陳恩就 周方聯(lián) 陳 勝 鄭 哲

肺癌的高度惡性生物學(xué)行為與肺癌組織中存在少量肺癌干細(xì)胞（Lung cancer stem cells，LCSCs）具有自我更新、多向分化潛能以及更強(qiáng)體內(nèi)成瘤能力密切相關(guān)[1-2]。二氫楊梅素（DMY）是一種從美國(guó)蔓藤中提取的黃酮醇類化合物，具有抗炎、抗氧化、抗菌、降壓和抗血栓形成等多種藥理學(xué)活性[3-4]。同時(shí)DMY還可抑制肺癌、肝癌和胃癌等多種惡性腫瘤生長(zhǎng)，對(duì)正常細(xì)胞影響較小，但DMY 是否對(duì)惡性腫瘤干細(xì)胞發(fā)揮抗腫瘤作用尚未有文獻(xiàn)報(bào)道[5-7]。本研究探討DMY 體外對(duì)LCSCs 的影響及其作用機(jī)制，報(bào)道如下。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 細(xì)胞株 人肺癌細(xì)胞株（PC9 和H1299）以及人正常肺上皮細(xì)胞株16HBE 購(gòu)于美國(guó)模式培養(yǎng)物保存中心（ATCC）。

1.2 藥品及試劑 DMY 購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司，批號(hào)SML0295；DMEM 高葡萄糖培養(yǎng)基和胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco 公司，批號(hào)61 870044；凋亡檢測(cè)試劑盒和細(xì)胞計(jì)數(shù)-8（CCK-8）試劑盒購(gòu)自上海Biyuntian公司，批號(hào)C0038；BCA 蛋白質(zhì)濃度測(cè)定試劑盒和RIPA 裂解物購(gòu)自北京中山生物工程有限公司，批號(hào)分別為C503061 和BDIT0037；SOX2、OCT4、ABCG2、Axin2、Survivin 抗體購(gòu)自Cell Signaling 公司，批號(hào)分別為 2748、2750、42078、5863、2803；Wnt1、cyclin D、Total-LRP6、phospho-LRP6、Total-STAT3、phos－pho-STAT3（Tyr705）、phospho-STAT3（ser727）、OCT4、C-Myc、Nanog 和β-actin 抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司，批號(hào)分別為L(zhǎng)M14876、LM11868、LBP77206、LBP69476、LM17883、LBP86316、LBP75572、LM17473、LM11591、LM12592、LM11530。

1.3 器材與設(shè)備 3111 型CO2培養(yǎng)箱購(gòu)自Thermo公司；RM2135 型切片機(jī)和HI1220 型烘片機(jī)購(gòu)自Leica 公司；BH2 型倒置顯微鏡購(gòu)自O(shè)lympus 公司；1681130-4B 型酶標(biāo)儀、Mini-Proten Tetra System 型電泳系統(tǒng)購(gòu)自Bio-Rad 公司。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng) PC9、H1299 及16HBE 細(xì)胞均運(yùn)用DMEM 培養(yǎng)液進(jìn)行培育，同時(shí)在DMEM 培養(yǎng)液中添加10%胎牛血清，細(xì)胞放置細(xì)胞培養(yǎng)箱環(huán)境中，使用含EDTA 胰蛋白酶消化，按照1：3 的比例進(jìn)行傳代。PC9 和H1299 細(xì)胞轉(zhuǎn)移到不含血清的MEM-F12 無酚紅培養(yǎng)基中以提取LCSCs，培養(yǎng)基中添加20ng/mL的bGFG、20ng/mL 的EGF 以及20mg/mL 的B27。

2.2 配制DMY 溶液 把100mg 的DMY 添加至10mL 的DMSO 內(nèi)，制備得到10mg/mL 的母液，隨后妥善放置4℃環(huán)境中，臨使用時(shí)將母液置于37℃水浴箱內(nèi)溶解后再添加DMEM 培養(yǎng)基稀釋成所需濃度，0.1%為DMSO 在DMY 溶液中濃度的上限，0.1%DMSO 對(duì)細(xì)胞活力無顯著抑制作用。使DMY 梯度濃度為5、10、25、50、100、200μmol/L，現(xiàn)配現(xiàn)用。

2.3 CCK-8 法檢測(cè)細(xì)胞活力 PC9 或H1299 細(xì)胞加入96 孔板中，每孔中分配2×104個(gè)細(xì)胞，藥物處理后放在37℃環(huán)境中4h，隨后將10μL 的CCK-8 試劑添加至每個(gè)96 孔板的孔中，借助酶標(biāo)儀對(duì)吸光度數(shù)值（OD）進(jìn)行檢測(cè)和記錄。

