孫伯菊，吳麗麗，秦靈靈，張程斐，吳 悠，秦 帥，王明慧，劉銅華

（1. 北京中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院 北京 100028；2. 北京中醫(yī)藥大學(xué)科技處 北京 100028；3. 北京中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院 北京 102488；4. 北京中醫(yī)藥大學(xué)教育部中醫(yī)養(yǎng)生學(xué)重點實驗室 北京 100028；5. 成都中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院 成都 611137；6. 陜西中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院 陜西 712046）

自身免疫性甲狀腺炎（Autoimmune thyroiditis，AIT）屬于自身免疫性疾病，其特征性表現(xiàn)為血清中出現(xiàn)針對甲狀腺的自身抗體，主要以甲狀腺的炎癥破壞為主，其中橋本氏甲狀腺炎（Hashimoto thyroiditis，HT）最為典型，病理表現(xiàn)為：正常的濾泡結(jié)構(gòu)被浸潤的淋巴細胞，漿細胞及其淋巴細胞生發(fā)中心廣泛取代。甲狀腺濾泡分離，呈小片狀，濾泡變小萎縮，其內(nèi)膠質(zhì)稀疏，纖維化程度不等，間質(zhì)內(nèi)可見淋巴細胞浸潤[1]，是全世界甲狀腺功能減退的主要原因[2]。實驗室檢查以抗甲狀腺球蛋白抗體（anti-Tg）和抗甲狀腺過氧化物酶抗體（anti-TPO）升高為主要表現(xiàn)，HT的流行病學(xué)調(diào)查[3-5]顯示其發(fā)生主要與年齡、性別、種族有關(guān)，目前為止，對于本病尚無針對病因的確切治療措施，治療原則一般為糾正甲狀腺的功能異常和縮小顯著腫大的甲狀腺。有文獻[6]指出飲食中的碘、硒、維生素D 和谷蛋白會影響HT 的發(fā)生和發(fā)展，因此在臨床治療過程中，應(yīng)考慮飲食的輔助治療作用。

實驗?zāi)Ｐ偷慕τ谔剿骷膊〉陌l(fā)生機制及治療效果具有重要的意義，而對于HT 的實驗?zāi)Ｐ蜆?gòu)建，目前多采用實驗性動物模型，即研究者通過物理、化學(xué)和生物的致病因素作用于動物，造成動物組織、器官或全身的一定損害，出現(xiàn)某些類似人類疾病時的功能[7]。對于HT 的細胞實驗?zāi)Ｐ瓦x擇，目前多選用甲狀腺濾泡上皮細胞株Nthy-ori3-1進行相關(guān)機制研究，現(xiàn)將目前為止HT 實驗動物模型的動物選擇，模型構(gòu)建方法及模型評價進行相關(guān)綜述，并對HT 細胞實驗的細胞系選擇及機制研究進行綜述，為相關(guān)基礎(chǔ)實驗提供參考。

1 模型動物選擇

1976 年，出現(xiàn)了第一例經(jīng)新生小鼠胸腺切除術(shù)后誘導(dǎo)的自身免疫性甲狀腺炎動物模型，但存在成模率低，穩(wěn)定性差的特點[8]。1982 年又有學(xué)者[9]應(yīng)用 OS 雞研究自身免疫性甲狀腺炎，OS 雞會自發(fā)發(fā)展成具有HT 臨床特征及病理學(xué)特征的疾病模型。1988 年，開始使用免疫佐劑結(jié)合自身甲狀腺抗體免疫AUG 品系大鼠，并且發(fā)現(xiàn)抗甲狀腺球蛋白反應(yīng)與HT 患者的相似度達90%[10]。2007年以后，選擇鼠類作為HT動物模型的技術(shù)越發(fā)成熟，有研究[11]指出小鼠是構(gòu)建HT實驗?zāi)Ｐ偷慕^佳載體，由于甲狀腺球蛋白（Tg）是一種已知的小鼠和人類共同的甲狀腺自身抗原。通過查閱相關(guān)文獻[1]，目前構(gòu)建HT 的動物類型常見選擇為：Lewis大鼠、SD 大鼠、NOD 小鼠和 C57 小鼠，并且多為雌性鼠，因本病的流行病學(xué)顯示女性多發(fā)，且女性患病率高達1/30～1/10，與流行病學(xué)相一致。具體選擇這類品系鼠的原因[12-17]陳述如下：

