邱宏業(yè)，朱建華，丁 峰，潘介春，秦獻(xiàn)泉，徐 寧，李鴻莉，3，李冬波，彭宏祥，侯延杰，張樹偉

(1.廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所，廣西 南寧 530007；2.廣西作物遺傳改良重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，廣西 南寧 530007；3.農(nóng)業(yè)部南寧南亞熱帶果樹科學(xué)觀測實(shí)驗(yàn)站，廣西 南寧 530007；4.廣西大學(xué)，廣西 南寧 530004)

【研究意義】四季蜜龍眼(Longancv. Sijimi)是廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所等單位引種選育、于2008年通過廣西農(nóng)作物品種審定委員會(huì)審定的熱帶生態(tài)型龍眼新品種[1]。該品種不需要低溫誘導(dǎo)即能完成成花轉(zhuǎn)變，且一年可多次開花結(jié)果。已有研究對四季蜜龍眼幼葉和芽的SAM、LLFY、SVP、TFL和FLC基因進(jìn)行克隆及以四季蜜龍眼嫩梢為材料進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序[2-5]，但均未檢測到葉片開花基因FLOWERINGLOCUST(FT)。本研究基于生長調(diào)節(jié)劑調(diào)控四季蜜龍眼夏季成花、秋冬季收果技術(shù)，對其成熟葉片中FT基因進(jìn)行克隆和生物信息學(xué)分析，利用熒光定量PCR檢測其成花過程不同時(shí)期的表達(dá)情況，對進(jìn)一步探討生長調(diào)節(jié)劑調(diào)控四季蜜龍眼夏季成花的機(jī)理具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】成花過程是開花植物生命周期中的一個(gè)關(guān)鍵時(shí)期，主要由經(jīng)典的光周期途徑、年齡途徑、赤霉素途徑、春化途徑、自主途徑和新研究發(fā)現(xiàn)的相關(guān)途徑構(gòu)成復(fù)雜成花誘導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)，如多個(gè)成花調(diào)控途徑通過一些關(guān)鍵整合因子[SUPPRESSOROFOVEREXPRESSIONOFCONSTANS1(SOC1)、FT、和LEAFY(LFY)]形成一個(gè)復(fù)雜的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)對植物開花時(shí)間進(jìn)行精密調(diào)控[6-11 ]。FT基因處在光周期途徑、春化途徑、常溫途徑、年齡途徑和赤霉素途徑等多條調(diào)控途徑的交叉點(diǎn)上，受到許多具有染色質(zhì)重組功能基因和轉(zhuǎn)錄因子如CONSTANS(CO)[12-13]、APETALA2(AP2)[14-15]、SCHLAFMUTZE(SME)[16]、FLOWERINGLOCUSC(FLC)[17]、TEMPRANILLO1(TEM1)和TEMPRANILLO2(TEM2)[18]的調(diào)控，其表達(dá)最終導(dǎo)致植物從營養(yǎng)生長向生殖生長轉(zhuǎn)變，使植物成花。植物FT同源基因的超表達(dá)可抑制植物營養(yǎng)生長、促進(jìn)營養(yǎng)芽進(jìn)入花芽分化，進(jìn)而使植物提早開花，如將楊樹的開花基因PtFT1和PtFT2分別轉(zhuǎn)入楊樹自身，以野生型植株作為對照，發(fā)現(xiàn)對照植株開花一般需5～10年，而轉(zhuǎn)基因植株在幾個(gè)月內(nèi)即可開花[19]；將柑橘的CiFT基因?qū)霘W洲梨，轉(zhuǎn)基因歐洲梨開花時(shí)間顯著提早[20]；將蘋果2個(gè)FT同源基因MdFT1和MdFT2分別轉(zhuǎn)入模式植物擬南芥，轉(zhuǎn)基因擬南芥均提早開花[21]。綜上所述，F(xiàn)T同源基因在植物成花調(diào)控過程中發(fā)揮了至關(guān)重要的作用。【本研究切入點(diǎn)】目前，關(guān)于以多效唑(PP333)和乙烯利處理四季蜜龍眼不同成熟時(shí)期葉片開花基因FLOWERINGLOCUST(FT)表達(dá)的研究鮮見報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】基于生長調(diào)節(jié)劑調(diào)控四季蜜龍眼夏季成花的技術(shù)，對其成熟葉片中FT基因進(jìn)行克隆和生物信息學(xué)分析，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測其成花過程不同時(shí)期的表達(dá)情況，探究生長調(diào)節(jié)劑調(diào)控四季蜜龍眼夏季成花過程中成花基因FT的動(dòng)態(tài)變化，為探討生長調(diào)節(jié)劑調(diào)控四季蜜龍眼夏季成花機(jī)理提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試四季蜜龍眼2010年3月種植于廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院里建科研基地，采集樣品時(shí)間為2014年5-6月。主要試劑：核酸染料SYBR?Premix E×TaqTM、TaKaRaPrimeScriptTMRT reagent Kit With gDNA Eraser試劑盒、TaKaRa PrimeScriptTMⅡ1st Stand DNA Synthesis Kit試劑盒、PremieSTAR Max Premix酶、DL2000 DNA Marker、RNase Inhibitor、Recombinant DNaseI、RNase Free dH2O及克隆載體pMD18-T劑購自TaKaRa公司；Tris-NaAc-EDTA Buffer(TAE)、Tris-HCl-EDTA buffer(TE)、Diethyl Pyrocarbonate(DEPC)和氨芐青霉素(Amp)均購自生工生物工程(上海)股份有限公司；超快新型植物RNA提取試劑盒(Quick RNA Isolation Kit)購自北京華越洋生物科技有限公司；DH5α大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

