謝蕓 陳維平

慢性心力衰竭(chronic heart failure，CHF)是一種人體持續(xù)存在的心力衰竭狀態(tài)，由于心肌梗死、心肌病、血流動(dòng)力學(xué)負(fù)荷過重以及炎癥等造成的心肌損傷[1]。這種心肌損傷會(huì)使得人體的心肌結(jié)構(gòu)以及功能發(fā)生變化，且在慢性心力衰竭的過程中，常常伴隨出現(xiàn)一系列的并發(fā)癥，從而對(duì)預(yù)后產(chǎn)生影響，其中腎功能不全是最常見的一種預(yù)后影響，被稱為心腎綜合癥[2]。近些年發(fā)現(xiàn)，肌少癥也是慢性心力衰竭患者的一種并發(fā)癥，由于心力衰竭患者運(yùn)動(dòng)能力受限，而導(dǎo)致骨骼肌的質(zhì)量及功能障礙[3,4]。已有研究表明，60%～80%的心衰患者至少有Ⅲ以上的腎功能問題，其腎小球的過濾能力也明顯出現(xiàn)降低，平均過濾率從55.7 ml/min下降到43.1 ml/min，甚至更低達(dá)到30 ml/min，這嚴(yán)重影響心力衰竭患者的腎健康[5]。而肌少癥在慢性心力衰竭患者中發(fā)病率達(dá)到了19.5%[6]，因此慢性心肌炎患者的預(yù)后作用較為重要，從而不斷減少心衰患者的并發(fā)癥。目前，關(guān)于HMGB1對(duì)健康人體T淋巴細(xì)胞增殖的研究較多，然而關(guān)于慢性心肌炎患者血清中高遷移率族蛋白B1對(duì)于T細(xì)胞的免疫功能影響以及預(yù)后的研究較少，基于此本文開展此項(xiàng)研究，以期分析HMGB1對(duì)于心力衰竭預(yù)后的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2016年8月到2018年8月到我院進(jìn)行就診的CHF患者50例(患病組)，選取50例同期來體檢的健康者為對(duì)照組。2組受試者的性別比、年齡等差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。見表1。

表1 受試者的人口學(xué)特征 n=50,例

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1 納入標(biāo)準(zhǔn)：選取0～60歲CHF患者，被確診為心力衰竭的患者滿足以下癥狀：患者勞累時(shí)氣短、端坐呼吸，易乏力、頭暈，夜間睡眠時(shí)陣發(fā)性呼吸存在困難且咳嗽，放射性癥狀表現(xiàn)為肺水腫、心臟擴(kuò)大以及葉間積水等。

1.2.2 排除標(biāo)準(zhǔn)：進(jìn)行過心臟移植手術(shù)的病患；有惡性腫瘤、感染性疾病、嚴(yán)重肝腎疾病以及甲狀腺疾病史的人群；入院時(shí)有其他重大外科手術(shù)及外傷的病患；以往有腎小球腎炎等腎病的患者。

1.3 方法

1.3.1 樣本采集：所有受試者在清晨空腹時(shí)取外周靜脈血35 ml，5 ml置于無(wú)抗凝管中凝固，離心后提取血清于凍凝管中，并將血清于-80℃的冰箱中保存待測(cè)。血清使用前室溫下復(fù)溶后進(jìn)行指標(biāo)的測(cè)定。②外周靜脈血T淋巴細(xì)胞的分離培養(yǎng)：將上述抽取剩下的30 ml外周靜脈血加入肝素鈉抗凝劑，與Hanks液1∶1混合均勻后，按2∶1比例加入Ficoll-Hypaque淋巴細(xì)胞的分離液，500 g離心15 min后，取中間層加入5 ml的PBS洗滌后同樣轉(zhuǎn)速離心4 min，棄上層，加入2 ml的Lying solution，避光靜置10 min后再次離心；棄上層液體，重復(fù)使用PBS洗滌離心2次后使用10%的小牛血清溶液重懸細(xì)胞，使用PBS稀釋20倍后進(jìn)行培養(yǎng)[7]。

1.3.2 酶聯(lián)免疫法檢測(cè)血清中HMGB1：采用酶聯(lián)免疫法檢測(cè)2組血清中的HMGB1水平，使用酶聯(lián)免疫試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，具體操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒上的要求進(jìn)行[8]。