2.4 流式細(xì)胞分析細(xì)胞凋亡 將PC9 或H1299 細(xì)胞濃度設(shè)定成5×106/mL，細(xì)胞懸液通過PBS 完成3次清洗后放置在70%乙醇溶液中固定12h，離心后用PBS 液重懸細(xì)胞，在細(xì)胞中加入2.5μL annexin V試劑（20μg/mL）和50μL binding buffer 在室溫下避光反應(yīng)30min，再添加5μL PI 和100μL binding buffer 在室溫下避光反應(yīng)5min，借助流式細(xì)胞儀完成細(xì)胞凋亡檢測(cè)，該步驟反復(fù)進(jìn)行3 次，計(jì)算平均值。

2.5 干細(xì)胞培養(yǎng) PC9 或H1299 細(xì)胞經(jīng)不含血清培養(yǎng)基培養(yǎng)30 天后，在DMEM-F12 培養(yǎng)基中可見懸浮的干細(xì)胞球，將3 代以后的干細(xì)胞球經(jīng)胰酶消化和離心后獲得細(xì)胞懸液，在倒置顯微鏡下觀察并拍攝照片。

2.6 蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）細(xì)胞在細(xì)胞裂解液的作用下提取蛋白，總蛋白離心后收集上清液（1300rpm，4℃，10min），用BCA 蛋白檢測(cè)試劑盒測(cè)定蛋白濃度。將等量的蛋白（30g）進(jìn)行十二烷基硫酸酯-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），并將其電轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上，5%的BSA 阻斷硝酸纖維素膜后再通過I 抗、II 抗反應(yīng)，使用增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光試劑盒完成顯色、曝光等處理。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 16.0 統(tǒng)計(jì)軟件，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間差異通過ANOVA 方差Dunnett-t 方法分析，設(shè)立P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 DMY 對(duì)體外PC9 和H1299 細(xì)胞活力和凋亡的影響 將依次升高濃度的DMY（5～200μmol/L）分別作用肺癌PC9 和H1299 細(xì)胞及正常肺上皮16HBE細(xì)胞24h 后，CCK-8 法測(cè)定細(xì)胞活力，結(jié)果表明，較低濃度DMY（5～100mmol/L）對(duì)體外16HBE 細(xì)胞的生長(zhǎng)無明顯抑制作用，最高濃度（200mmol/L）的DMY作用16HBE 細(xì)胞后僅使細(xì)胞存活率從100%（對(duì)照組）降低到（68.71±11.83）%，100mmol/L 的DMY 對(duì)約85%的16HBE 細(xì)胞無明顯的毒性，表明濃度不超過100mmol/L 的DMY 對(duì)正常細(xì)胞生長(zhǎng)幾乎無影響，而PC9 和H1299 細(xì)胞對(duì)DMY 的敏感性明顯高于16HBE 細(xì)胞。CCK-8 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，（25～200mmol/L）DMY 可有效抑制體外肺癌細(xì)胞株P(guān)C9 和H1299活力，呈濃度依賴關(guān)系（見圖1）。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果示，DMY（25mmol/L）作用體外肺癌PC9 和H1299細(xì)胞24h 后，可顯著誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞凋亡，與對(duì)照組相比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）見圖2。

3.2 DMY 對(duì)體外PC9/LCSCs 和H1299/LCSCs 成球能力的影響 濃度為25μmol/L 的DMY 分別作用PC9/LCSCs 和H1299/LCSCs 24h 后，在光學(xué)顯微鏡下可以觀察到LCSCs 的成球能力顯著下降，表現(xiàn)為干細(xì)胞腫瘤球體積明顯縮小以及細(xì)胞球數(shù)量顯著減少，見圖3。

3.3 DMY 抑制LCSCs 的機(jī)制 應(yīng)用Western blot法測(cè)定兩種LCSCs 干細(xì)胞參與自我更新轉(zhuǎn)錄因子（Nanog、OCT4 和SOX2）以及Wnt/β-catenin 通路相關(guān)蛋白（β-catenin、Wnt1、p-LRP6、Axin2、Survivin、cylin D、p-STAT3（Tyr705）和p-STAT3（ser727）表達(dá)量。Western blot 結(jié)果顯示，DMY 顯著降低PC9/LCSCs 和H1299/LCSCs 中Nanog、OCT4 和SOX2 蛋白的表達(dá)（見圖4A）。DMY 作用后PC9/LCSCs 和H1299/LCSCs β-catenin、Wnt1、Axin2、Survivin 和cyclin D 表達(dá)均下調(diào)，另外DMY 作用后LCSCs 中STAT3 在Tyr705 位點(diǎn)的磷酸化程度減少，而DMY不影響STAT3 在Ser727 位點(diǎn)的磷酸化水平，見圖4B。

