周 宜，鄧藍(lán)冰，周游宇，孟祥龍

（1. 湖南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院 長沙 410005；2. 山西中醫(yī)藥大學(xué)中藥與食品工程學(xué)院 晉中 030619）

乳香、沒藥配伍應(yīng)用最早出現(xiàn)在《證治準(zhǔn)繩》中的“乳香止痛散”[1]中。乳香性味辛、苦、溫，功效活血定痛，消腫生肌，側(cè)重行氣活血；沒藥性味辛、苦、平，功效散瘀定痛，消腫生肌，側(cè)重活血化瘀。兩者在臨床上經(jīng)常相須為用，協(xié)同增效，為治療臟腑、經(jīng)絡(luò)不通之要藥，對改善風(fēng)濕痹痛、經(jīng)閉痛經(jīng)、跌打損傷瘀痛等疼痛具有較好的療效[2]。乳香、沒藥作為活血化瘀類常用中藥，二者經(jīng)常以藥對形式出現(xiàn)在臨床上，僅《中國人民共和國藥典》（1995 年版）和衛(wèi)生部頒發(fā)的中藥成方制劑標(biāo)準(zhǔn)中收載含乳香、沒藥的中成藥就有161個，因此臨床應(yīng)用非常廣泛。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是在系統(tǒng)生物學(xué)的理論指導(dǎo)下，對生物系統(tǒng)進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)分析的學(xué)科，是一個通過對多靶點藥物分子的分析，選取特定信號節(jié)點的過程。這個過程是通過多學(xué)科的技術(shù)和內(nèi)容進(jìn)行融合來完成的,包括系統(tǒng)生物學(xué)、多向藥理學(xué)、生物信息學(xué)和計算機科學(xué)等學(xué)科，從而進(jìn)行“藥物-靶點-疾病”等多層次網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建，藥物與疾病相關(guān)性研究，也可以闡明藥物作用機理，從而指導(dǎo)新藥的開發(fā)。因此，從上可知，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的研究視角和研究方法具有一定的整體性、系統(tǒng)性及復(fù)雜性，這幾個特點正好與中醫(yī)藥整體觀與辨證論治的原則不謀而合。乳香-沒藥藥對很早就出現(xiàn)在臨床應(yīng)用中，一方面在治療疼痛方面療效顯著，另一方面隨著其不良反應(yīng)報道的逐漸增多，藥理毒理方面的研究也取得了一些進(jìn)展[3]。比如在臨床治療中，使用乳香-沒藥藥對治療后會刺激患者的皮膚，使得患者皮膚過敏或者會出現(xiàn)胃腸道反應(yīng)，出現(xiàn)惡心嘔吐、食欲不振等[4]。本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究方法構(gòu)建乳香-沒藥藥對的“藥物-靶點-疾病”網(wǎng)絡(luò)，對乳香-沒藥藥對治療抗?jié)?、抗炎[5]、抗腫瘤[6]、炎癥性腸病和鎮(zhèn)痛五種疾病的作用機制進(jìn)行分析找出共性和高頻率的主要化合物、基因、靶點以及細(xì)胞通路解決或減少藥物的不良反應(yīng),為研究其作用機理和臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 方法

1.1 乳香、沒藥成分收集

通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫和分析平臺（http://ibts.hkbu.edu.hk/LSP/tcmsp.php，TCMSP）[7]，以“乳香”、“沒藥”為關(guān)鍵詞檢索出乳香、沒藥中的化學(xué)成分。

1.2 活性化合物和靶標(biāo)蛋白的篩選

目前對乳香-沒藥藥對和靶點的篩選無相關(guān)文獻(xiàn)及報道，本研究旨在對乳香-沒藥藥對全化合物進(jìn)行活性化合物篩選，從而構(gòu)建“藥物-疾病-靶點”網(wǎng)絡(luò)，以此探究乳香-沒藥藥對的藥效機制所以不以生物利用度（OB）和類藥性（DL）進(jìn)行篩選活性化合物。

1.3 疾病靶點的篩選

通過在線人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫（http://www.omim.org/,OMIM，）[8]，人類基因數(shù)據(jù)庫（GeneCards，https://www. genecards. org/）[9]，分 別 以“ 抗 炎/Antiinflammatory”，“ 鎮(zhèn) 痛/Analgesia”，“ 抗 腫 瘤/Antitumor”，“ 抗 潰 瘍/Anti-ulcer”，“ 炎 癥 性 腸 病/Inflammatory bowel disease”為關(guān)鍵詞檢索與抗抗?jié)?、抗炎、抗腫瘤、炎癥性腸病和鎮(zhèn)痛相關(guān)的基因。