1.3.3 T淋巴細(xì)胞中IL-2mRNA及IL-2RmRNA表達(dá)的測(cè)定：采用異硫氰酸胍一步提取法進(jìn)行總RNA的提取[9]：將300 μl的變形裂解液加入EP管中，后加入2 mmol/L，pH值為4的NaAc 30 μl，再加入酚：氯仿：異丙醇(125∶24∶1)混合液300 μl，冰浴15 min后12 000 g、4℃離心20 min，取上次液體與等體積的的異丙醇混合于-20℃的冰箱中放置2 h，同樣離心條件下離心15 min，加入75%的冷乙醇1 ml再次離心10 min后，棄上層用20 μl的無(wú)RNA的酶水解后-20℃保存總RNA，并進(jìn)行總RNA的定量，后將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后保存在-20℃冰箱里。IL-2、IL-2R以及內(nèi)參β-actin引物的特異性檢測(cè)[10]：首先進(jìn)行BLAST的測(cè)試，后進(jìn)行水浴條件下進(jìn)行目的基因的PCR，97℃條件下變性反應(yīng)5 min。反應(yīng)完成后采用瓊脂糖凝膠電泳來收集檢測(cè)mRNA的表達(dá)量。

1.3.4 細(xì)胞培養(yǎng)液上清IL-2、sIL-2R濃度的檢測(cè)：采用酶聯(lián)免疫檢測(cè)法來進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)液上清中IL-2及sIL-2R蛋白濃度的檢測(cè)[11]。嚴(yán)格按照試劑盒上要求進(jìn)行操作，主要操作步驟如下：首先進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)品、抗體以及酶結(jié)合物的稀釋，將標(biāo)準(zhǔn)品及檢測(cè)樣品中加樣，室溫條件下孵育60 min后進(jìn)行洗滌，洗滌完成后加入100 μl的稀釋酶結(jié)合物，再次洗滌3次后加入50 μl的底物，室溫下孵育20 min，最后加入50 μl的終止液于450 nm的波長(zhǎng)條件下檢測(cè)OD值。

1.3.5 血清中氨基末端BNP前體的檢測(cè)：采用電化學(xué)發(fā)光免疫法檢測(cè)血清中氨基末端BNP前體的水平[12]。實(shí)驗(yàn)使用試劑盒進(jìn)行操作，具體操作方法嚴(yán)格按照試劑盒上說明進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1 2組血清中HMGB1水平比較 患病組血清中HMGB1含量明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 2組血清中HMGB1水平比較

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05

2.2 2組別血清T淋巴細(xì)胞中IL-2及IL-2RmRNA表達(dá) T淋巴細(xì)胞中IL-2及IL-2RmRNA表達(dá)，其中慢性心肌炎患者血清中IL-2mRNA及IL-2mRNA含量均高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

表3 2組別血清T淋巴細(xì)胞中IL-2mRNA及IL-2RmRNA表達(dá)

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05

2.3 2組上清IL-2、sIL-2R的蛋白濃度比較 細(xì)胞培養(yǎng)液上清IL-2、sIL-2R的濃度 患病組血清中IL-2及sIL-2R的蛋白含量均高于對(duì)照組，數(shù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表4。

表4 2組上清IL-2、sIL-2R的蛋白濃度比較

注：與對(duì)照組比較,*P<0.05

2.4 2組血清中氨基末端BNP前體含量比較 慢性心肌炎患者血清中氨基末端BNP前體的含量明顯高于健康人群，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表5。

表5 2組血清中氨基末端BNP前體的含量比較

注：與對(duì)照組比較,*P<0.05

3 討論

高遷移率族蛋白B1(high mobility group protein B1，HMGB1)是一種真核生物細(xì)胞核中高度保守的染色質(zhì)蛋白，當(dāng)釋放至核外后，做為細(xì)胞因子參與機(jī)體的炎癥反應(yīng)調(diào)節(jié)中，在真核生物細(xì)胞中含量較多，因在聚丙烯酰胺凝膠電泳中遷移率高而得名[13]。當(dāng)由于感染及組織損傷導(dǎo)致細(xì)胞壞死時(shí)，HMGB1即釋放；同時(shí)內(nèi)毒素、促炎細(xì)胞因子激活的單核/巨噬細(xì)胞也將直接分泌高遷移率族蛋白B1[14]。分泌后的高遷移率族蛋白B1通過晚期糖基終產(chǎn)物受體以及其信號(hào)通路作用下，誘導(dǎo)腫瘤壞死因子TNF-α、白細(xì)胞介素等炎性因子以及黏附分子發(fā)生轉(zhuǎn)錄，從而大量的炎性介質(zhì)釋放[15-17]。但已有研究表明，高遷移率蛋白B1具有較好的應(yīng)用前景，其對(duì)于機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)不局限于單向促炎作用，HMGB1可與TNF-α相互誘生，從而產(chǎn)生雙向免疫活性的作用[18]。研究也表明，HMGB1含量與人體中的B型腦鈉肽(BPN)水平呈現(xiàn)正相關(guān)的作用[19]。

