照國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)公告 （2020年第1號(hào)）規(guī)定要求[5]，新型冠狀病毒肺炎納入法定傳染病乙類管理，采取甲類傳染病的防控措施。在開展新冠核酸檢測(cè)前，根據(jù)《新型冠狀病毒感染的肺炎實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)指南》[6]、《2019新型冠狀病毒肺炎臨床實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)的生物安全防護(hù)指南》[7]等文件,我們對(duì)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行了充分的評(píng)估,精心設(shè)計(jì)檢測(cè)流程，做到每一個(gè)環(huán)節(jié)都有相應(yīng)的防護(hù)措施。

1.2.5.1 單位資質(zhì) 醫(yī)院為三級(jí)醫(yī)院,實(shí)驗(yàn)室為經(jīng)二級(jí)生物安全實(shí)驗(yàn)室備案和省級(jí)臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室備案,有生物安全三級(jí)實(shí)驗(yàn)室防護(hù)裝備儲(chǔ)備。

1.2.5.2 個(gè)人資質(zhì) 檢測(cè)人員取得市級(jí)以上病原微生物實(shí)驗(yàn)室生物安全培訓(xùn)證書和臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)技術(shù)人員上崗證書，并經(jīng)過新冠病毒核酸檢測(cè)培訓(xùn)合格并授權(quán)。

1.2.5.3 人員防護(hù) 樣本采集和核酸檢測(cè)人員采用三級(jí)生物安全防護(hù),樣本運(yùn)送及接收人員采用二級(jí)生物安全防護(hù)。

1.2.5.4 核酸檢測(cè) 核酸檢測(cè)每批次由兩名實(shí)驗(yàn)人員來完成，一名進(jìn)行核酸提取，一名進(jìn)行反應(yīng)體系的配制及核酸擴(kuò)增上機(jī)。核酸提取人員在清潔區(qū)穿戴三級(jí)生物安全防護(hù)用品，并由另一人員檢查，確保防護(hù)有效后進(jìn)入實(shí)驗(yàn)區(qū)進(jìn)行核酸提取。核酸提取全程在生物安全柜中操作，動(dòng)作應(yīng)輕柔緩慢，避免產(chǎn)生氣溶膠;標(biāo)本離心后將離心機(jī)轉(zhuǎn)子放置到生物安全柜中再打開;混勻器放置于生物安全柜中進(jìn)行震蕩混勻。生物安全柜內(nèi)放置小型垃圾桶，套黃色垃圾袋,并倒入適量2000mg/L有效氯消毒液，所有加樣后的槍頭等廢棄物均丟棄在含消毒液的垃圾桶中。

1.2.5.5 檢測(cè)后樣本保存及處理 核酸檢測(cè)陽性樣本送至市疾控復(fù)核；陰性樣本視為高危醫(yī)療廢物，放入高壓滅菌袋，經(jīng)121℃30min高壓滅菌后再按一般醫(yī)療廢物移出實(shí)驗(yàn)室。

1.2.5.6 醫(yī)療廢物處理 所有垃圾均視為有疑似新冠高危醫(yī)療廢物,固體廢物裝入黃色垃圾袋并用鵝頸結(jié)封口,套入高壓滅菌袋,在標(biāo)本制備區(qū)進(jìn)行121℃30min高壓滅菌后再沿一般醫(yī)療廢物通道移出實(shí)驗(yàn)室。核酸提取過程中產(chǎn)生的廢液,采用2000mg/L的有效氯消毒液浸泡過夜后,排入下水道。