按照四季蜜龍眼夏季成花技術(shù)要求，在四季蜜龍眼二次梢老熟、頂芽未萌動(dòng)時(shí)葉面噴施500.0 mg/L PP333和126.9 mg/L乙烯利混合液1次，7 d后再葉面噴施250.0 mg/L PP333和126.9 mg/L乙烯利混合液1次。單株重復(fù)5次。

葉片采集：于第1次噴施PP333和乙烯利混合液前(5月28日)采樣1次(0 d)，處理后1、3、5、8、12、16、20和25 d各采樣1次，共采樣9次。約在上午10：00選取供試植株無病蟲梢，采集從頂部往下數(shù)第2～3張復(fù)葉的第2和3張小葉。每條無病蟲梢采集1～2張小葉，每株每次約采集15張葉片。所采集葉片用液氮速凍后置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 四季蜜龍眼FT同源基因克隆

1.3.1 總RNA提取及DNA消化 采用改良的RNA提取試劑盒Quick RNA Isolation Kit提取四季蜜龍眼葉片總RNA，用1.5 %瓊脂糖凝膠電泳檢測所提取RNA完整性，用超微量紫外分光光度計(jì)檢測所提取RNA 的OD260/OD280純度值和濃度。采用TakaRa公司的DNA酶DNase I處理所提取總RNA樣品中殘留的DNA。

(1)將室溫12 000 r/min、離心10 min改為室溫12 700 r/min、離心10 min。

(2)收集RNA時(shí)將洗脫液的體積改為70 μl；將12 000 r/min、離心1 min改為12 700 r/min、離心2 min。

1.3.2 cDNA第一條鏈合成 經(jīng)檢測合格的RNA樣品參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒TaKaRa PrimeScriptTMⅡ1st Stand DNA Synthesis Kit(用于基因克隆)和TaKaRa PrimeScriptTMRT reagent Kit With gDNA Eraser(用于熒光定量PCR)說明反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3FT同源基因克隆 根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫已公布的其他龍眼品種FT同源基因序列，通過Primer 5.0設(shè)計(jì)包含完整開放閱讀框(ORF)的特異引物，序列如下。FT1-F：5′-CAACCAACAATATTTCACCTGAA-3′,FT1-R：5′-TGGTGTGGGAAACATAGAGA AG-3′,FT2-F：5′-CTTGAATATTTTTGTTTAACACTAC-3′,FT2-R：5′-TTATACGGATTTTGCTAGATAGTTA-3′。

以cDNA為模板，以特異引物FT1-F/FT1-R和FT2-F/FT2-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系25.0 μl：2.5 μl E×TaqBuffer，1.0 μl cDNA，0.5 μl dNTP，引物各1.0 μl，0.16 μl E×TaqDNA酶，18.84 μl RNase free dH2O。擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃ 40 s，55.5 ℃ 40 s，72 ℃ 2 min，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min，10 ℃停止反應(yīng)。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物分別進(jìn)行回收純化連接pMD18-T后，轉(zhuǎn)至DH5α感受態(tài)細(xì)胞，進(jìn)行藍(lán)白斑篩選和菌液PCR鑒定，將陽性克隆送至生工生物工程(上海)股份有限公司測序，對測序結(jié)果進(jìn)行比對分析。采用同源克隆的方法，利用特異引物對混合cDNA模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳、膠回收、片段連接、轉(zhuǎn)化大腸桿菌、菌液PCR驗(yàn)證及陽性克隆去公司測序等步驟，成功獲得2個(gè)四季蜜龍眼FT同源基因cDNA全長序列，命名為DlFT1和DlFT2。

