楊 俐 ，鄧陽川 ，蘇燕燕 ，葉 萌 ，向 麗 ＊＊

（1. 中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所 中藥鑒定與安全性檢測(cè)評(píng)估重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 北京 100700；2. 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院溫江 611130）

砷是自然界中普遍存在的一種類金屬元素，是一種有毒、有害物質(zhì)，具有致癌性[1]。砷在土壤中以無機(jī)和有機(jī)兩種形式存在，主要以離子狀態(tài)存在，有三價(jià)砷As（Ⅲ）與五價(jià)砷As（Ⅴ）兩種價(jià)態(tài)，而As（Ⅲ）比As（Ⅴ）毒性高約100倍[2-4]。無機(jī)砷在動(dòng)物、真菌、人體中代謝主要是還原和氧化甲基化，進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的五價(jià)無機(jī)砷被還原為三價(jià)無機(jī)砷，再進(jìn)行甲基化代謝，形成多種含砷化合物，砷在體內(nèi)的代謝產(chǎn)物是導(dǎo)致機(jī)體發(fā)生砷中毒的主要因素[5-8]。雖然砷對(duì)人體具有很大的毒性，但在長(zhǎng)期的歷史演化過程中，一些微生物進(jìn)化出了各種砷代謝機(jī)制，能夠抵抗高濃度的砷，甚至還能利用砷作為能源[9-11]。微生物的砷代謝機(jī)制主要有As（Ⅲ）化能有機(jī)異養(yǎng)型和無機(jī)自養(yǎng)型氧化、As（Ⅴ）細(xì)胞質(zhì)還原和異化砷還原、As（Ⅲ）甲基化，根據(jù)微生物對(duì)砷的代謝機(jī)制不同將其分為砷氧化微生物、砷還原微生物和砷甲基化微生物[12-14]。砷氧化細(xì)菌能將As（Ⅲ）氧化為毒性較弱As（Ⅴ），砷甲基化細(xì)菌通常生成毒性較弱的有機(jī)砷產(chǎn)物，均能降低環(huán)境中砷毒性。砷還原細(xì)菌能將As（Ⅴ）還原為毒性更強(qiáng)的As（Ⅲ），As（III）更容易被植物或微生物吸收造成砷富集[5,15]。

冬蟲夏草為麥角菌科真菌冬蟲夏草菌[Cordyceps sinensis(Berk.) Sacc.] 寄生在鱗翅目蝙蝠蛾科（Hepialidae）昆蟲幼蟲上的子座和幼蟲尸體的干燥復(fù)合體，是我國(guó)傳統(tǒng)名貴中藥，冬蟲夏草與人參、鹿茸并列為我國(guó)“中藥三寶”[16-17]。野生冬蟲夏草普遍存在著重金屬砷含量超標(biāo)的問題，總砷含量為2.12-15.51 mg·kg-1[18-20]。在前期研究中，野生冬蟲夏草子實(shí)體轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫內(nèi)含有29 條與砷氧化細(xì)菌（Herminiimonas arsenicoxydans）染色體相似度較高的序列，其中25條的序列相似性為100%。但是在無菌條件下人工繁育的24批冬蟲夏草總砷含量為0.3-0.4 mg·kg-1[21]，遠(yuǎn)低于《中華人民共和國(guó)藥典》、《藥用植物及制劑外經(jīng)貿(mào)綠色行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)》、《GB 2762-2012 食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中污染物限量》等幾個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的最低限，在安全范圍內(nèi)。冬蟲夏草分布的青藏高原地區(qū)土壤砷背景值較高，提供了砷源[22-23]，因此，推測(cè)土壤中的耐砷細(xì)菌和冬蟲夏草自身對(duì)砷的代謝是導(dǎo)致冬蟲夏草藥材砷超富集的主要原因。

本研究擬對(duì)冬蟲夏草五個(gè)主要產(chǎn)地土壤中的耐砷細(xì)菌進(jìn)行分離、鑒定，篩選出一批耐砷細(xì)菌，探究菌株的氧化還原性和耐砷能力，為后續(xù)進(jìn)行冬蟲夏草砷超富集機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 土壤樣品采集

在四川省阿壩藏族羌族自治州小金縣（石槽溝、邊槽溝），四川省甘孜藏族自治州康定市（雅家埂、汪家溝），西藏那曲市比如縣等共5個(gè)冬蟲夏草生長(zhǎng)地采集土壤。采樣器在土壤表層3 cm 處用多點(diǎn)混樣的方法得到，放入封口袋密封。所有樣品做好標(biāo)簽并于4 ℃冰箱儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試劑及儀器