1.2.5.7 實(shí)驗(yàn)室消毒 ⑴實(shí)驗(yàn)前,打開實(shí)驗(yàn)室空氣消毒機(jī)消毒1h。⑵每天新鮮配制消毒液，消毒液有效時(shí)間＜24h。⑶每次實(shí)驗(yàn)前后，用75%酒精擦拭生物安全柜，切忌不能噴灑。⑷實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，臺(tái)面用1000mg/L的有效氯消毒液或75%酒精擦拭消毒；地面采用1000mg/L的有效氯消毒液拖地消毒。⑸臺(tái)面地面消毒后，打開生物安全柜紫外消毒燈，消毒時(shí)間＞60min；打開實(shí)驗(yàn)室固定紫外燈,消毒時(shí)間＞60min。⑹消毒完畢后，再打開窗戶進(jìn)行通風(fēng)。⑺若檢測(cè)到陽性樣本,采用7.5%過氧化氫噴霧對(duì)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行終末消毒。⑻工作結(jié)束時(shí)將所有消毒措施記錄于實(shí)驗(yàn)室消毒登記表中。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析 本研究為觀察性研究，描述性報(bào)道事件計(jì)數(shù)，無統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 樣本檢測(cè)結(jié)果 受檢的1844例樣本中,其中咽拭子1836例,肺泡灌洗液4例，鼻拭子1例，肛拭子3例。新冠核酸陽性2例，均為咽拭子樣本，其中男性1例，女性1例，且都有新冠患者密切接觸史。Ct值分別為35.72和38.60。見圖1、圖2。

圖1 兩例陽性樣本內(nèi)標(biāo)擴(kuò)增曲線

圖2 兩例陽性樣本ROX及HEX通道擴(kuò)增曲線

2.2 可疑結(jié)果處理 1844例樣本共進(jìn)行了59批次實(shí)驗(yàn),在第50批次實(shí)驗(yàn)中有1例患者首次取樣結(jié)果FAM熒光通道有S型擴(kuò)增曲線，但 Ct＞40，擴(kuò)增曲線見圖3，結(jié)果可疑。遂與臨床醫(yī)生溝通后，讓患者留觀隔離，下午重新留取咽拭子及痰液樣本檢測(cè)，擴(kuò)增曲線見圖4，結(jié)果為陰性，最終患者解除隔離。

2.3 質(zhì)控失控處理 在第52批次實(shí)驗(yàn)中陽性質(zhì)控品ROX和FAM通道未出現(xiàn)S型擴(kuò)增曲線，HEX通道有S型擴(kuò)增曲線，陽性質(zhì)控品失控，顯示本批次實(shí)驗(yàn)無效，見圖5。將本批次樣本復(fù)測(cè)，復(fù)測(cè)后陰性、陽性質(zhì)控品在控，樣本結(jié)果為陰性，見圖6。

圖3 FAM通道有擴(kuò)增的疑似樣本擴(kuò)增曲線（典型S型擴(kuò)增曲線為陽性質(zhì)控品）

圖4 重留咽拭子及痰液復(fù)測(cè)擴(kuò)增曲線（S型曲線為陽性質(zhì)控品）

圖5 陽性質(zhì)控品ROX和FAM通道無S型擴(kuò)增曲線

圖6 復(fù)測(cè)后陽性質(zhì)控品及樣本結(jié)果

3 討論

實(shí)時(shí)熒光定量PCR被廣泛用于各種病原體的核酸檢測(cè)，具有敏感性高、特異性好等特點(diǎn)。一個(gè)月內(nèi),我院采用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR方法完成了1844例樣本的篩查，檢測(cè)出2例陽性樣本，且經(jīng)市疾控復(fù)核亦為陽性。2名核酸陽性患者在第一時(shí)間轉(zhuǎn)入了我市定點(diǎn)治療醫(yī)院，避免了擴(kuò)大感染。核酸檢測(cè)的開展，為大范圍的核酸篩查提供了便利，大大緩解了市疾控的檢測(cè)壓力,有效的縮短了就診患者檢測(cè)等候時(shí)間,實(shí)現(xiàn)了在接診6小時(shí)內(nèi)出具核酸檢測(cè)報(bào)告。