1.3.4 生物信息學(xué)分析 通過NCBI檢索獲得四季蜜龍眼FT同源基因DlFT1和DlFT2的同源性；利用BioXM 2.6預(yù)測基因編碼蛋白；利用ExPaSy提供的在線Protparam軟件(http://web.expasy.org/protparamy)對蛋白一級結(jié)構(gòu)的理化特性進(jìn)行分析；利用ExPaSy提供的在線SOPMA程序(http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/NPSA/npsa_server.html)進(jìn)行蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測分析；利用SMART(http://smart.embl-heidelberg.de/)預(yù)測蛋白三級結(jié)構(gòu)；利用MEGA 4.1構(gòu)建多物種FT同源基因系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.3.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 熒光定量PCR所用儀器為LightCycler?480實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀，核酸染料為SYBR?Premix E×TaqTM，2次生物學(xué)重復(fù)，3次技術(shù)重復(fù)。根據(jù)克隆測序獲得的四季蜜龍眼FT同源基因cDNA序列，采用Primer 5.0設(shè)計(jì)定量特異引物，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。以在各組織及條件下穩(wěn)定表達(dá)的龍眼EF1α基因?yàn)閮?nèi)參基因[22]。熒光定量PCR引物為：DlFT1-F：5′-AGTGACCCAACCCTGAGAGA-3′;DlFT1-R：5′-ACTGTCTGCCTGCCTTGTT-3′;DlFT2-F：5′-GCTACACTTTGGTTA TGGTGGA-3′;DlFT2-R：5′-ATAGTCTGCCTGCTCGGTTG-3′;DlEFla-F：5′-GATGATTCCCACCAAGCCCAT-3′;DlEFla-R：5′-GGGTCCTTCTTCTCAACACTCT-3′。

2 結(jié)果與分析

2.1 序列分析

從圖1～2可看出，四季蜜龍眼FT同源基因DlFT1和DlFT2cDNA的全長序列分別為893和753 bp，對二者的氨基酸序列與基因序列進(jìn)行分析比對，結(jié)果表明，DlFT1和DlFT2基因的ORF均為525 bp，各編碼174個(gè)氨基酸，DlFT1基因與DlFT2基因的核苷酸同源性為90.00 %，二者所編碼蛋白存在24個(gè)氨基酸殘基差異。

從圖3可看出，利用DNAMAN 軟件將從NCBI中檢索獲得的6個(gè)其他物種FT同源基因序列與四季蜜龍眼的2個(gè)FT基因序列進(jìn)行序列比對，結(jié)果發(fā)現(xiàn)8個(gè)序列的同源性為46.69 %；而涂黑區(qū)域的同源性為100.00 %。四季蜜龍眼2個(gè)FT基因序列的ORF長度與其他FT基因序列的ORF長度均相似，約525 bp，均編碼約174個(gè)氨基酸。

圖1 四季蜜龍眼DlFT1和DlFT2基因的氨基酸殘基序列比對

圖2 四季蜜龍眼DlFT1和DlFT2基因核苷酸序列比對分析

2.2 生物信息學(xué)分析

對四季蜜龍眼DlFT1合DlFT2蛋白的理化性質(zhì)(氨基酸數(shù)目、分子量、理論等電點(diǎn)、脂肪族氨基酸指數(shù)和蛋白質(zhì)疏水性等)進(jìn)行預(yù)測分析，結(jié)果如表1所示。2個(gè)蛋白序列的蛋白質(zhì)疏水性(GRAVY)均為負(fù)值，說明四季蜜龍眼的DlFT1和DlFT2蛋白均為親水蛋白。

通過ExPaSy提供的在線SOPMA程序?qū)λ募久埤堁跢T同源基因編碼蛋白進(jìn)行二級結(jié)構(gòu)分析，得知其蛋白的二級結(jié)構(gòu)主要由α-螺旋、β-折疊、轉(zhuǎn)角、延伸鏈和無規(guī)則卷曲組成。2個(gè)FT蛋白二級結(jié)構(gòu)主要以豐富的β-折疊(DlFT1，28.16 %；DlFT2，27.59 %)和無規(guī)則卷曲(DlFT1，39.66 %；DlFT2，47.13 %)2種形式存在，其次是α-螺旋(DlFT1，19.54 %；DlFT2，14.37 %)。

a：桃(EU939302)；b：蘋果(AB161112)；c：向日葵(GU985573)；d：水稻(AB052944)；e：擬南芥(AB465586)；f：荔枝(JN214350)；g：龍眼(DlFT1)；h：龍眼(DlFT2)a：Prunus persica(EU939302)；b：Malus x domestica(AB161112)；c：Helianthus annuus(GU985573)；d：Oryza sativa(AB052944)；e：Arabidopsis halleri(AB465586)；f：Litchi chinensis(JN214350)；g：Dimocarpus longan(DlFT1)；h：Dimocarpus longan(DlFT2)

