任奎瑜，趙久成，郭 霜，王帥帥，張傳進，龐師嬋，楊尚東*

(1.廣西大學(xué)農(nóng)學(xué)院植物科學(xué)國家級實驗教學(xué)示范中心，廣西 南寧 530004；2.廣西欽州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，廣西 欽州 535000)

【研究意義】正紅菇(Russulavinosa)是真菌門(Eumycota)擔(dān)子菌亞門(Basidiomycotina)層菌綱(Hymenomycetes)擔(dān)子菌亞綱(Homobasidiomycetes)傘菌目(Agaricales)紅菇科(Russulaceae)紅菇屬(Russula)食用菌，又名紅椎菌、紅菌，是一種與楮樹、栲樹、椎木等的根系共生的菌根類真菌，在紅(白)椎林和特定的氣候、環(huán)境和土壤條件下才能生長[1-4]。正紅菇是一種十分珍貴的食用菌，含有豐富的蛋白質(zhì)、多糖、維生素和酶等，味道鮮美，具有提高免疫力、抗輻射、養(yǎng)血壯體、護膚美顏、防癌抗癌及延緩衰老等多種保健功效[5-7]。但由于生長環(huán)境特殊和相關(guān)技術(shù)限制，正紅菇仍處于野生繁殖狀態(tài)，未見大規(guī)模人工培育的報道。廣西欽州市靈山縣高李村位于浦北西側(cè)，盛產(chǎn)正紅菇，林地以紅椎、馬尾松、桉樹和荔枝等樹木為主。正紅菇發(fā)生于紅椎林，而相同區(qū)域的馬尾松林、桉樹林和荔枝園卻無法長出正紅菇，其根本原因尚不可知。因此，分析正紅菇生長繁殖與其著生林地土壤環(huán)境特征之間的關(guān)系，對人工栽培正紅菇或人為措施提高正紅菇產(chǎn)量具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】廣西紅椎林生長的紅菇屬真菌主要有葡酒紅菇(Russulavinosa)、鱗蓋紅菇(Russulalepida)、血紅菇(Russulasangninea)和薔薇色紅菇(Russularosacea)[1，8]。韋仕巖等[8]調(diào)查發(fā)現(xiàn)，紅椎林內(nèi)植被組成較簡單，主要分為喬木層、灌木層、草本層和地被物層，其中地被物層分布范圍較窄，僅在坡間的小溪兩側(cè)出現(xiàn)一些地衣和苔癬植物；正紅菇僅發(fā)生于紅椎林間，椎樹以外的植被只發(fā)揮生態(tài)調(diào)節(jié)作用。曾廣宇等[9]研究顯示，有機質(zhì)含量豐富、質(zhì)地疏松、透氣保濕性好、pH 4.5左右、肥力中等的土壤有利于正紅菇菌根的形成與發(fā)展，土壤肥力低的紅椎林地塊出產(chǎn)的正紅菇菇柄細而長，菌蓋薄且小，菌的等級與價格偏低，而施用有機肥可有效提高正紅菇的產(chǎn)量和品質(zhì)。近年來，雖然人們對菌根菌與植物的共生生物學(xué)特性研究取得了長足的進展，但許多認知仍停留在表面現(xiàn)象上，缺乏將菌根菌與宿主植物作為一個整體的相關(guān)研究，對菌根菌子實體形成的生理生化知識匱乏，導(dǎo)致人工條件下孢子不易萌發(fā)，菌絲體培養(yǎng)困難，難以形成子實體，而且大多數(shù)外生菌根菌難以用人工栽培方法建立與宿主之間的共生關(guān)系，導(dǎo)致至今仍無法進行人工栽培[10-11]。已有研究發(fā)現(xiàn)，植物根圈促生微生物不僅能提高外生菌根菌對植物根部的侵染效率[12]，還能與外生菌根菌互作，從而改善土壤肥力并促進植物對養(yǎng)分的吸收[13]?！颈狙芯壳腥朦c】目前，針對紅椎林土壤優(yōu)勢微生物類群及相應(yīng)肥力狀況及正紅菇生長繁殖與其著生林地土壤環(huán)境特征關(guān)系的研究鮮見報道。【擬解決的關(guān)鍵問題】基于傳統(tǒng)實驗方法和現(xiàn)代高通量測序技術(shù)，分析紅椎林土壤的生物學(xué)性狀及真菌多樣性特征，揭示正紅菇著生環(huán)境的土壤肥力和真菌優(yōu)勢菌群等特征，為正紅菇的人工栽培及人為提高正紅菇產(chǎn)量和品質(zhì)提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況