1.1 雌性Lewis大鼠[16]

此種大鼠來源于Wistar 原種，最先由Lewis 繁殖，它的血清含有高水平的甲狀腺素，胰島素和生長激素，易感染引起自身免疫相關(guān)疾病。

1.2 雌性SD大鼠[17]

白色封閉群大鼠，是一農(nóng)場用Wistar 大鼠培育而成，較Wistar大鼠的適應(yīng)性和抗病能力強，對性激素敏感性高，可廣泛用于生物醫(yī)學(xué)研究。

1.3 雌性NOD小鼠[12]

此種小鼠為“非肥胖糖尿病/重癥聯(lián)合免疫缺陷”小鼠，其遺傳了自然殺傷（NK）細胞活性相對低的特性，為T 細胞、B 細胞、NK 細胞缺陷的嚴重聯(lián)合免疫缺陷動物模型，常用于免疫相關(guān)疾病研究。

1.4 雌性C57小鼠[13]

此種小鼠是一種常見的近交品系實驗鼠，其主要特性為補體活性高，較易誘發(fā)免疫耐受性，故多以轉(zhuǎn)基因鼠模擬人類的基因缺陷類疾病。

2 構(gòu)建實驗性HT模型的方法

2.1 動物模型誘導(dǎo)

HT 的發(fā)病機制是機體的自身免疫反應(yīng)，而構(gòu)建此疾病的動物模型方法主要是模擬疾病的發(fā)病機制而進行構(gòu)建，使用最多且成模率穩(wěn)定的模型構(gòu)建方法是通過皮下注射免疫佐劑并結(jié)合口服碘劑。通過閱讀文獻，將構(gòu)建HT的實驗動物模型總結(jié)如下：

2.1.1 免疫佐劑結(jié)合碘劑誘導(dǎo)

免疫佐劑有各種形式，具體陳列如下：鋁佐劑、油乳佐劑、微生物類佐劑、蜂膠佐劑、左旋咪唑佐劑、脂質(zhì)體佐劑、中藥佐劑及小肽類佐劑等，免疫佐劑可起到增強免疫反應(yīng)的效力。而誘導(dǎo)HT 動物模型選擇的免疫佐劑一般為油乳佐劑（弗氏佐劑），由于油乳佐劑可促進多種抗原產(chǎn)生高效價的抗體，使抗原連續(xù)刺激的時間相對延長，抗原接種的劑量減少，抗原接種的次數(shù)降低[14]。而過度的碘劑可以促進HT 甲狀腺濾泡上皮細胞凋亡，是HT發(fā)病的重要誘因[15]。但不同課題組采用此種方法誘導(dǎo)HT 動物模型時，開始誘導(dǎo)的起始時間、皮下注射部位和碘劑的濃度略有不同，具體陳述如下：