1.4 韋恩圖的構(gòu)建

分別將藥物和疾病靶點上傳至在線韋恩圖（http://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）, 在線得到活性化合物與抗?jié)?、抗炎、抗腫瘤、炎癥性腸病和鎮(zhèn)痛五種疾病的交集基因。

1.5 靶標(biāo)蛋白基因名的確定及化合物-靶點網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

查詢靶標(biāo)蛋白對應(yīng)的基因名用到以下公開的免費數(shù)據(jù)庫，分別是全球蛋白資源數(shù)據(jù)庫（UniProt，https://www.uniprot.org/）[10]、醫(yī)學(xué)文獻(xiàn)檢索服務(wù)系統(tǒng)（Pub Med，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed）[11]，人類基因組數(shù)據(jù)庫（HGNC，https://www.genenames.org/）等，并用Cytoscape 3.7.1(http://cytoscape.org/)軟件構(gòu)建化合物-靶點網(wǎng)絡(luò)，分析化合物和靶點間的度（degree）值。

1.6 蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)（PPI）的構(gòu)建

借助蛋白質(zhì)相互作用關(guān)系數(shù)據(jù)庫（STRING 11.0，https://string-db.org），將乳香-沒藥對與五種疾病的交集基因分別上傳至STRING 數(shù)據(jù)庫，在線獲取乳香-沒藥藥對與五種疾病的蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)。

1.7 核心靶點的通路分析

分別將乳香-沒藥藥對治療抗?jié)?、抗炎、抗腫瘤、炎癥性腸病和鎮(zhèn)痛的蛋白靶點上傳至生物學(xué)信息注釋數(shù)據(jù)庫（DAVID，https://david.ncifcrf.gov/home.jsp），在線進(jìn)行基因本體（GO）生物學(xué)過程富集分析和基于京都基因與基因組百科全書（KEGG）代謝通路富集分析,并借助Cytoscape 3.7.1（http://www.cytoscape.org/）軟件繪圖，使其結(jié)果可視化。

2 結(jié)果

2.1 藥物靶點和疾病靶點數(shù)據(jù)的篩選

以1.2 項下相關(guān)條件進(jìn)行檢索，共篩選出乳香、沒藥中403 個化學(xué)成分和1949 個靶點蛋白；其中乳香化學(xué)成分占127 個，蛋白靶點占659 個。鑒于文章篇幅，故其活性化合物基本信息見附表1。

2.2 乳香-沒藥藥對與五種疾病的交集基因

按1.3項下，分別按照相關(guān)檢索條件將每種疾病的OMIM 數(shù)據(jù)庫與GeneCards 數(shù)據(jù)庫的在線檢索結(jié)果合并，得出五種疾病的相關(guān)基因靶點。通過數(shù)據(jù)庫找出乳香-沒藥藥對活性化合物247個活性靶點，抗?jié)?245個相關(guān)基因，抗炎873個相關(guān)基因，抗腫瘤1963個相關(guān)基因，炎癥性腸病4588個相關(guān)基因，鎮(zhèn)痛996個相關(guān)基因。

按1.4 項下，分別將藥物和疾病靶點上傳至在線韋恩圖得出乳香-沒藥與抗?jié)兿嚓P(guān)基因交集基因有181 個，與抗炎相關(guān)基因交集基因有120 個，與抗腫瘤相關(guān)基因交集基因有140 個，與炎癥性腸病相關(guān)基因交集基因有184 個，與鎮(zhèn)痛相關(guān)基因共有142 個，見圖1。乳香-沒藥藥對與五種基本高頻基因共有79 個見表1。乳香-沒藥與五種疾病交集基因列表見附表2。

2.3 “藥物-靶點-疾病”交互網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

按1.5 項下相關(guān)操作，基于Cytoscape 3.7.1（http://www.cytoscape.org/）軟件構(gòu)了建乳香-沒藥藥對與五種疾病的“藥物-靶點-疾病”交互網(wǎng)絡(luò)，見圖2。根據(jù)乳香-沒藥藥對與五種疾病的“藥物-靶點-疾病”交互網(wǎng)絡(luò)，總結(jié)出化合物所屬的類別，見圖3。