本研究的試劑及儀器包括：細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒購自天根生化科技北京有限公司；引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成；Fatty Acid Methyl Esters 購 自 Microbial ID 公 司 ；PCR 擴(kuò) 增 儀 ：Eppendorf Mastercycler X50；氣相色譜儀：安捷倫（Agilent）6890N；超凈工作臺(tái)：北京昌平長(zhǎng)城凈化設(shè)備有限公司；恒溫培養(yǎng)箱：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；API 20NE 購自 Bio merieux 公司；UV-2102 C 型紫外可見分光光度計(jì)：龍尼柯（上海）儀器有限公司。

2 方法

2.1 菌株分離純化

在CDM 培養(yǎng)基（1 L 體系：硫酸銨2.0 g；無水乙酸鈉2.0 g；酵母提取物0.5 g；胰蛋白胨1.0 g；葡萄糖0.2 g；固體培養(yǎng)基再加瓊脂粉15 g；pH=7.5±0.2）中分別加入砷酸鈉（As5+：10 mM）和亞砷酸鈉（As3+：2 mM），配成10 mmol·L-1砷酸鈉 CDM 培養(yǎng)基和 2 mmol·L-1亞砷酸鈉CDM 培養(yǎng)基。取土壤樣本1.0 g，分別加入上述液體培養(yǎng)基中，28℃，150 r·min-1培養(yǎng) 2-3 d 后，轉(zhuǎn)接 2 次。將第三次轉(zhuǎn)接的富集液按不同濃度梯度稀釋，涂布于含有相同濃度砷的對(duì)應(yīng)固體培養(yǎng)基上，待1-2 d 長(zhǎng)出菌落后，經(jīng)過多次的平板劃線分離，得到多個(gè)菌的純培養(yǎng)，編號(hào)并保存菌種。

2.2 耐砷細(xì)菌的鑒定

2.2.1 形態(tài)及生理生化特征分析

從分離純化的11個(gè)菌株中，選擇兩個(gè)生長(zhǎng)狀態(tài)較好的菌株進(jìn)行形態(tài)及生理生化特征分析。將純化后的單一菌落培養(yǎng)48 h，記錄菌落形狀、顏色、大小、透明度、黏稠度、邊緣是否光滑以及表面是否有褶皺等特點(diǎn)，挑取菌落并將其稀釋、涂片、革蘭氏染色，在顯微鏡下觀察菌落的形態(tài)及染色結(jié)果，進(jìn)而對(duì)菌株進(jìn)行初步鑒定。通過微生物脂肪酸快速鑒定系統(tǒng)（MIDI）和非腸道革蘭氏陰性桿菌鑒定系統(tǒng)（API 20NE）分析菌株生理生化特性。

2.2.2 菌株16S rRNA序列鑒定

28 ℃條件下，菌株在CDM 液體培養(yǎng)基中搖床培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，離心收集菌體，利用DNA 提取試劑盒提取目的菌株的基因組DNA，用細(xì)菌16S 基因通用27F（5?-AGA GTTTGATCCTGGCTCAG-3?）和 1492R（5?-GGTTACCTTGTTACGA CTT-3?）引物，PCR 體系20μL：2×Mix 10 μL，ddH2O 7μL，Primer-F 1μL，Primer-R 1μL，菌液 1μL；PCR 擴(kuò)增程序：94℃ 5min；94℃ 30s，55℃ 45s，72℃ 1min，38個(gè)循環(huán)；72℃ 10min；4℃，保存。反應(yīng)結(jié)束后，取5 μL PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物上樣于1.5%瓊脂糖凝膠，120 V 電壓，200mA 電流，電泳25 min，檢測(cè)擴(kuò)增效果。PCR 產(chǎn)物送北京擎科有限公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果通過在EzBioCloud（http://www.ezbiocloud.net/eztaxon）公共數(shù)據(jù)庫與已知模式菌進(jìn)行比較。利用軟件MEGA 6.0 按鄰接方法（Neighbor-Joining，N-J）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2.3 定性硝酸銀（AgNO3）染色實(shí)驗(yàn)

本研究采用定性硝酸銀篩選法[24]，用濃度為1 mmol·L-1的 AgNO3溶液對(duì)菌株進(jìn)行染色，利用 AgNO3與As(Ⅲ)和As(Ⅴ)發(fā)生顏色反應(yīng)的原理，鑒定所得到的菌株是砷氧化或還原細(xì)菌。將菌株分別接種于As(Ⅲ)、As(Ⅴ)的 CDM 培養(yǎng)液中培養(yǎng)，對(duì)照組接種大腸桿菌，培養(yǎng)24h 后向培養(yǎng)液中滴加AgNO3溶液，觀察菌液顏色變化，每個(gè)處理重復(fù)三次。