采樣地位于廣西欽州市靈山縣高李村(東經(jīng)109°16′31″，北緯22°12′30″)，地形以丘陵為主，屬亞熱帶季風(fēng)氣候，雨量充沛，陽光充足，年均氣溫21.7 ℃，年無霜期平均348 d，年均降水量1658 mm，且多集中在夏季。

1.2 試驗材料

試驗材料于2018年10月在靈山縣高李村采集。分別采集紅椎林土壤(A區(qū)域)、馬尾松林土壤(B區(qū)域)、桉樹林土壤(C區(qū)域)和荔枝園土壤(D區(qū)域)。取樣時去除土壤表層雜質(zhì)，采集各樹種根系附近3 cm的土壤。采用隨機取樣法，每個樹種選3棵樹，每棵樹取1個土壤樣本，裝入無菌封口袋并標(biāo)記。樣品帶回實驗室后，分為2部分，一部分置于室內(nèi)自然風(fēng)干，用于理化性狀分析；另一部分過10目篩網(wǎng)，分別用于生物學(xué)性狀和土壤真菌多樣性分析。

1.3 試驗方法

1.3.1 土壤可培養(yǎng)微生物數(shù)量測定 土壤可培養(yǎng)微生物數(shù)量采用稀釋平板法[14]測定，其中，細菌使用牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)，真菌采用馬丁氏瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)，放線菌采用改良高氏1號培養(yǎng)基培養(yǎng)。

1.3.2 土壤C、N、P循環(huán)相關(guān)酶活性測定β-葡糖苷酶(β-Glucosidase)采用Hayano[15]的方法測定，磷酸酶(Phosphodiesterase)采用Tabatabai[16]的方法測定，氨肽酶(Aminopeptidase)采用Ladd[17]的方法測定。

1.3.3 土壤微生物生物量測定 土壤微生物生物量C采用氯仿熏蒸提取法測定，土壤微生物生物量P采用氯仿熏蒸提取—磷鉬藍比色法測定，土壤微生物生物量N采用氯仿熏蒸提取——茚三酮比色法[18]測定。

表1 測序類型及引物序列Table 1 The sequence type and primer sequence

1.3.4 土壤真菌多樣性分析 土壤真菌多樣性分析由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司使用Miseq[19]平臺進行高通量測序，測序類型與引物序列見表1。

測序流程：首先通過基因組DNA抽提后，1.0 %瓊脂糖凝膠電泳基因組DNA。利用ITS1F(5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′)和ITS2R(5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′)引物對特定片段進行PCR擴增：95 ℃預(yù)變性3 min；進行27個循環(huán)(95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s)；72 ℃后延伸10 min；最終保溫10 ℃直至擴增結(jié)束。凝膠回收試劑盒切膠回收PCR產(chǎn)物，Tris-HCl緩沖液洗脫，2.0 %瓊脂糖電泳檢測，氫氧化鈉變性，產(chǎn)生單鏈DNA片段。

1.3.5 構(gòu)建物種群落柱形圖和土壤物種組成Venn圖 利用上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司提供的數(shù)據(jù)分析平臺I-Sanger進行多樣性在線分析并構(gòu)建物種群落柱形圖和土壤物種組成Venn圖，分析土壤真菌門水平和屬水平的群落多樣性，探究不同區(qū)域土壤真菌群落的結(jié)構(gòu)與優(yōu)勢菌群特征。

1.4 統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)采用Excel 2013和SPSS 21.0進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 紅椎林土壤的生物學(xué)性狀特征

2.1.1 紅椎林土壤的可培養(yǎng)微生物數(shù)量 由表2可知，A區(qū)域土壤的可培養(yǎng)細菌和放線菌數(shù)量均顯著高于B、C和D區(qū)域土壤(P<0.05，下同)，可培養(yǎng)真菌數(shù)量也以A區(qū)域最高，但與B、C和D區(qū)域土壤差異不顯著(P>0.05，下同)。此外，B區(qū)域的可培養(yǎng)細菌數(shù)量顯著高于C和D區(qū)域，可培養(yǎng)放線菌數(shù)量高于C和D區(qū)域，但差異不顯著。說明紅椎林土壤的可培養(yǎng)細菌與放線菌數(shù)量明顯高于馬尾松林、桉樹林和荔枝園，而可培養(yǎng)真菌數(shù)量無顯著差異。

在那一刻，她感受到內(nèi)心一塊沉靜的凹陷。她從未見過故鄉(xiāng)春梅。此刻她知道，它從未遠離。它是她身體內(nèi)部的骨骼和血肉。它不會消失，她的存在就是它在世間存活的憑據(jù)并且將繼續(xù)延續(xù)。