圖1 乳香-沒藥藥對與五種疾病的韋恩（Venn）圖

表1 乳香-沒藥藥對與五種疾病高頻基因

乳香-沒藥藥對針對上述五種疾病治療的藥效部位為揮發(fā)油類成分，如L-乙酸冰片酯（LBornyl acetate）、L-香芹酮（L-carvone）、β-波本烯（β-Bourbonene）、β-欖香烯（β-elemene）、大豆苷元（Daidzein）和桃金娘醛（myrtenal）等，在抗?jié)儭⒖寡?、抗腫瘤、炎癥性腸病和鎮(zhèn)痛五種疾病中揮發(fā)油類成分分別占87.50%、81.21%、80.00%、86.45%、78.65%，就此推知，揮發(fā)油類為乳香-沒藥藥對治療五種疾病的高頻化合物種類；另外高頻共性樹脂類成分主要有丁酸芳樟酯（linalyl butyrate）、α-古蕓香烯（α-gurjunene）、卡巴雌二醇（cabraleadiol）和 O-乙酰基-β-乳香脂酸（O-acetyl-β-boswellic acid）等。

2.4 乳香-沒藥藥對與五種疾病的蛋白相互作用核心網(wǎng)絡(luò)（PPI）的構(gòu)建

按1.6 項下相關(guān)操作，借助蛋白質(zhì)相互作用關(guān)系數(shù)據(jù)庫（STRING 11.0，https://string-db.org），分別構(gòu)建出乳香-沒藥與五種疾病的相互作用核心網(wǎng)絡(luò)圖（PPI），見圖 4，5 種疾病的 PPI 網(wǎng)絡(luò)圖分析，見附表3，乳香-沒藥藥對與五種疾病的高頻共性靶點，見表2。

乳香-沒藥藥對與五種疾病的PPI 網(wǎng)絡(luò)圖中心點均為蛋白激酶B1（AKT1），此外，頻率較高的蛋白還有白細(xì)胞介素6（IL-6）、血管內(nèi)皮生長因子A（VEGFA）、前列素內(nèi)環(huán)氧化物合成酶2（PTGS2）、絲裂原活化蛋白激酶1（MAPK1）等。

經(jīng)對比分析，共得到20個高頻共性靶點，其中，蛋白激酶B1（AKT1）通路是膜受體信號向細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)的主要信號通路，能對凋亡相關(guān)的蛋白進(jìn)行調(diào)節(jié)，以維持細(xì)胞存活及增殖和抑制細(xì)胞凋亡[12]。蛋白激酶B（protein kinases B，PKB）作為信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的重要調(diào)節(jié)因子，主要通過而磷脂酰肌醇3 激酶（phosphatidyl inositol 3kinase，PI3K）/蛋白激酶B（PI3K/PKB）是絲氨酸/蘇氨酸（Ser/ Thr）蛋白激酶家族的主要成員之一，其主要作用是調(diào)節(jié)信號途徑調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝、細(xì)胞周期，促進(jìn)細(xì)胞生長和增殖并抑制細(xì)胞凋亡的作用[13]并且能將細(xì)胞外刺激信號傳遞到細(xì)胞核，在周圍缺血半暗帶（ischemic penumbra，IP）區(qū)損傷級聯(lián)反應(yīng)中發(fā)揮重要作用[14]。血管內(nèi)皮生長因子A（VEGFA）是一種高度特異性的促血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子，特別是在平衡新血管的形成并使血管通透性增加以及現(xiàn)有血管的維持和重塑方面起重要作用[15]。白細(xì)胞介素6（IL-6）是一種多效性的促炎細(xì)胞因子，可在多種自身免疫性疾病的病理過程中起重要作用[16]。