已有研究表明，人體血清中的HMGB1水平可用于患者的心衰診斷中，當(dāng)肌體組織受損或受到病原體的刺激時(shí)，細(xì)胞會(huì)將HMGB1分泌到細(xì)胞外[20]，從而誘導(dǎo)肌體發(fā)生炎性反應(yīng)，因此慢性心肌炎患者血清中的HMGB1含量明顯增高。研究發(fā)現(xiàn)，HMGB1在慢性心肌炎患者的病理中發(fā)揮著較大的作用，可做為心力衰竭的診斷指標(biāo)之一，其作為真核生物細(xì)胞核內(nèi)的染色質(zhì)蛋白，當(dāng)釋放到細(xì)胞外即成為調(diào)節(jié)機(jī)體炎癥的細(xì)胞因子[21]，在炎性反應(yīng)免疫調(diào)節(jié)中扮演著重要的作用；釋放到核外的HMGB1將活化樹突狀細(xì)胞、單核細(xì)胞以及巨噬細(xì)胞等抗原呈遞細(xì)胞，從而不斷調(diào)節(jié)機(jī)體中的免疫應(yīng)答反應(yīng)。HMGB1還對(duì)于一些干細(xì)胞具有化學(xué)趨化效應(yīng)、介質(zhì)黏附分子表達(dá)等作用[22]。至今發(fā)現(xiàn)的關(guān)于HMGB1拮抗治療的手段已較多，有研究表明，關(guān)于膿毒癥患者與HMGB1抗炎反應(yīng)中，膿毒癥的產(chǎn)生是由于機(jī)體促炎、抗炎失衡導(dǎo)致，二者交替抵抗過程中，抗炎機(jī)制占優(yōu)勢(shì)并導(dǎo)致免疫抑制，且HMGB1治療膿毒癥小鼠的研究已被證實(shí)[23]。同時(shí)研究表明，HMGB1對(duì)人體的T細(xì)胞功能亞群從促炎免疫應(yīng)答優(yōu)勢(shì)轉(zhuǎn)向抗炎免疫作用，從而不斷發(fā)揮著作用，但目前關(guān)于HMGB1如何參與免疫平衡調(diào)節(jié)的具體過程，仍有待進(jìn)一步的研究[24]。

研究表明，IL-2稱為“淋巴因子”，其在T淋巴細(xì)胞的增殖分化以及免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用[25]，而IL-2R可由細(xì)胞表面脫落為可溶性的IL-2R，并與IL-2結(jié)合，IL-2R是T細(xì)胞活化的關(guān)鍵，結(jié)合IL-2后激活T細(xì)胞，從而參與慢性心肌炎患者的T細(xì)胞免疫過程。HMGB1在機(jī)體的免疫功能中扮演著很大的作用。而本文通過研究慢性心力衰竭患者血清中的HMGB1以及T淋巴細(xì)胞中IL-2以及IL-2R蛋白的表達(dá)等，發(fā)現(xiàn)慢性心力衰竭患病組HMGB1比對(duì)照組HMGB1高了1.05 ng/ml；慢性心力衰竭患者血清中IL-2mRNA及IL-2mRNA含量均高于健康對(duì)照組，IL-2 mRNA及IL-2 mRNA分別高了0.210 ng/ml及0.230 ng/ml；患慢性心力衰竭的患者血清中IL-2蛋白含量為0.166 μg/L，sIL-2R的蛋白含量為2.268 μg/L，患病組血清中IL-2及sIL-2R的蛋白含量均高于對(duì)照組；患病組血清中氨基末端BNP前體為3 176.2 pg/ml，而健康對(duì)照組血清中氨基末端BNP前體為2 114.1 pg/ml，慢性心力衰竭患者血清中氨基末端BNP前體的含量明顯高于健康人群。

綜上所述，慢性心肌炎患者血清中HMGB1含量高于健康人群，其增長(zhǎng)促進(jìn)了人體中T細(xì)胞的免疫過程，促進(jìn)心肌細(xì)胞的再生，而升高的HMGB1可能與心力衰竭患者不良預(yù)后相關(guān)。