通過共59批次試驗(yàn)的檢測(cè)實(shí)踐，在核酸檢測(cè)的質(zhì)量控制及生物安全防護(hù)方面,我們也積累了以下經(jīng)驗(yàn)。在第50批次實(shí)驗(yàn)中有1例患者在首次取樣結(jié)果中FAM熒光通道有S型擴(kuò)增曲線,但 Ct＞40，我們立即與臨床溝通,將患者暫時(shí)作為疑似病例處理，進(jìn)行留觀隔離，重新采集咽拭子及痰標(biāo)本進(jìn)行復(fù)測(cè)，復(fù)測(cè)結(jié)果陰性，患者解除隔離。鑒于防疫工作的重要性,我們不放過任何一個(gè)可疑的結(jié)果,在不確定的情況下，建議對(duì)患者采取相應(yīng)的隔離、監(jiān)管措施。同時(shí)我們也對(duì)檢測(cè)結(jié)果負(fù)責(zé)，對(duì)有疑問的樣本使用不同廠家試劑或不同類型樣本進(jìn)行復(fù)核。在第52批次實(shí)驗(yàn)時(shí),陽性質(zhì)控品ROX和FA M通道未出現(xiàn)S型擴(kuò)增曲線，HEX通道有S型擴(kuò)增曲線,顯示此次實(shí)驗(yàn)無效。我們立即分析原因，最后發(fā)現(xiàn)是因?yàn)槭褂昧饲?天未使用完的反應(yīng)液,反應(yīng)液失效導(dǎo)致陽性質(zhì)控品ROX和FAM通道未出現(xiàn)S型擴(kuò)增曲線。遂將該批次樣本復(fù)測(cè)，復(fù)測(cè)后，陰、陽性質(zhì)控品均在控，樣本檢測(cè)結(jié)果核酸陰性。此次失敗提示我們反應(yīng)體系必須現(xiàn)配現(xiàn)用。

近期有媒體報(bào)道連續(xù)多次核酸檢測(cè)才檢出陽性的病例，對(duì)核酸檢測(cè)的結(jié)果提出質(zhì)疑。通過閱讀文獻(xiàn),我們知道核酸檢測(cè)結(jié)果與患者病程發(fā)展及用藥情況、采樣情況、樣本運(yùn)輸和保存、檢驗(yàn)技術(shù)方法等因素相關(guān)[8]。采樣部位不同，樣本病毒含量不同；不同病毒采樣管內(nèi)保存液體積、成分不同，直接影響核酸的提取效率；實(shí)驗(yàn)操作人員的技能，檢測(cè)方法、儀器的靈敏度等也會(huì)影響新冠核酸的檢出率。當(dāng)出現(xiàn)可疑結(jié)果時(shí)，我們首先從以上方面尋找原因，再及時(shí)與臨床的醫(yī)生溝通，結(jié)合患者臨床情況,選擇不同的樣本或者采用不同試劑和方法進(jìn)行復(fù)核。

新冠核酸檢測(cè)須在三級(jí)生物安全實(shí)驗(yàn)室或者二級(jí)生物安全實(shí)驗(yàn)室加三級(jí)生物安全個(gè)人防護(hù)下開展。每批次實(shí)驗(yàn)由兩人完成，在穿戴防護(hù)用品時(shí)可幫助檢查，確保安全有效。在結(jié)束核酸檢測(cè)工作后，對(duì)進(jìn)行新冠檢測(cè)操作的安全柜、臺(tái)面及實(shí)驗(yàn)室環(huán)境進(jìn)行有效的消毒;同時(shí)嚴(yán)格按照要求進(jìn)行防護(hù)裝備的脫卸，注意盡量避免碰到污染面，且脫卸的每一步后均應(yīng)有手消毒，防護(hù)服、醫(yī)用帽及醫(yī)用口罩等一次性物品不能重復(fù)時(shí)候用,全部脫卸完成后,進(jìn)行手衛(wèi)生及消毒。進(jìn)行嚴(yán)格分區(qū)的實(shí)驗(yàn)室，可在清潔區(qū)或緩沖區(qū)進(jìn)行三級(jí)生物防護(hù)品的穿戴，在緩沖區(qū)進(jìn)行帽子和口罩的脫卸，再進(jìn)行手衛(wèi)生及消毒。核酸檢測(cè)過程中產(chǎn)生的垃圾，均應(yīng)進(jìn)行高壓滅菌后才能沿一般醫(yī)療廢物通道移出實(shí)驗(yàn)室。

綜上,嚴(yán)格的質(zhì)量控制和有效的生物安全防護(hù)保證了新冠核酸檢測(cè)安全高效的開展,及時(shí)準(zhǔn)確的檢測(cè)結(jié)果為新冠肺炎的早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療提供精準(zhǔn)依據(jù)。