表2 乳香-沒藥藥對與五種疾病高頻靶點度值

圖3 乳香-沒藥藥對治療五種疾病的藥效化合物歸類

2.5 基因本體（GO）功能富集分析

按1.7 項下，分別將乳香-沒藥藥對治療抗炎、鎮(zhèn)痛、抗腫瘤、抗?jié)兒脱装Y性腸病的蛋白靶點上傳至DAVID 數(shù)據(jù)庫，在線得到五種疾病的GO 條目數(shù)其中抗?jié)儷@得166 條富集結(jié)果，抗炎癥獲得150 條富集結(jié)果，抗腫瘤獲得134 條富集結(jié)果，炎癥性腸病獲得157條富集結(jié)果，鎮(zhèn)痛疾病獲得157條結(jié)果。其可視化結(jié)果見圖5。得到8個高頻共性條目，分別為受體配體活性（receptor ligand activity）、輔因子結(jié)合（cofactor binding）、細(xì) 胞 因 子 受 體 結(jié) 合（cytokine receptor binding）、細(xì)胞因子活性（cytokine activity）、四吡咯結(jié)合（tetrapyrrole binding）、血紅素結(jié)合（heme binding）、泛素樣蛋白連接酶結(jié)合（ubiquitin-like protein ligase binding）、DNA 結(jié)合轉(zhuǎn)錄激活劑活性（DNA-binding transcription activator activity）。其中血紅素結(jié)合（heme binding）是在線粒體及胞質(zhì)中協(xié)作完成，由此需要胞質(zhì)線粒體的物質(zhì)跨膜運輸，血紅素合成起始需要將胞質(zhì)中的甘氨酸及δ-氨基酮戊酸合成酶2（δaminolevulinatesynthase 2,ALAS2）運送進(jìn)線粒體內(nèi)，而合成產(chǎn)物δ-氨基酮戊酸（δ-aminolevulinate,ALA）需要被運送出線粒體進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)[17]。泛素樣蛋白連接酶（ubiquitin-like protein ligase binding）屬于環(huán)指結(jié)構(gòu)域蛋白家族[18]，它能夠特異性識別并結(jié)合目標(biāo)蛋白，主要包括 HECT 結(jié)構(gòu)域（homologous to E6-APCterminus,HECT）、環(huán)指結(jié)構(gòu)域和U 形箱式結(jié)構(gòu)域（U-box）蛋白三大家族；細(xì)胞因子可以分為淋巴因子（lymphokine）、單核因子（monokine）、非淋巴細(xì)胞（Non-lymphocyte），其中淋巴因子中IL-6的生物學(xué)功能具有多樣性，在機體的免疫調(diào)節(jié)、造血調(diào)控、炎癥反應(yīng)等過程中均發(fā)揮著重要的作用所以細(xì)胞因子活性（cytokine activity）與炎癥[19]相關(guān)。

2.6 基于京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路富集分析

圖4 乳香-沒藥藥對與五種疾病的相互作用核心網(wǎng)絡(luò)圖（PPI）及高頻節(jié)點分析

按1.7 項下，分別將乳香-沒藥藥對治療抗炎、鎮(zhèn)痛、抗腫瘤、抗?jié)兒脱装Y性腸病的蛋白靶點上傳至DAVID 數(shù)據(jù)庫，在線得到五種疾病的KEGG 通路數(shù)其中抗?jié)儭⒖寡?、抗腫瘤、炎癥性腸病、鎮(zhèn)痛分別篩選到 158 條、148 條、148 條、153 條、151 條信號通路。其可視化結(jié)果見圖6。共得到6條高頻共性KEGG 通路，分別為卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染（Kaposi′s sarcoma-associated herpes virus infection）、乙型肝炎（Hepatitis B）、人 巨 細(xì) 胞 病 毒 感 染（Human cytomegalovirus infection）、糖尿病并發(fā)癥的AGERAGE 信 號 通 路（AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications）、PI3K-AKT 信號通路（PI3KAkt signaling pathway）、流體剪切應(yīng)力與動脈粥樣硬化（Fluid shear stress and atherosclerosis）?？úㄎ魅饬鱿嚓P(guān)皰疹病毒感染（Kaposi′s sarcoma-associated herpes virus infection）包括病毒原發(fā)感染和病毒裂解期蛋白，它能夠誘導(dǎo)多種細(xì)胞因子的表達(dá)與分泌，如促血管生成因子和炎癥因子，并且促進(jìn)病灶的血管生成、炎癥浸潤和腫瘤播散[20]。PI3K-AKT 信號通路（PI3K-Akt signaling pathway）過度表達(dá)和活化與腫瘤的進(jìn)展密切相關(guān)。上游分子通過與PI3K 結(jié)合，使其構(gòu)象發(fā)生改變，從而磷酸化激活A(yù)kt，Akt 的活化能調(diào)控其下游分子，參與腫瘤調(diào)控通路[21]。