2.1.2 紅椎林的土壤酶活性 由表3可知，A區(qū)域土壤的β-葡糖苷酶活性顯著高于B、C和D區(qū)域，B、C和D區(qū)域土壤的β-葡糖苷酶活性以D區(qū)域最高且顯著高于B和C區(qū)域；土壤磷酸酶活性以C區(qū)域最高，A區(qū)域次之，D區(qū)域最低，但4個區(qū)域間無顯著差異；土壤氨肽酶活性以C區(qū)域最高，顯著高于其他區(qū)域，而A區(qū)域土壤的氨肽酶活性最低，且顯著低于其余區(qū)域。說明紅椎林土壤較馬尾松林、桉樹林和荔枝園土壤具有更高的β-葡糖苷酶活性，更低的氨肽酶活性。

表2 不同林(園)區(qū)土壤的可培養(yǎng)細菌、真菌和放線菌數(shù)量Table 2 The amount of cultivable bacteria，fungi and actinomycetes in different forest soils

注：同列數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，下同。
Note:Different lowercase letters in the same column represented significant difference. The same as below.

表3 不同林(園)區(qū)的土壤酶活性Table 3 Soil enzyme activities in different forest soils

表4 不同樹種根際土壤的微生物生物量C、N和P含量Table 4 Soil microbial biomass C，N and P content in rhizosphere soil of different forests (mg/kg)

2.1.3 紅椎林的土壤微生物生物量C、N、P含量 由表4可知，土壤微生物生物量C含量以D區(qū)域最高，顯著高于其他3個區(qū)域，C區(qū)域的土壤微生物生物量C含量最低，A區(qū)域次之，但A、B和C區(qū)域間無顯著差異；土壤微生物生物量N含量以B區(qū)域最高，顯著高于A、C和D區(qū)域，A區(qū)域的土壤微生物生物量N含量次之，但與C和D區(qū)域無顯著差異；土壤微生物生物量P含量以D區(qū)域最高，顯著高于A、B和C區(qū)域，C區(qū)域的土壤微生物生物量P含量最低，A區(qū)域次之，但A、B和C區(qū)域間無顯著差異。說明在4種林(園)中，紅椎林的土壤微生物生物量C、N、P含量總體上均處于中等偏低水平。

2.2 紅椎林的土壤真菌多樣性特征

2.2.1 土壤真菌的Alpha多樣性分析 稀疏曲線可反映樣品群落的多樣性，即檢驗測序深度可反映其所包含的微生物多樣性。從圖1可看出，當(dāng)測序數(shù)據(jù)量達50 000時，各樣品的稀疏曲線趨于平緩，說明測序數(shù)據(jù)量合理，完全可反映樣品中真菌菌群的多樣性信息，而繼續(xù)測定更多的數(shù)據(jù)量僅會產(chǎn)生少量新的OTU(Operational taxonomic units，一種分類水平，按序列之間的相似性進行聚類而形成的分類單元)。

Alpha多樣性指數(shù)能反映群落的豐富度和多樣性特征，Shannon指數(shù)與Simpson指數(shù)是衡量微生物多樣性的指數(shù)之一。由表5可知，不同林(園)區(qū)土壤的真菌多樣性Shannon指數(shù)、豐富度Ace指數(shù)和Chao指數(shù)均以D區(qū)域最高，且顯著高于A、B和C區(qū)域，而Simpson指數(shù)以A區(qū)域最高，且顯著高于B、C和D區(qū)域；各區(qū)域土壤真菌的多樣性Shannon指數(shù)排序為D區(qū)域>C區(qū)域>B區(qū)域>A區(qū)域，與Simpson指數(shù)排序相反。說明紅椎林的土壤真菌多樣性較低，與其他3種人工林相比結(jié)構(gòu)相對單一。

圖1 不同林(園)區(qū)土壤真菌OTU數(shù)量的稀疏曲線Fig.1 Rarefraction curve of OTU with fungi indifferent forest soils

