周治國 厲彩霞

姜黃素是從植物姜黃等的根莖中分離提取出來的一種原生態(tài)多元酚類物質(zhì)［1］。被廣泛用于癌癥、哮喘、糖尿病和中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病等慢性疾病的治療［2］。大量研究表明姜黃素通過調(diào)控各種相關(guān)的靶標(biāo)分子，包括促炎因子、生長因子、細(xì)胞增殖和凋亡相關(guān)因子、粘附因子和轉(zhuǎn)錄因子，從而在多種細(xì)胞中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用［3］。肺泡巨噬細(xì)胞作為肺臟的主要炎癥細(xì)胞，是機(jī)體肺部抵御病原體侵入和肺損傷的重要屏障，在各種肺臟疾病中發(fā)揮關(guān)鍵作用。脂多糖（LPS）刺激常作為各種體內(nèi)外炎癥模型，能夠誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞分泌大量細(xì)胞因子。姜黃素對LPS 刺激的肺泡巨噬細(xì)胞中炎癥損傷的調(diào)節(jié)作用相關(guān)報(bào)道較少，本文探討姜黃素調(diào)節(jié)LPS 損傷的大鼠巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)的作用。

1 材料與方法

1.1 材料 （1）儀器：普通光學(xué)顯微鏡（奧林巴斯公司，型號CKX31）；生物安全柜、高速冷凍離心機(jī)和CO2培養(yǎng)箱（均為Thermo 公司，型號分別為1300-A2和ST-16R 和SERIES II）；水平低速常溫離心機(jī)（湘儀公司，型號L-500）；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（精宏公司，型號DHG-9140A）；酶標(biāo)儀（美國Biotek 公司，型號Epoch）；電泳槽（BIO-RAD 公司，型號165-8004）；PVDF 膜（Millipore 公司，型號IPVH00010）。（2）試劑：胎牛血清、1640 培養(yǎng)基、Penicillin-Streptomycin 和胰蛋白酶均購于Gibco 公司（型號分別為10099-141、11875500BT、15140-122、25200-072）；pro-IL-1β、IL-1β 和IL-18ELISA 檢測試劑盒均購于酶聯(lián)生物（型號分別為ml027415、ml003057、ml002816）；PBS（上海億凡生物，型號YF3015）；NaCl（國藥集團(tuán)，型號10019360）；LPS（上海源葉生物，型號S11060）；姜黃素（鼓臣試劑，型號GCB2141）；瑞氏-吉姆薩染色試劑盒（南京建成，型號D010）；BCA 測蛋白試劑盒（Thermo 公司，型號PL212989RIPA）；細(xì)胞裂解液和PMSF 來自于碧云天公司（型號分別為P0013B和ST506）；兔多抗ASC 和NLRP3 購于Affinity 公司（型號分別為DF6304 和DF7438）；兔多抗Caspase1、HO-1 和iNOS 購 于Proteintech 公 司（型 號 分 別 為22915-1-AP、10701-1-AP 和18985-1-AP）；β-actin鼠單抗、anti-rabbit lgG-HRP 和M-lgG-kappa-BP-HRP購于Santa Cruz 公司（型號分別為Sc-130065、Sc-2357 和Sc-516142）。（3）實(shí)驗(yàn)動物：成年雄性SD 大鼠從上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物有限公司購買。