圖5 乳香-沒藥藥對與五種疾病的基因本體（GO）功能富集分析

3 討論

到目前為止，有關(guān)乳香-沒藥藥對的化學(xué)成分和藥理作用研究較多，且研究比較深入透徹。乳香為橄欖科植物卡氏乳香樹（Boswellia carterii Birdw）。乳香最早記載于《明醫(yī)別錄》，其被列為上品，性味辛、苦，溫，入心、肝、脾經(jīng)[22]?，F(xiàn)代研究表明乳香中的主要化學(xué)成分包括揮發(fā)油（3%-8%）、樹脂（60%-70%）、樹膠（27%-35%）以及少量的雜質(zhì)[23]。沒藥（Com-miphore myrrha Engl）最早記載于宋代的《開寶本草》，來源于橄欖科植物地丁樹Commiphora myrrha Engl.或哈地丁樹Commiphora molmol Engl.的干燥樹脂。具有悠久的藥用歷史，為常用活血化瘀類中藥[24]，沒藥性味辛、苦，平，歸心、肝、脾經(jīng)，具有特異的香氣，善于活血止痛，消腫生肌?，F(xiàn)代的藥理學(xué)研究表明，沒藥的主要化學(xué)成分為樹脂、樹膠和揮發(fā)油等，且主要化學(xué)成分包括揮發(fā)油（2.5%-9.0%）、樹脂（25%-35%）、樹膠（57%-65%），水分及其它雜質(zhì)約為（3%-4%）[25]，具有抗炎、降血脂、鎮(zhèn)痛、保護(hù)肝臟等多種藥理作用?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究證明兩者均具有鎮(zhèn)痛、抑菌、抗胃潰瘍、抗氧化、降血脂抗炎、活血化瘀抗腫瘤等作用[26]。因此，乳香、沒藥的臨床配伍應(yīng)用從中醫(yī)理論可以理解為藥物相互作用中的同氣相求，兩者的配伍藥效作用協(xié)同增效。

圖6 乳香-沒藥藥對與五種疾病的基于京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路富集分析

基于網(wǎng)路藥理學(xué)特點與中醫(yī)整體觀和辨證論治的不謀而合，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法在中藥潛在活性成分和作用靶點的預(yù)測及中藥作用機制的闡述的研究中已有廣泛的應(yīng)用[27]。本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，從整體角度體現(xiàn)出了乳香-沒藥藥對多成分、多靶標(biāo)和多途徑的治療機制。

乳香與沒藥生品研末外用，能起到斂瘡生肌的作用，可以用來治療皮膚軟組織瘡瘍潰后久不愈的癥狀。由于生乳香、生沒藥具有氣味辛烈的特點，對胃腸道有較強的刺激性，容易引起嘔吐，故二者在臨床上普遍以炮制品內(nèi)服出現(xiàn)，能夠行氣、活血、止痛。二者生品經(jīng)醋制后刺激性大大減弱，便于內(nèi)服，且能夠增強活血止痛收斂生肌的功效[28]。 目前就二者藥效及刺激性部位尚存爭議，學(xué)者對二者炮制過程的內(nèi)在質(zhì)控化學(xué)部位莫衷一是，基于本研究推知揮發(fā)油類為乳香-沒藥藥對治療疾病的高頻化合物種類，在二者炮制加工過程中應(yīng)考慮揮發(fā)油類成分的量變及質(zhì)變。其中L-乙酸冰片酯（L-Bornyl acetate）具有止瀉、止痛、抑制家兔離體腸運動、鎮(zhèn)痛、抗炎等作用[29]；β-欖香烯（β- elemene）能夠顯著抑制人結(jié)腸癌細(xì)胞（SW480）增殖，引起細(xì)胞周期阻滯，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，并抑制腫瘤細(xì)胞集落形成[30]。大豆苷元（Daidzein）是大豆異黃酮中的一類，目前的研究發(fā)現(xiàn)大豆異黃酮具有誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡、抑制腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲以及抗腫瘤血管生成等作用[31]。 L-香芹酮（L- carvone）是一種從薄荷類物質(zhì)中提取出來的精油，屬于單萜類的天然產(chǎn)物，并廣泛應(yīng)用在食品工業(yè)和化學(xué)工業(yè)中的一種重要的香料。同時，以香芹酮為原料，還可以合成一些具有較好的抗癌、殺菌活性的香芹酮衍生物[32]。

本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，建立了“藥物-靶點-疾病”網(wǎng)絡(luò)、蛋白互作關(guān)系（PPI）網(wǎng)絡(luò)、基因本體（GO）功能富集分析以及基于京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路富集的分析，并由此得出乳香-沒藥藥對與抗?jié)?、抗炎、抗腫瘤、鎮(zhèn)痛和炎癥性腸病五種疾病的20 個高頻共性靶點，GO 高頻共性條目8 個，6條KEGG 高頻共性通路，綜合以上數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)乳香-沒藥中的揮發(fā)油類成分是治療上述五種疾病的主要化學(xué)成分。

4 結(jié)論

本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法探究乳香-沒藥藥對在抗?jié)?、抗炎、抗腫瘤、炎癥性腸病和鎮(zhèn)痛這五種疾病治療過程中的共性作用機制以及高頻共性靶點、高頻共性基因、高頻共性KEGG 通路等，為其深入的活性成分研究和及臨床應(yīng)用提供理論支撐和科學(xué)依據(jù)。