2.2.2 土壤真菌優(yōu)勢群落分析 基于門分類水平發(fā)現(xiàn)，所測樣品由5個優(yōu)勢真菌門組成，分別為Basidiomycota(擔(dān)子菌門)、Ascomycota(子囊菌門)、Zygomycota(接合菌門)、Rozellomycota和未分類的真菌菌門(圖2)。其中，A區(qū)域中優(yōu)勢真菌類群占比大于1.0 %的優(yōu)勢菌門主要由擔(dān)子菌門、子囊菌門和接合菌門組成，以擔(dān)子菌門所占比例最大，為92.25 %，其次為子囊菌門和接合菌門；而B區(qū)域的真菌優(yōu)勢菌群組成與A區(qū)域存在差異，占比組成大于1.0 %的優(yōu)勢真菌門除擔(dān)子菌門和子囊菌門真菌與A區(qū)相同外，未分類的真菌菌門占比達18.53 %；C區(qū)域真菌優(yōu)勢菌群占比組成大于1.0 %的優(yōu)勢菌門由擔(dān)子菌門、子囊菌門、接合菌門和未分類的真菌菌門組成；D區(qū)域真菌優(yōu)勢菌群占比組成大于1.0 %的優(yōu)勢菌門最多，分別由擔(dān)子菌門、子囊菌門、接合菌門、Rozellomycota和未分類的真菌門組成(表6)。說明紅椎林土壤中擔(dān)子菌門真菌具有高占比，是主要優(yōu)勢菌門，而其余3個區(qū)域土壤呈現(xiàn)更多樣的優(yōu)勢菌門。

表5 不同林(園)區(qū)的土壤真菌Alpha多樣性指數(shù)Table 5 Alpha diversity index of fungi in different forest soils

表6 不同林(園)土壤中真菌門分類水平優(yōu)勢菌群組成占比Table 6 Percent of dominant community on phylum level of fungi in different forest soils (%)

圖2 不同林(園)區(qū)土壤真菌門分類水平的群落相對分布Fig.2 Relative distribution of community on phylum level of fungi in different forest soils

2.2.3 土壤真菌群落分析結(jié)果 物種Venn圖主要用于統(tǒng)計多個樣本中所共有和獨有的OTU數(shù)目，可直觀地表現(xiàn)不同林(園)區(qū)土壤真菌屬分類水平組成的相似性及重疊情況。結(jié)果(圖4)發(fā)現(xiàn)，在屬分類水平上，A區(qū)域含有真菌屬145個，B區(qū)域含有真菌屬118個，C區(qū)域含有真菌屬220個，D區(qū)域含有真菌屬276個，4種不同林(園)區(qū)土壤中有67個共有的真菌屬，占全部真菌屬的8.83 %；A區(qū)域有11個特有真菌屬，占A區(qū)域總真菌屬的7.59 %；B區(qū)域有8個特有真菌屬，占該區(qū)域總真菌屬的6.78 %；C區(qū)域有38個特有真菌屬，占該區(qū)域總真菌屬的17.27 %；D區(qū)域有100個特有真菌屬，占該區(qū)域總真菌屬的36.23 %。說明紅椎林土壤的特有真菌數(shù)量在真菌屬水平相對較少，與馬尾松林、桉樹林和荔枝園土壤真菌的相似性較大。

圖3 不同林(園)區(qū)土壤真菌屬分類水平的群落相對分布Fig.3 Relative distribution of community on genus level of fungi in different forests soils

表7 不同林(園)土壤中真菌屬分類水平優(yōu)勢真菌屬的組成占比Table 7 Percent of dominant community on genus level of fungi in different forest soils (%)

3 討 論

細菌占整個土壤微生物群落的70 %～90 %，在維護土壤健康、拮抗土傳病害及養(yǎng)分循環(huán)等方面發(fā)揮重要作用[20]。真菌在土壤微生物群落中所占比例僅次于細菌，可分解糖類、淀粉、纖維素、木質(zhì)素和單寧等多種有機物，并參與腐殖質(zhì)的形成和分解、進行氨化作用和硝化作用，尤其在酸性森林土壤有機質(zhì)的轉(zhuǎn)化中起重要作用[21]。本研究中，紅椎林土壤中的可培養(yǎng)細菌、放線菌數(shù)量均顯著高于其他3種林(園)區(qū)土壤，但可培養(yǎng)真菌數(shù)量與其他3種林(園)區(qū)土壤無顯著差異，可能與紅椎林中正紅菇的出菇和生長需要更苛刻的環(huán)境條件有關(guān)，如專一的根系分泌物、空氣、土壤溫度、水分及適宜的土壤pH和碳氮比等，而微生物數(shù)量多的環(huán)境可能更有利于形成和維護正紅菇出菇及生長所需的環(huán)境條件。

圖4 不同林(園)區(qū)土壤真菌屬分類水平的Venn圖Fig.4 Diagram of Venn on genus level of fungi in different forest soils