1.2 方法 （1）原代大鼠肺泡巨噬細(xì)胞的培養(yǎng)：成年雄性SD 大鼠經(jīng)麻醉（烏拉坦）、固定、消毒、體外分離氣管并經(jīng)預(yù)冷的無菌PBS（含0.02%EDTA）灌肺（離體灌），反復(fù)灌抽 4 次。經(jīng)離心去上清液，底部的細(xì)胞團(tuán)用D-Hanks 溶液重懸。再次離心并去除上清液后，細(xì)胞團(tuán)沉淀加入無菌雙蒸水（9ml）破紅10s，并加入9%的NaCl（1ml）恢復(fù)等滲。再次離心，將獲得的細(xì)胞接種于10%胎牛血清RPMI 1640 培養(yǎng)基中，放在37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中恒溫。采用差速貼壁法分離肺泡巨噬細(xì)胞，2h 后吸掉上清液及未貼壁的細(xì)胞，剩下的即為巨噬細(xì)胞。（2）細(xì)胞純度鑒定：肺泡巨噬細(xì)胞培養(yǎng)2d 后，吸出5μl 細(xì)胞懸液于載玻片上，晾干，先滴加試劑一染色1min 左右，并直接滴加試劑二，充分混勻染料后混合染色5min 左右。待干后進(jìn)行鏡檢，細(xì)胞純度（%）=染色的巨噬細(xì)胞數(shù)/總的細(xì)胞數(shù)×100%。（3）細(xì)胞藥物處理分組：分為CON 組（空白組：只加PBS）、LPS 組（LPS+PBS）和LPS+J 組（LPS+姜黃素）（每組3 個(gè)平行）。將細(xì)胞濃度調(diào)整到1×106個(gè)/ml，接種于20%血清RPMI 1640 培養(yǎng)基的24 孔培養(yǎng)板中，CON 組不加任何處理；LPS 組每孔加入LPS 工作液（100ng/ml），LPS+J 組每孔加入LPS（100ng/ml）和姜黃素（15μmol/L）細(xì)胞處理24h。（4）ELISA 檢測：經(jīng)過處理后的細(xì)胞，在特定的時(shí)間內(nèi)依據(jù)ELISA檢測試劑盒使用說明書的具體步驟檢測細(xì)胞上清液中pro-IL-1β、IL-lβ 和IL-18 含量變化。（5）Western blot：收集處理后的原代大鼠巨噬細(xì)胞，刮提蛋白并進(jìn)行定量。定量的（25μg）蛋白加入至12%SDS-PAGE凝膠電泳中電泳分離。分離后的蛋白經(jīng)轉(zhuǎn)膜（濕轉(zhuǎn)法），封閉（5%脫脂牛奶，2h），并加入對應(yīng)的稀釋后的一抗，（ASC，1 ∶500；NLRP3，1 ∶500；Caspase1，1 ∶500；HO-1，1 ∶1000；iNOS，1 ∶500；β-actin，1 ∶1000），4℃孵育整晚。第2 天洗膜后孵育二抗，（兔抗，1 ∶10000；鼠抗，1 ∶5000），37℃孵育2h。最后進(jìn)行顯影并結(jié)果處理。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析。ELISA檢測結(jié)果標(biāo)曲采用二次項(xiàng)曲線形式表達(dá)（采用酶標(biāo)儀配套Gen5 軟件和Curve Expert 1.4 軟件進(jìn)行標(biāo)曲數(shù)據(jù)處理）。Western blot 結(jié)果使用Image J 軟件進(jìn)行灰度分析。計(jì)量資料以（±s）表示，兩組間比較用t 檢驗(yàn)；多組間比較用方差分析。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 原代大鼠肺泡巨噬細(xì)胞形態(tài)和純度鑒定 通過顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，原代大鼠肺泡巨噬細(xì)胞大小不均一，具有各種不同的形態(tài)，如圓形、扁圓形或不規(guī)則形，見圖1A。細(xì)胞用瑞氏-姬姆薩染液染色后，純度達(dá)到94%，見圖1B。

圖1 原代大鼠肺泡巨噬細(xì)胞形態(tài)和純度鑒定

2.2 LPS 對HO-1 和iNOS 蛋白表達(dá)的影響 為驗(yàn)證LPS 造模是否成功，Western blot 檢測HO-1 和iNOS在CON 組和LPS 組中的含量變化。與CON 組比較，HO-1 和iNOS 蛋白在LPS 處理組中的表達(dá)上調(diào)（P＜0.05）。見圖2。

圖2 大鼠巨噬細(xì)胞中HO-1和iNOS蛋白表達(dá)的變化

2.3 大鼠巨噬細(xì)胞中pro-IL-1β、IL-1β 和IL-18 的含量變化 與CON 組比較，LPS 作用于細(xì)胞后，pro-IL-1β 和IL-1β 含 量 顯 著 下 調(diào)（P＜0.05，P＜0.01），而IL-18 有下調(diào)趨勢，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。LPS+J 組這三種因子含量比CON 組減少（P＜0.01，P＜0.001），姜黃素給藥能顯著抑制LPS 刺激細(xì)胞的IL-18 含量（P＜0.05），pro-IL-1β 和IL-1β 含量均不同程度的抑制，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見圖3。

圖3 大鼠巨噬細(xì)胞中pro-IL-1β、IL-1β和IL-18的含量變化

2.4 大鼠巨噬細(xì)胞中ASC、Caspase1 和NLRP3 蛋白的表達(dá)變化 Western blot 結(jié)果顯示，與CON 組比較，ASC 和NLRP3 蛋白在LPS 組中的表達(dá)明顯下調(diào)（P＜0.01），在LPS+J 組中，ASC 表達(dá)無明顯差異（P＞0.05），而NLRP3 顯著下調(diào)（P＜0.01）。同時(shí)，與LPS 組比較，ASC 和NLRP3 在LPS+J 組中的表達(dá)均增加（P＜0.05）。此外，與CON 組比較，Caspase1 蛋白在LPS 組、LPS+J 組中的表達(dá)上調(diào)（P＜0.05），且LPS+J 組比LPS 組Caspase1 含量更高（P＜0.05）。見圖4。