2.4 砷耐受能力的測(cè)定

以相同接種量將菌株分別置于含亞砷酸鈉、砷酸鈉的CDM 培養(yǎng)液中培養(yǎng)，As (Ⅲ)濃度分別為8 mmol·L-1、12 mmol·L-1、16 mmol·L-1、20 mmol·L-1，As (Ⅴ)濃 度 分 別 為 20 mmol·L-1、35 mmol·L-1、40 mmol·L-1、70 mmol·L-1，28℃，150 r·min-1培養(yǎng) 24 h，用紫外可見光分光度計(jì)在600 nm 處測(cè)吸光度值OD 600，以砷濃度（mmol·L-1）為橫坐標(biāo)，以吸光度值OD 600 為縱坐標(biāo)，繪制菌株耐砷濃度圖，每個(gè)處理重復(fù)三次。

3 結(jié)果與分析

3.1 菌株分離

從5 個(gè)主產(chǎn)地中分離得到11 株菌株，其中砷酸鈉（As5+：10 mM）處理中共分離到5 株菌，亞砷酸鈉（As3+：2 mM）處理中共分離到6 株菌。采用16S rRNA進(jìn)行初步鑒定后，11 個(gè)菌株主要屬于不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter）、芽孢桿菌屬（Bacillus），其中不動(dòng)桿菌屬占大多數(shù)。砷酸鈉（As5+：10 mM）處理的產(chǎn)地中分離的菌株是不動(dòng)桿菌屬、芽孢桿菌屬，亞砷酸鈉（As3+：2 mM）處理的產(chǎn)地中主要分離到不動(dòng)桿菌屬。從四川省小金縣和西藏那曲中各挑取一株優(yōu)勢(shì)菌株，分別編號(hào)為XB和XNQ用于后續(xù)鑒定分析。

3.2 菌株鑒定

3.2.1 菌落形態(tài)特征

菌株XB 革蘭染色為陰性、桿狀，常單個(gè)、成對(duì)或成團(tuán)存在，需氧。30℃培養(yǎng)24 h后菌落成米黃色，直徑為1 mm 左右，圓形，表面光滑，凸起。菌株XNQ 革蘭染色為陰性、桿狀，常單個(gè)、成對(duì)或成團(tuán)存在，需氧。30℃培養(yǎng)24 h 后菌落成米黃色，直徑為1.5 mm 左右，圓形，表面光滑，凸起。因此，菌株XB 和XNQ 均為革蘭氏陰性菌，菌株XNQ單個(gè)菌落直徑較XB大，其他形態(tài)特征相同。菌株形態(tài)及革蘭氏染色見圖1。

3.2.2 生理生化特征

菌株XB 和XNQ 的主要脂肪酸類型相同，均為C18:1 ω9c、C16:0、Summed Feature 3 (C16:1 ω7c/C16:1 ω6c)和C12:0，菌株XB 主要脂肪酸含量分別為31.34 %、23.76 %、23.69 %、6.04 %，菌株XNQ 主要脂肪酸含量分別為40.03%、21.68%、16.06%和4.63%。API 20NE 檢測(cè)顯示，菌株XB 陽性反應(yīng)有：阿拉伯糖、己二酸、蘋果酸、檸檬酸和苯乙酸，陰性反應(yīng)有：硝酸鉀、色氨酸、葡萄糖、精氨酸、尿素、七葉靈、明膠、對(duì)硝基-D-甲基半乳糖、甘露糖、甘露醇、N-乙酰-葡萄糖胺、麥芽糖、葡萄糖酸鹽和癸酸。菌株XNQ 陽性反應(yīng)有：阿拉伯糖、癸酸、己二酸、蘋果酸、檸檬酸和苯乙酸，陰性反應(yīng)有：硝酸鉀、色氨酸、葡萄糖、精氨酸、尿素、七葉靈、明膠、對(duì)硝基-D-甲基半乳糖、甘露糖、甘露醇、N-乙酰-葡萄糖胺、麥芽糖和葡萄糖酸鹽。主要差異在于菌株XNQ能利用癸酸，而XB不能利用癸酸。見表1。