王向均等[16]采用雌Wistar大鼠，在適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，應(yīng)用高碘水和免疫佐劑相結(jié)合的方法，其中碘水的濃度為0.64 g·L-1，完全弗氏佐劑（CFA）充分乳化的豬甲狀腺球蛋白（TG）多點皮下注射大鼠的雙后足，通過將15 mg TG 溶解于15 ml 磷酸鹽緩沖液中，加入15 ml完全弗氏佐劑，并用注射器混合以將豬甲狀腺球蛋白充分乳化成油包水樣來制備乳劑。每天兩次，間隔兩天。在第5 周，將不完全弗氏佐劑（IFA）乳化的TG（與完全弗氏佐劑的配制方法相同）多次注入大鼠背部皮下，每周一次，共2 周，作為加強劑。在第7 周結(jié)束時，結(jié)果顯示模型組大鼠甲狀腺組織中的TgAb 和TPOAb 濃度顯著升高，但成膜率未提及。張程斐等[17]采用雌性Lewis 大鼠，第3 周時采用初次免疫，同樣采用TG與弗氏完全佐劑融合成的乳劑，第4-8周時進行加強免疫，采用TG 與弗氏不完全佐劑融合成的乳劑，但是皮下注射部位為大鼠的頸部、背部以及左右下腹部，造模時間為8 周，同時造模鼠飲用含0.064%碘化鈉的去離子水直到造模結(jié)束，結(jié)果顯示成模率達100%。鄒飛等[18]同樣復(fù)制了上述造模方法，但其初次免疫時間為第1 周，加強免疫時間為第2 周至第7 周，并且其皮下注射的部位為造模大鼠的背、腹腔、腿、頸，可實現(xiàn)HT 的動物模型造模，具體成模率未提及。唐偉等[19]在進行初次免疫后的第2、3、4 周進行加強免疫，且初次免疫時皮下注射部位為大鼠足墊部，加強免疫時于大鼠四肢內(nèi)側(cè)皮下多點注射。同時給予0.05%的碘化鈉喂養(yǎng)大鼠，結(jié)果顯示抗原、碘劑結(jié)合組效果最好，但成模率未提及。李大鵬等[20]采用碘劑配合TG 免疫的方法，用盧戈氏液配置碘水，小鼠服用碘水3 個月后，進行皮下注射TG 免疫，免疫方法為第1天用完全弗氏佐劑配合TG 溶液皮下注射，第3、7、14天再次以弗氏不完全佐劑配合Tg溶液皮下注射小鼠，只是處死小鼠48 h 前會在小鼠尾靜脈注射ConA 以充分激活淋巴細胞。實驗也證實應(yīng)用碘劑與甲狀腺球蛋白相結(jié)合的方式構(gòu)建HT 的模型具有可重復(fù)性，并且誘導(dǎo)實驗性自身免疫性甲狀腺炎效果更明顯[21]。

2.1.2 單純性碘劑誘導(dǎo)

碘的攝入量與HT的發(fā)病有較大的相關(guān)性[20]，對于自身免疫性甲狀腺炎來說，碘過量是這種疾病的促發(fā)因素[22]。1993 年Mooij等[23]發(fā)現(xiàn)高膳食碘攝入會加速導(dǎo)致BB 大鼠甲狀腺中局灶性淋巴細胞浸潤的發(fā)展。細胞實驗發(fā)現(xiàn)NOD.H-2h4 甲狀腺細胞，在非常低（4-8 μM）濃度的碘化鈉溶液中培養(yǎng)24 h，顯示出高水平（40%-55%）的細胞凋亡[24]。單純性碘劑誘導(dǎo)HT動物模型的動物選擇多為NOD 小鼠，因NOD 小鼠是一種自發(fā)的非肥胖糖尿病小鼠，實驗證實這種品系的小鼠是HT 的遺傳易感宿主，高碘飲食會導(dǎo)致NOD 小鼠甲狀腺球蛋白分子的免疫原性增加[25]。研究[26]也發(fā)現(xiàn)，在NOD 小鼠的飲水中加入0.05%碘化鈉，6-8周左右，小鼠的自身免疫性甲狀腺炎的發(fā)病率達到100%，并且這種炎癥反應(yīng)會在接下來的3-4 個月內(nèi)發(fā)展為慢性，這種小鼠的HT 模型優(yōu)點是模型較為穩(wěn)定，成模率高。缺點是此種小鼠造模周期長，誘導(dǎo)成模過程中若是發(fā)生動物死亡情況，會耗費大量的金錢和時間成本。

如Nagayama等[27]在NOD 小鼠的飲用水中加入碘化鈉進行HT 的動物模型構(gòu)建，結(jié)果發(fā)現(xiàn)碘化鈉可引起HT，并且發(fā)現(xiàn)放射線會加重小鼠的甲狀腺炎。Huaqin等[28]選擇0.05%NaI溶液處理NOD 小鼠5周，結(jié)果顯示，與正常組相比，模型組的TgAb 水平顯著增加（P＜0.05）。

2.1.3 單純性免疫佐劑誘導(dǎo)

TG 水平與 HT 癥狀呈正相關(guān)[29]，在誘導(dǎo) HT 病的實驗動物模型時，多選擇弗氏佐劑結(jié)合TG 皮下注射誘導(dǎo)。而研究[30]發(fā)現(xiàn)，甲狀腺過氧化物酶（TPO）作為雙重活性部位酶，與HT 病的發(fā)生也密切相關(guān)。這種建模方式的優(yōu)點是完全模擬自身免疫性甲狀腺炎的發(fā)病，缺點是步驟復(fù)雜，在不同品系小鼠中的結(jié)果存在不一致，且價格昂貴。

