姚曦,何標

(1.安徽機電職業(yè)技術(shù)學(xué)院,安徽 蕪湖,241003;2.安徽師范大學(xué) 體育學(xué)院,安徽 蕪湖,241002)

阿爾茨海默病是一種多發(fā)于老年人群的神經(jīng)系統(tǒng)疾病[1]。被認為是伴隨機體衰老而引起的神經(jīng)退行性病變,按照發(fā)病病因的不同可分為遺傳性阿爾茨海默病和散發(fā)性阿爾茨海默病(sporadicAlzheimer's,sAD)。目前,sAD病因尚不清楚,普遍認為是遺傳和環(huán)境等因素共同作用的結(jié)果[2]。有研究表明,sAD發(fā)生的始動因素可能是胰島素抵抗或胰島素功能異常[3]。神經(jīng)退行性疾病可能始發(fā)于外周的胰島素抵抗,而sAD可能與腦內(nèi)胰島素代謝異常密切相關(guān)[4]。運動作為一種有效的干預(yù)手段,對IR和AD有積極的預(yù)防和緩解作用,但具體的分子機制尚不清楚,本實驗擬通過建立T2DM小鼠模型,探討8周的游泳運動對T2DM小鼠海馬Aβ42及生成相關(guān)蛋白含量的影響,及運動預(yù)防STZ致T2DM小鼠阿爾茨海默病樣變化的機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

購4周齡清潔級雄性C57BL/6小鼠,常規(guī)分籠飼養(yǎng),實驗小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后隨機分為正常對照組 (C,N=6)和糖尿病建模組(N=30),C組小鼠普通飼料喂養(yǎng)。糖尿病建模組小鼠進行6周的高脂膳食后,腹腔注射STZ(25mg/kg),連續(xù)5 d,以空腹血糖≥11.1 mmol/L為糖尿病小鼠標準[5]。把糖尿病小鼠隨機分為糖尿病安靜組(DC,N=6)和糖尿病運動組(DE,N=6)。

1.2 運動方案

DE組小鼠進行8周的無負重游泳運動,每周5次,每次持續(xù)60 min,游泳運動開始前進行3 d的預(yù)游泳實驗,分別15 min、30 min和45 min,第4 d開始正式游泳運動,持續(xù)8周,C組和DC組安靜飼養(yǎng)。

1.3 取材

小鼠末次運動結(jié)束后禁食12 h,脫頸處死實驗小鼠,取海馬,放入-80℃冰箱保存,待測。

1.4 測定方法

采用蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測海馬APP、PS1、BACE1和Aβ42蛋白相對表達水平,參照文獻[6]進行蛋白質(zhì)免疫印跡實驗。取適量海馬,按1∶7的質(zhì)量比加入混有PMSF的裂解液,均漿,離心,取上清,BCA試劑盒測定蛋白濃度。SDS-PAGE凝膠電泳,PVDF轉(zhuǎn)膜,脫脂牛奶封閉,加一抗(APP,CST,1∶1 000;PS1,Santa,1∶1 000;BACE-1,abcam,1∶1 000;Aβ42,CST,1∶1 000),搖床過夜,孵二抗,TBST搖床清洗,暗室ECL顯影,用AIpha成像系統(tǒng)曝光,ImageJ1.46進行灰密度值分析,將目的蛋白與內(nèi)參平均密度的比值作為目的蛋白相對表達水平。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計處理

用SPSS 18.0軟件對所獲數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析,所有數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差表示,組間比較用單因素分析法(One-Way ANOVA),事后檢驗采用LSD法。P＜0.05為差異具有顯著性,P＜0.01為差異具有極顯著性,運用Graph Prism 7進行圖像處理。

2 實驗結(jié)果

2.1 游泳運動對小鼠海馬Aβ42蛋白相對表達水平的影響

Western Blot實驗結(jié)果顯示,與C組(0.86±0.22)相比較,DC組小鼠海馬Aβ42相對表達水平(1.46±0.11)顯著增加(P＜0.01),與DC組相比,DE組小鼠海馬Aβ42相對表達水平(1.03±0.35)顯著降低(P＜0.05),如圖1-A所示。