圖4 大鼠巨噬細(xì)胞中ASC、Caspase1和NLRP3蛋白的表達(dá)變化

3 討論

肺泡巨噬細(xì)胞是引起肺臟產(chǎn)生炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵始動細(xì)胞，LPS 是促使其產(chǎn)生各種促炎因子的常用誘導(dǎo)劑。研究表明，一般情況下，LPS 作用后會促進(jìn)巨噬細(xì)胞中的IL-1β 和IL-6 等炎癥相關(guān)因子的表達(dá)升高［4］。研究中發(fā)現(xiàn)，LPS（100ng/ml）作用于大鼠巨噬細(xì)胞后，pro-IL-1β、IL-1β 和IL-18 三種炎癥因子的表達(dá)與CON 組相比均有下調(diào)，這可能是由于LPS 作用時(shí)間延長所致。Matuschak 等研究發(fā)現(xiàn)，LPS 作用于巨噬細(xì)胞后，隨著孵育時(shí)間的延長，IL-1β 含量明顯增加，在6h 時(shí)達(dá)最高，此后明顯下調(diào)，在24h 時(shí)下調(diào)至最低。為驗(yàn)證模型成功與否，進(jìn)一步檢測參與炎癥反應(yīng)過程中的兩個(gè)關(guān)鍵蛋白iNOS 和HO-1，western blot 結(jié)果顯示LPS 作用于細(xì)胞后，iNOS 和HO-1 含量明顯上調(diào)，證實(shí)炎癥模型成功。

大量體內(nèi)外研究表明，姜黃素能有效抑制促炎因子的分泌，如IL-1β、IL-6 和IL-18 等。研究表明姜黃素及其新合成的羰基類似物能夠通過調(diào)節(jié)p38MAPK活性抑制LPS 刺激引起的RAW264.7 巨噬細(xì)胞中促炎因子的表達(dá)，從而減輕炎癥損傷［5］。這些研究提示，姜黃素可能能夠減弱LPS 刺激引起的大鼠肺泡巨噬細(xì)胞的炎癥反應(yīng)。本資料顯示，與空白組比較，姜黃素能顯著下調(diào)LPS 損傷的原代大鼠肺泡巨噬細(xì)胞中pro-IL-1β、IL-1β 和IL-18 的表達(dá)，該結(jié)果與Lee WH 等發(fā)表的研究結(jié)果一致，證實(shí)姜黃素納米顆粒能夠顯著減少LPS 誘導(dǎo)的NR8383 細(xì)胞促炎因子的含量［6］。ELISA 檢測結(jié)果說明，姜黃素能夠減輕LPS 損傷的原代大鼠肺泡巨噬細(xì)胞的炎癥因子的表達(dá)。

在免疫細(xì)胞中，NRLP3 炎癥小體是一種包含NLRP3 蛋白、ASC 和Caspase1 等參與形成的多蛋白復(fù)合物。研究［7］認(rèn)為，巨噬細(xì)胞分泌IL-1β 有一個(gè)關(guān)鍵步驟為活化的NRLP3 炎癥小體的誘導(dǎo)ASC 和Caspase1 將pro-IL-1β 剪切為其成熟的生物活性形式，從而誘發(fā)炎癥反應(yīng)。且有研究表明姜黃素能夠減弱佛波酯刺激的巨噬細(xì)胞中NLRP3 炎癥小體的激活，這可能與姜黃素調(diào)節(jié)TLR4/MyD88/NF-κB 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路有關(guān)。本資料顯示，與CON 組比較，ASC 和NLRP3 蛋白在LPS 處理組中的表達(dá)顯著下調(diào)，而姜黃素給藥能顯著抑制LPS 引起ASC 和NLRP3 蛋白的降低。同時(shí)，Caspase1 蛋白在LPS 組和LPS+J 組中的表達(dá)明顯上調(diào)。提示姜黃素在大鼠肺泡巨噬細(xì)胞中的抗炎作用可能與調(diào)節(jié)ASC、Caspase1 和NLRP3 這三個(gè)炎癥反應(yīng)相關(guān)的蛋白有關(guān)，但具體調(diào)控機(jī)制需要進(jìn)一步探索。

綜上所述，姜黃素可以減輕LPS 誘導(dǎo)引起的大鼠巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)，其作用機(jī)制可能與抑制促炎因子的含量和調(diào)節(jié)ASC/NLRP3/Caspase1 蛋白表達(dá)有關(guān)。此研究結(jié)果可能為研究姜黃素在肺泡巨噬細(xì)胞中的調(diào)節(jié)作用提供一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。