土壤酶參與土壤中幾乎所有有機物質(zhì)和營養(yǎng)元素的循環(huán)[22]，其活性不僅能指示土壤生態(tài)系統(tǒng)功能變化的多樣性和穩(wěn)定性[23]，亦是評價土壤健康和肥力水平的重要指標(biāo)[24]。本研究中，紅椎林土壤中除磷酸酶活性與其他林(園)區(qū)土壤無顯著差異外，β-葡糖苷酶活性顯著高于其他3種林(園)區(qū)土壤，氨肽酶活性顯著低于其他3種林(園)區(qū)土壤，表明與其他林(園)區(qū)土壤相比，紅椎林土壤具有特異的碳、氮循環(huán)相關(guān)酶活性。該現(xiàn)象可能與正紅菇的繁殖和生長均需適宜基質(zhì)(土壤)碳氮比緊密相關(guān)，即自然界可能以自我調(diào)節(jié)的方式調(diào)控土壤中涉及碳、氮循環(huán)相關(guān)酶的活性以實現(xiàn)正紅菇繁殖與生長所需的碳氮比。土壤微生物生物量C、N、P含量亦是衡量土壤質(zhì)量、指示土壤肥力和作物生產(chǎn)力的一個重要指標(biāo)[25]。紅椎林土壤中的微生物生物量C、N、P含量在4種林(園)區(qū)土壤中處于相對較低的水平，不僅低于人為干擾頻繁的荔枝園土壤，還低于以用材林為用途的馬尾松林和桉樹林，可能與對正紅菇的生境特性缺乏科學(xué)認知，目前仍無科學(xué)管理良策，導(dǎo)致僅有天然產(chǎn)出而鮮有人為投入，從而出現(xiàn)指示紅椎林土壤肥力狀況的微生物生物量偏低的現(xiàn)象有關(guān)。

Shannon指數(shù)是用于衡量物種多樣性的指數(shù)，Simpson指數(shù)表示在群落中隨機抽樣的個體屬于同一物種的概率，也用來衡量物種多樣性，Ace指數(shù)和Chao指數(shù)是衡量物種豐富程度的指數(shù)，數(shù)值的大小表示物種豐富度的高低。Ace和Chao指數(shù)越大，說明物種的豐富度越高；而Shannon 指數(shù)越大，Simpson指數(shù)越小，說明樣品的物種多樣性越高[26-28]。本研究基于高通量測序技術(shù)分析發(fā)現(xiàn)，4種林(園)區(qū)土壤中的真菌Alpha多樣性以人為干擾最頻繁的荔枝園土壤最高，可能與荔枝園在實際生產(chǎn)中進行更頻繁的施肥緊密相關(guān)；紅椎林土壤中的真菌Alpha多樣性在另3種林區(qū)土壤中呈現(xiàn)低值，可能與其更為單一的優(yōu)勢真菌門屬組成緊密相關(guān)?；陂T分類水平發(fā)現(xiàn)，紅椎林土壤中的優(yōu)勢真菌門雖然與其他3種林(園)區(qū)土壤相仿，主要由擔(dān)子菌門、子囊菌門、接合菌門、Rozellomycota和未確定的門類組成，但不同門類真菌的占比差異明顯。其中，擔(dān)子菌門是紅椎林土壤的主要優(yōu)勢真菌門類，組成占比達92.26 %，已有研究發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)土壤真菌屬于擔(dān)子菌門或子囊菌門[29]，但在用材林(馬尾松林和桉樹林)及荔枝園土壤中，擔(dān)子菌門真菌的占比明顯降低，呈現(xiàn)擁有更為多樣的優(yōu)勢真菌門類。在屬分類水平上，4種不同林(園)區(qū)土壤中雖然擁有相似的優(yōu)勢真菌屬組成，但紅椎林土壤中優(yōu)勢真菌屬組成更簡單，紅菇屬是紅椎林土壤中的優(yōu)勢真菌屬，占比達78.37 %；與之相比，馬尾松林土壤中紅菇屬真菌的占比僅有7.58 %，而桉樹林和荔枝園土壤中紅菇屬真菌占比為零。說明4種林(園)雖然具有相同的環(huán)境條件，但紅椎林中能產(chǎn)出正紅菇，而馬尾松林、桉樹林和荔枝園卻無法長出正紅菇的根本原因，應(yīng)為紅菇屬真菌的繁殖與生長需要專一的共生體與特定環(huán)境。

4 結(jié) 論

不同林(園)土壤肥力狀況不是正紅菇長出與否的決定性因素；紅椎林土壤中的擔(dān)子菌門紅菇屬真菌數(shù)量顯著高于馬尾松林土壤，而桉樹林和荔枝園土壤中紅菇屬真菌占比為零，即紅椎林土壤具有富集擔(dān)子菌門紅菇屬真菌的功能，且紅菇屬真菌的繁殖與生長需要專一的共生體與特定環(huán)境，是紅椎林出產(chǎn)正紅菇的根本原因。