表1 四季蜜龍眼DlFT1和DlFT2蛋白的理化性質(zhì)分析

利用SMART 網(wǎng)站http://smart.embl-heidelberg.de/預(yù)測的蛋白三級結(jié)構(gòu)如圖4～5所示。DlFT1和DlFT2蛋白含有PEBP-euk特殊結(jié)構(gòu)域，每個(gè)蛋白均含有7個(gè)結(jié)構(gòu)域，但位置略有差異，屬于PEBP基因家族的FT-Like蛋白亞家族。

2.3 FT同源基因的系統(tǒng)發(fā)育分析

利用MEGA 4.1構(gòu)建多種植物FT同源基因編碼蛋白的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，結(jié)果如圖6所示。四季蜜龍眼的FT同源基因首先與無患子科的荔枝(JN214350和JN214351)和龍眼(KF881012.1、KF881011.1和KF881010.1)聚在一類，親緣關(guān)系最近；DlFT1基因所編碼的氨基酸序列與龍眼(KF881010.1)所編碼的氨基酸序列完全一致；DlFT2基因所編碼的氨基酸序列與龍眼(KF881012.1)所編碼的氨基酸序列完全一致；DlFT1基因所編碼的氨基酸序列與荔枝(JN214350和JN214351)所編碼的氨基酸序列分別相差24和21個(gè)；DlFT2基因所編碼的氨基酸序列與荔枝(JN214350和JN214351)所編碼的氨基酸序列分別相差15和6個(gè)；DlFT1和DlFT2與擬南芥(雙子葉植物)親緣關(guān)系較近，與水稻(單子葉植物)的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。綜上所述，F(xiàn)T基因在雙子葉植物和單子葉植物間、不同科屬植物間及同種物種中存在分化，說明重要的開花基因FT在植物進(jìn)化過程中有所保守，但也在不斷進(jìn)化。

2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析結(jié)果

采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析生長調(diào)節(jié)劑處理四季蜜龍眼后不同時(shí)期成熟葉片的DlFT1和DlFT2基因表達(dá)情況，結(jié)果如圖7所示。田間觀察四季蜜龍眼成花調(diào)控處理后的成花過程：①頂芽萌動(dòng)時(shí)期(3～7 d)，此時(shí)期頂芽由未萌動(dòng)的葉芽狀態(tài)逐漸伸長，由僵硬變軟，絲狀小葉伸展；②花序原基出現(xiàn)期(8～12 d)，絲狀小葉腋間出現(xiàn)花序原基(又稱紅點(diǎn))，逐漸生長為混合花芽；③花穗生長期(12～24 d)，混合花芽繼續(xù)生長，絲狀小葉逐漸脫落，花穗主、側(cè)軸生長，花蕾形成；④花期(25 d后)，花穗中的小花陸續(xù)開放。綜合田間觀察和實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析結(jié)果，在生長調(diào)節(jié)劑處理的0～8 d，即四季蜜龍眼花芽分化的關(guān)鍵期，DlFT1基因在成熟葉片中表達(dá)量呈波動(dòng)性變化，總體上呈上升變化趨勢(但在處理12 d時(shí)有明顯下降現(xiàn)象)，在處理12 d后，即花器官發(fā)育和開花期，DlFT1基因在成熟葉片中的表達(dá)量明顯升高(圖7-A)，而DlFT2基因的表達(dá)量隨著生長調(diào)節(jié)劑處理時(shí)間的延長(除在處理12 d時(shí)有明顯下降現(xiàn)象外)總體上呈上升變化趨勢(圖7-B)。

圖4 DlFT1蛋白保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測分析

圖5 DlFT2蛋白保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測分析

圖6 基于植物FT同源基因編碼蛋白氨基酸序列同源性構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹

3 討 論

因四季蜜龍眼屬于多酚多糖植物，提取其高質(zhì)量的RNA較困難。本研究對四季蜜龍眼葉片RNA提取方法進(jìn)行適當(dāng)?shù)膬?yōu)化改進(jìn)，提取獲得的RNA純度高、條帶清晰、完整性好，OD260/OD280值在1.90左右，OD260/OD230值在2.10左右，且穩(wěn)定性較好，可滿足后續(xù)分子生物學(xué)研究的要求。