圖1 菌株的形態(tài)及革蘭氏染色圖

表1 菌株XB和XNQ的脂肪酸組成

續(xù)表

3.2.3 16S rRNA基因的序列分析

瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果顯示，2 株細(xì)菌均可擴(kuò)增出約1400 bp 單一、清晰的序列條帶，擴(kuò)增效果較好。雙向測(cè)序結(jié)果運(yùn)用CodonCode Aligner V 7.0.1（CodonCode Co.,USA）進(jìn)行測(cè)序峰圖的校對(duì)拼接。獲得的基因片段在EzBioCloud（http://www.ezbiocloud.net/eztaxon）公共數(shù)據(jù)庫中與已知模式菌進(jìn)行比較。結(jié)果如表 2 所示，菌株 XB 獲得 16S 片段長(zhǎng) 1431 bp，與已知種Acinetobacter guillouiae的序列 APOS01000028 相似性為99.72%，相差四個(gè)堿基。菌株XNQ 獲得的16S片段長(zhǎng)1431 bp，與已知種Acinetobacter nosocomialis的序列APOP01000014 相似性為99.86%，相差兩個(gè)堿基。通過Mega 6.0 構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（見圖2），菌株XB 與A.guillouiae聚為一類，菌株XNQ與A.nosocomialis聚為一類。結(jié)合菌株形態(tài)特征、生理生化特性及16S rRNA序列來看，XB為A.guillouiae，XNQ為A.nosocomialis。

表2 菌株XB和XNQ的16 S序列比較分析結(jié)果

圖2 菌株XB、XNQ系統(tǒng)發(fā)育樹

3.3 菌株氧化還原性

AgNO3溶液與As（Ⅲ）反應(yīng)生成淺黃色沉淀，與As（Ⅴ）反應(yīng)生成淺棕色沉淀[24]。菌株培養(yǎng)24h 后，加入AgNO3溶液，菌株 XB 和 XNQ 的顏色變化如圖 3 所示。CK 組As（Ⅲ）培養(yǎng)液呈淺黃色，As（Ⅴ）培養(yǎng)液呈淺棕色，靜置一段時(shí)間后，離心管底部會(huì)析出對(duì)應(yīng)顏色的沉淀。XNQ、XB 菌液在As（Ⅲ）培養(yǎng)液中顯黃色，說明培養(yǎng)液中仍然是As（Ⅲ），菌株不具有砷氧化性。XNQ、XB 菌液在 As（Ⅴ）培養(yǎng)液中也顯黃色，可知XNQ、XB 菌株將As（Ⅴ）還原成As（Ⅲ），具有砷還原性，均是As（Ⅴ）還原細(xì)菌。

3.4 砷耐受能力測(cè)定結(jié)果

接種后測(cè)定菌液初始OD 600 約為0.05，隨著As（Ⅲ）、As（Ⅴ）濃度升高，菌株的OD 600越來越小，砷對(duì)菌株的抑制作用越大（見圖4）。隨著砷濃度的增加，菌株的生長(zhǎng)繁殖速率下降。兩種菌對(duì)As（Ⅲ）的耐受性相同，當(dāng)As（Ⅲ）的濃度達(dá)到20 mmol·L-1時(shí)，菌株不再生長(zhǎng)，對(duì)As（Ⅴ）耐受性也相同，當(dāng)As（Ⅴ）濃度達(dá)到70 mmol·L-1，菌株不再生長(zhǎng)。菌株對(duì) As(Ⅴ)的耐受性略高于As（Ⅲ），這可能是由于XB 和XNQ 都是As（Ⅴ）還原細(xì)菌，且As（Ⅲ）毒性遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于As（Ⅴ）。無論是As（Ⅲ）還是As（Ⅴ）培養(yǎng)液中，當(dāng)砷離子濃度相同時(shí)，培養(yǎng)液中菌株XB 的細(xì)菌數(shù)量多于菌株XNQ，說明XB菌株對(duì)砷的耐受性略強(qiáng)于XNQ菌株。

4 討論

從冬蟲夏草五個(gè)主要產(chǎn)地土壤中分離純化了一批耐砷細(xì)菌，共篩選出11 株菌株，分屬不動(dòng)桿菌屬和芽孢桿菌屬兩個(gè)屬，相比其他研究者從其他環(huán)境中分離出的耐砷菌株的種類較少，可能是產(chǎn)地地理環(huán)境差異造成的[25]。對(duì)四川省小金縣石槽溝和西藏那曲市比如縣的兩株菌進(jìn)行了形態(tài)、生理生化、16S rRNA 分析，鑒定結(jié)果分別為不動(dòng)桿菌屬A. guillouiae和A.nosocomialis。已有研究發(fā)現(xiàn)，A.guillouiae能降解苯酚，能抑制銅綠微囊藻的生長(zhǎng)，降低微囊藻素合成，能耐受高濃度NaCl 和多種重金屬離子[26-28]，A.nosocomialis是近年來最常出現(xiàn)的可引起嚴(yán)重人類疾病的醫(yī)院獲得感染條件致病菌[29]，但有關(guān)兩種菌對(duì)重金屬砷的耐受性的研究較缺乏。