2.2 游泳運動對小鼠海馬APP、BACE1和 PS1蛋白相對表達水平的影響

Western Blot實驗結(jié)果顯示,與C組(0.88±0.27)相比較,DC組小鼠海馬APP相對表達水平(1.30±0.15)顯著增加(P＜0.01),與DC組相比,DE組小鼠海馬APP相對表達水平(1.01±0.12)顯著降低(P＜0.05),如圖1-B所示。

Western Blot實驗結(jié)果顯示,與C組(0.89±0.22)相比較,DC組小鼠海馬BACE1相對表達水平(1.40±0.20)顯著增加(P＜0.01),與DC組相比,DE組小鼠海馬BACE1相對表達水平(1.07±0.18)顯著降低(P＜0.05),如圖1-C所示。

Western Blot實驗結(jié)果顯示,與C組(1.00±0.16)相比較,DC組小鼠海馬PS1相對表達水平(1.48±0.22)顯著增加(P＜0.01),與DC組相比,DE組小鼠海馬PS1相對表達水平(1.10±0.11)顯著降低(P＜0.01),如圖1-D所示。

圖1 各組小鼠海馬APP、BACE1、PS1和Aβ42蛋白相對表達統(tǒng)計(N=6)

3 結(jié)果分析

AD以細胞外老年斑、神經(jīng)纖維纏結(jié)和以膽堿能神經(jīng)元的變性和突觸的丟失為主要病理特征,起病隱襲,在以后的數(shù)年里緩慢發(fā)展為明顯的癡呆癥狀[2]。sAD發(fā)生的始動因素可能是胰島素抵抗或胰島素功能異常,腦胰島素抵抗可能是神經(jīng)退行性疾病的始動因素[4]。神經(jīng)元胰島素功能異常引起sAD葡萄糖代謝異常、線粒體功能障礙、ATP代謝減少等癥狀,導(dǎo)致海馬Aβ異常積聚等AD樣病理變化[7]。實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn),腹腔注射STZ誘導(dǎo)的T2DM小鼠海馬Aβ42蛋白相對表達水平顯著高于正常對照組,提示外周胰島素功能異常導(dǎo)致T2DM小鼠海馬發(fā)生AD樣病理改變,其機制可能是外周胰島素和葡萄糖穩(wěn)態(tài)的改變影響腦內(nèi)胰島素及受體的功能,導(dǎo)致海馬Aβ異常聚集[8]。自發(fā)性糖尿病大鼠海馬Aβ1-42質(zhì)量濃度也顯著增加[9]。高脂膳食導(dǎo)致的IR大鼠海馬Aβ蛋白相對表達水平顯著增加[10]。上述研究表明,外周胰島素抵抗導(dǎo)致小鼠海馬Aβ蛋白相對表達增多,出現(xiàn)AD樣病理改變。

Aβ細胞外異常聚集是AD的主要病因所在,其中以對神經(jīng)細胞毒性較大的Aβ42為主要成分[11]。Aβ是淀粉樣前體蛋白(Amyloid precursor protein,APP)在β-分泌酶和γ-分泌酶的作用下生成的[12]。APP首先在β-分泌酶的作用下,水解產(chǎn)生sAPPβ和膜結(jié)合的C末端含有99個氨基酸片段的C99,隨后在γ-分泌酶的作用下,C99被裂解為Aβ,即Aβ代謝途徑,BACE1和PS1分別是β-分泌酶和γ-分泌酶的主要成分[13]。本實驗結(jié)果顯示,與C組相比較,小劑量腹腔注射STZ誘導(dǎo)的T2DM小鼠海馬APP、BACE1和PS1蛋白相對表達水平均顯著升高,Aβ42蛋白相對表達水平顯著增加,提示T2DM小鼠海馬發(fā)生AD樣病理改變。IR和胰島素信號傳導(dǎo)障礙上調(diào)小鼠海馬和皮層APP蛋白相對表達水平,加速了Aβ的積聚速率,最終導(dǎo)致AD的發(fā)生[14]。對3 d齡新生幼鼠腦室注射STZ后發(fā)現(xiàn),腦室注射STZ顯著上調(diào)新生幼鼠顳葉和下丘腦APP mRNA表達水平,提示腦內(nèi)IR和胰島素信號傳導(dǎo)障礙上調(diào)APP mRNA表達水平[15]。而高果糖飲食誘導(dǎo)的IR大鼠海馬APP、BACE1及PS1蛋白相對表達水平顯著高于對照組,IR大鼠海馬APP異常裂解增多,Aβ生成增多[16]。而8月齡自發(fā)性糖尿病大鼠皮層APP、β-分泌酶蛋白相對表達水平顯著高于同齡對照組[17]。提示胰島素抵抗及胰島素信號傳導(dǎo)障礙導(dǎo)致Aβ生成相關(guān)蛋白表達增多。本實驗研究結(jié)果與上述研究結(jié)果相一致,研究結(jié)果提示胰島素抵抗及胰島素信號傳導(dǎo)障礙導(dǎo)致與Aβ生成相關(guān)的APP、BACE1和PS1等蛋白相對表達水平上調(diào),其機制可能是胰島素抵抗引起腦內(nèi)胰島素信號通路傳導(dǎo)障礙,上調(diào)APP、BACE1和PS1蛋白相對表達水平,最終加速了Aβ的生成[18]。