圖1 CCK-8 法測(cè)定DMY 對(duì)體外肺癌PC9 和H1299 細(xì)胞及16HBE 細(xì)胞活力的影響

圖2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)PC9 和H1299 細(xì)胞凋亡

圖3 光學(xué)顯微鏡下觀察PC9/LCSCs 和H1299/LCSCs 的形態(tài)注：DMY 為二氫楊梅素；DC9 為人肺癌PC9 細(xì)胞株；H1299為人肺癌H1299 細(xì)胞株；LCSCs 為肺癌干細(xì)胞

圖4 Western bolt 法測(cè)定

4 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，低濃度（5～100μmol/L）的DMY 對(duì)體外16HBE 細(xì)胞生長(zhǎng)無明顯抑制作用，但PC9 和H1299 細(xì)胞對(duì)DMY 的生長(zhǎng)抑制效應(yīng)更加敏感，25μmol/L 的DMY 即可有效抑制體外PC9 和H1299細(xì)胞生長(zhǎng)，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，表明DMY 對(duì)肺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用是有效和安全的，與既往文獻(xiàn)所報(bào)道的DMY 對(duì)小鼠肝臟無明顯損傷作用結(jié)果相仿[7]。隨后本研究分選出OCT4 及SOX2 陽(yáng)性表達(dá)肺癌細(xì)胞，并經(jīng)干細(xì)胞表型實(shí)驗(yàn)鑒定其為L(zhǎng)CSCs。DMY 作用后可以抑制體外LCSCs 懸浮細(xì)胞球的體積和數(shù)量，同時(shí)抑制LCSCs 中干細(xì)胞標(biāo)志物（Nanog、OCT4 和SOX2）的表達(dá)，這些數(shù)據(jù)有力地支持了DMY 可以作為一種有效的LCSCs 抑制劑。

許多分子信號(hào)通路有助于維持LCSCs 的特性，Wnt/β-catenin 信號(hào)通路及其下游信號(hào)因子參與細(xì)胞增殖、存活、凋亡、侵襲、血管生成、轉(zhuǎn)移等多種細(xì)胞生理學(xué)過程[8-10]；Wnt 通過配體與其各自受體的相互作用介導(dǎo)Fzd 激活，F(xiàn)zd 是導(dǎo)致LRP5/6 磷酸化最明確的激活因子，磷酸化LRP5/6 可提高DVL 和AXIN之間的相互作用，導(dǎo)致β-catenin 同源二聚并易位到細(xì)胞核，最終啟動(dòng)Wnt/β-catenin 信號(hào)通路靶基因的轉(zhuǎn) 錄，如CD44、cyclin D、c-Myc、Survivin 和fibronectin 等[11-13]。Nanog 與β-catenin 協(xié)同維持細(xì)胞多能性和自我更新，在肺癌細(xì)胞中下調(diào)Nanog 后，細(xì)胞增殖、集落形成和遷移減少[14]。鑒于Wnt/β-catenin 通路對(duì)腫瘤發(fā)生的顯著作用以及LCSCs 干性維持等方面的作用，本研究探討DMY 對(duì)LCSCs Wnt/βcatenin 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的影響。Western blot 結(jié)果表明，DMY 對(duì)體內(nèi)外LCSCs 中Wnt/β-catenin 信號(hào)通路具有明顯抑制作用，同時(shí)減少其下游靶基因cyclin D和Survivin 表達(dá)，這可能在DMY 調(diào)節(jié)體內(nèi)外肺癌細(xì)胞增殖和凋亡過程中發(fā)揮一定作用。既往研究表明，激活的β-catenin 高度參與STAT3 在基因轉(zhuǎn)錄和翻譯水平的表達(dá)，磷酸化STAT3 進(jìn)而導(dǎo)致β-catenin 的核轉(zhuǎn)位，針對(duì)Wnt/β-catenin 通路和/或STAT3 可能消除LCSCs 表型，從而完全治愈癌癥[15-16]。我們研究發(fā)現(xiàn)，兩種肺癌干細(xì)胞STAT3 在Tyr705 位點(diǎn)的磷酸化程度在DMY 的作用下表達(dá)減少，而DMY 不影響STAT3 在Ser727 位點(diǎn)的磷酸化水平。以上結(jié)果表明DMY 可能通過Wnt/β-catenin 信號(hào)通路干預(yù)LCSCs功能。

綜上所述，DMY 作為一種有效的LCSCs 抑制劑，可能通過抑制LCSCs Wnt/β-catenin 信號(hào)通路，從而發(fā)揮抗肺癌效應(yīng)。