圖3 硝酸銀（AgNO3）溶液染色結(jié)果

圖4 菌株對(duì)砷的耐受性

本研究得到兩種菌株對(duì)As（Ⅲ）、As（Ⅴ）的耐受性相 同 ，分別為 20 mmol·L-1、70 mmol·L-1。 Vivian Hsiu-Chuan Liao 等[30]從高砷污染水中分離10種兼性厭氧砷酸鹽還原菌，對(duì)As（Ⅴ）耐受性最高達(dá)到800 mmol·L-1，Sangeeta Shakya 等[31]發(fā)現(xiàn)史密斯芽孢桿菌（Bacillus smithii）能耐 1000 mg·L-1的砷酸鹽和 749 mg·L-1的亞砷酸鹽，吳丹等[32]發(fā)現(xiàn)假單胞菌屬、蒼白桿菌屬、芽孢桿菌屬、威廉氏菌屬和節(jié)細(xì)菌屬中的6 株細(xì)菌對(duì)As（Ⅴ）和 As（Ⅲ）的耐受性值分別高達(dá) 800 mmol·L-1和 20 mmol·L-1。由此可見，相對(duì)于已發(fā)現(xiàn)的其他菌株，研究分離的A.guillouiae和A.nosocomialis的耐砷能力不是特別高，但對(duì)As（Ⅴ）和As（Ⅲ）的耐受能力均表現(xiàn)出相同的趨勢(shì)，即對(duì)As（Ⅴ）的耐受能力高于As（Ⅲ）。

細(xì)菌在對(duì)高砷環(huán)境長(zhǎng)期的適宜中，進(jìn)化出砷轉(zhuǎn)化機(jī)制以抵抗不利環(huán)境，一般有As（Ⅲ）的氧化、As（Ⅴ）的還原、砷的甲基化三種[33]。已有研究表明，一些土壤中的耐砷細(xì)菌可以通過砷轉(zhuǎn)化機(jī)制促進(jìn)植物生長(zhǎng)，同時(shí)使植物體內(nèi)砷含量增加[34-35]。本研究發(fā)現(xiàn)的兩種菌都是As（Ⅴ）還原細(xì)菌，能將As（V）還原為毒性更強(qiáng)的As（III），然后利用亞砷酸鹽特異性轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白arsB 將As（III）排出體外，從而降低細(xì)胞內(nèi)毒性[36]。研究發(fā)現(xiàn)，砷在冬蟲夏草中主要以無毒的有機(jī)砷形式存在；有毒的無機(jī)砷僅占8.69%，且主要集中在蟲體中，多以亞砷酸鹽、砷酸鹽形式存在；子座中As（V）含量大于As（III），蟲體中As（III）大于As（V）[19,37]。金鵬飛等[38]發(fā)現(xiàn)，冬蟲夏草對(duì)砷是具有一定的甲基化代謝功能的。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以推測(cè)，耐砷細(xì)菌對(duì)冬蟲夏草砷富集可能有一定的促進(jìn)作用，砷還原細(xì)菌將土壤中As（V）還原為As（III），能促進(jìn)冬蟲夏草對(duì)As（III）的吸收，冬蟲夏草菌通過對(duì)As（III）進(jìn)行甲基化，將As（III）轉(zhuǎn)化為甲基胂酸，并進(jìn)一步代謝為各種含砷化合物，導(dǎo)致冬蟲夏草內(nèi)砷含量增加。

因此，在未來有必要深入研究耐砷細(xì)菌、冬蟲夏草自身砷代謝途徑與冬蟲夏草砷富集之間的關(guān)系，通過實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)解釋冬蟲夏草砷超富集機(jī)制。土壤中細(xì)菌種類繁多，本研究從冬蟲夏草產(chǎn)地土壤中篩選出的耐砷細(xì)菌種類較單一，僅對(duì)其中兩株作了詳細(xì)鑒定分析，均為砷還原細(xì)菌，后續(xù)還需對(duì)其他的菌株進(jìn)一步進(jìn)行鑒定分析，測(cè)定氧化還原性，為研究耐砷細(xì)菌對(duì)冬蟲夏草砷超富集機(jī)制試驗(yàn)提供科學(xué)依據(jù)。