A：DlFT1基因的表達(dá)情況；B：DlFT2基因的表達(dá)情況A：Relative expression levels of DlFT1 gene assayed with RT-qPCR；B：Relative expression levels of DlFT2 gene assayed with RT-qPCR

由于FT同源基因在植物成花調(diào)控中具有整合因子的作用，即多個(gè)成花調(diào)控途徑均匯聚于此，使得FT基因的分離克隆及功能研究得到迅速發(fā)展，且近年來對FT基因的研究更深入，相繼成功克隆獲得葡萄(Carmonaet al.，2007)[23]、大豆(胡瑞波，2009)[24]、薔薇科植物(左陽，2010)[25]、荔枝(Ding et al.，2015)[26]等物種的FT基因，但有關(guān)龍眼FT基因的研究僅見Heller等[22]克隆出龍眼的3個(gè)FT基因。

本研究克隆四季蜜龍眼DlFT1和DlFT2基因的cDNA編碼區(qū)與GenBank數(shù)據(jù)庫中的龍眼FT基因KF881010.1和KF881012.1具有99.00 %的同源性。其中，DlFT1和DlFT2基因的ORF均為525 bp，各編碼174個(gè)氨基酸，DlFT1與DlFT2基因的核苷酸高度同源，同源性達(dá)90.00 %，二者的氨基酸序列存在24個(gè)氨基酸殘基差異，但其編碼蛋白的二級和三級結(jié)構(gòu)相似。由此推測編碼DlFT1和DlFT2基因在功能上有所保守的同時(shí)，也在向不同的方向進(jìn)化。Banfieid等[27]研究認(rèn)為，F(xiàn)T基因不同物種間位于第70和74位的D-P-D-X-P基序、第86位的組氨酸殘基、第115和118位的G-X-H-R基序具有顯著的序列同源性區(qū)域。本研究獲得FT基因編碼的蛋白含有上述高度保守區(qū)域結(jié)構(gòu)，推測四季蜜龍眼FT同源基因和其他物種的FT同源基因高度保守，且在蛋白空間結(jié)構(gòu)及結(jié)構(gòu)域上高度相似，即不同物種的FT同源基因功能具有相似性。

本研究還發(fā)現(xiàn)，在植物生長調(diào)節(jié)劑處理四季蜜龍眼葉片的0～8 d，其DlFT1基因的表達(dá)量總體上呈波動(dòng)性上升變化趨勢，而DlFT2基因的表達(dá)量隨著處理時(shí)間的延長呈總體上呈上升變化趨勢，在處理8 d時(shí)四季蜜龍眼已出現(xiàn)花序原基；在植物生長調(diào)節(jié)劑處理12 d時(shí)二者的表達(dá)量明顯下降，可能與噴施第2次PP333和乙烯利混合液有關(guān)；DlFT1和DlFT2基因的相對表達(dá)量在植物生長調(diào)節(jié)劑處理后3～8 d(頂芽萌動(dòng)期和花序原基出現(xiàn)期)較處理后8～25 d(花器官發(fā)育及開花階段)有明顯上升趨勢，分別在處理的20和25 d(初花期)達(dá)最大值，推測DlFT1和DlFT2基因在PP333和乙烯利誘導(dǎo)四季蜜龍眼成花轉(zhuǎn)變過程中發(fā)揮了關(guān)鍵作用，且DlFT2基因起主導(dǎo)作用，但2個(gè)基因的功能也可能有所不同。為進(jìn)一步探索DlFT1和DlFT2基因在PP333和乙烯利誘導(dǎo)四季蜜龍眼成花轉(zhuǎn)變過程中的作用，還需構(gòu)建DlFT1和DlFT2基因的超表達(dá)載體，并轉(zhuǎn)入擬南芥中進(jìn)行功能驗(yàn)證。

四季蜜龍眼成花調(diào)控除與其生長特性有關(guān)外，還受營養(yǎng)物質(zhì)、光照、水分及溫度等外界環(huán)境的影響，但這些影響與重要開花基因間的關(guān)聯(lián)尚待進(jìn)一步探究。

4 結(jié) 論

四季蜜龍眼FT同源基因DlFT1和DlFT2均屬于PEBP基因家族的FT-Like蛋白亞家族，在PP333和乙烯利誘導(dǎo)四季蜜龍眼成花轉(zhuǎn)變過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，且DlFT2起主導(dǎo)作用。