適宜的身體鍛煉有助于增強海馬功能,提高學(xué)習記憶能力[19]。每周一次的身體活動可以有效降低sAD的發(fā)病機率[20]。本實驗結(jié)果顯示,與DC組相比,DE組小鼠海馬APP、BACE1、PS1和Aβ42的蛋白相對表達水平顯著降低,證實適宜的運動能夠預(yù)防和緩解AD的發(fā)生。文獻[21]發(fā)現(xiàn),與安靜組相比,5周的跑臺運動顯著降低APP/PS1小鼠海馬APP蛋白相對表達水平和Aβ質(zhì)量濃度。Yu等[22]證實,對腹腔注射D半乳糖導(dǎo)致的AD大鼠進行8周的跑臺運動后發(fā)現(xiàn),運動組大鼠海馬APP、BACE1、PS1和Aβ42蛋白表達水平較安靜組顯著降低。上述研究結(jié)果提示,適宜的身體活動可能通過減少Aβ聚集,延緩AD的病理進程。其機制可能是運動通過抑制APP、BACE1和PS1蛋白相對表達水平,減少Aβ的生成[23]。側(cè)腦室注射STZ上調(diào)SD大鼠海馬Aβ42蛋白相對表達水平,對側(cè)腦室注射STZ的SD大鼠進行6周的自主跑輪運動后發(fā)現(xiàn),運動組大鼠海馬Aβ42蛋白相對表達水平顯著降低[24]。提示長期的運動可以抑制胰島素抵抗導(dǎo)致的海馬Aβ42的生成。文獻[25]證實6周的游泳運動降低T1DM大鼠海馬APP蛋白相對表達水平。本實驗結(jié)果也顯示,8周的游泳運動降低T2DM小鼠海馬APP蛋白相對表達水平,與上述研究結(jié)果相一致。針對運動對Aβ生成相關(guān)蛋白影響的研究也有不同的結(jié)論,不同的運動方式對CD1小鼠大腦皮層APP和PS1蛋白相對表達水平產(chǎn)生不同的影響,與同齡安靜組相比較,8周的自主跑輪運動上調(diào)了CD1小鼠大腦皮層APP和PS1蛋白相對表達水平,雖然16周的跑臺運動對CD1小鼠大腦皮層APP蛋白表達水平?jīng)]有產(chǎn)生影響,但降低CD1小鼠大腦皮層PS1蛋白相對表達水平[26]。本實驗發(fā)現(xiàn),8周的游泳訓(xùn)練降低T2DM小鼠海馬APP和PS1蛋白表達水平,導(dǎo)致研究結(jié)果不一致的原因可能是實驗動物的模型不同以及運動方式和動物年齡不同導(dǎo)致的。

4 結(jié)論

外周胰島素抵抗及信號傳導(dǎo)障礙導(dǎo)致海馬發(fā)生AD樣病例改變,主要表現(xiàn)為海馬Aβ42生成增多,Aβ生成相關(guān)蛋白APP、BACE1及PS1蛋白相對表達水平增多。而8周的游泳運動通過抑制海馬APP、BACE1和PS1蛋白相對表達水平,減少Aβ42的生成,推測運動可能通過抑制海馬Aβ生成相關(guān)蛋白表達水平,減少Aβ42的生成,最終達到延緩AD的目的。