研究[31]選用完全弗氏佐劑乳化TG，于第7 天皮下注射到小鼠的尾部，在第14天時用不完全弗氏佐劑乳化TG，再次進行加強免疫，結(jié)果顯示模型組小鼠的血清中的甲狀腺自身抗體（anti-TPO 和anti-Tg）和甲狀腺炎程度明顯高于對照組。研究等[32]將重組鼠TPO(rmTPO)胞外域在完全弗氏佐劑中以1：1 的比例乳化，注射到8 周齡的C57Bl/6 的雌性小鼠的后足墊和背部皮下。7 天后，用不完全弗氏佐劑中乳化的相同劑量的rmTPO胞外域進行加強注射，結(jié)果發(fā)現(xiàn)從第21天開始，所有小鼠的血清中可檢測到針對rmTPO 的抗體，用rmTPO 免疫小鼠的淋巴結(jié)細胞顯示出對TPO 刺激劑量的依賴性增殖，并且在第50 天和第90 天處死的小鼠甲狀腺組織中顯示出不同程度的甲狀腺炎，伴隨單核細胞浸潤和甲狀腺濾泡破壞，而且與對照組小鼠相比，模型組小鼠顯示出更大程度的甲狀腺炎。2006年此團隊再次重復(fù)了重組鼠TPO(rmTPO)胞外域誘導(dǎo)自身免疫性甲狀腺炎的模型構(gòu)建，研究[33]表明TPO 是形成淋巴細胞性甲狀腺炎的自身抗原，并且肽540-559是TPO的免疫性T細胞抗原決定簇。

2.1.4 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染

轉(zhuǎn)染是真核細胞在一定條件下主動或被動導(dǎo)入外源DNA片段而獲得新表型的過程[34]。有學(xué)者[35]嘗試將Tg 質(zhì)粒cDNA 通過電穿孔的方法將其導(dǎo)入細胞內(nèi)，以期獲得一種甲狀腺自身免疫模型。方法為選用8周齡的雌性C3H/Hen 小鼠，將制備好的Tg cDNA 在小鼠麻醉狀態(tài)下注入小鼠的指定肌肉群中，并施加不同脈沖的電流，結(jié)果顯示電穿孔促進的cDNA 遞送并顯著增加了Tg反應(yīng)性抗體的水平，但未發(fā)生甲狀腺的淋巴細胞浸潤和甲狀腺功能減退。這種模型的構(gòu)建方法優(yōu)點是可以進行定點誘變，以研究分子不同部位在自身免疫性甲狀腺中起的作用，并且不需要使用佐劑。缺點是模型尚不能完全復(fù)制疾病，且技術(shù)手段尚不成熟。

免疫佐劑結(jié)合碘劑誘導(dǎo)，單純性碘劑誘導(dǎo)，單純性免疫佐劑誘導(dǎo)和質(zhì)粒轉(zhuǎn)染四種HT 動物造模方法的優(yōu)缺點見表1。

2.2 細胞實驗?zāi)Ｐ?/h3>

HT 的基礎(chǔ)實驗研究模型多選擇動物模型，而關(guān)于HT 的細胞研究方面，江蘇大學(xué)毛朝明課題組選擇用以下細胞系進行相關(guān)機制研究：人甲狀腺濾泡上皮細胞系Nthy-ori3-1。此課題組的細胞研究方法為：通過收集臨床HT 患者的血清進行前期相關(guān)細胞因子的篩選，然后觀察相關(guān)因子在此細胞系中的表達情況，并且通過抑制相關(guān)因子的表達及過表達相關(guān)因子，觀察相關(guān)細胞因子在HT 患者中的作用機制。如通過此細胞系的研究發(fā)現(xiàn)：相關(guān)炎性因子[干擾素-γ（IFN-γ），白細胞介素-23（IL-23），IL-1β]可通過影響甲狀腺上皮細胞相關(guān)通路改善HT 的疾病過程[36-38]。過量的碘會抑制自噬相關(guān)蛋白LC3B-II 的表達，并通過上調(diào)mTOR 來上調(diào)自噬發(fā)生。與此相一致，橋本甲狀腺炎患者的甲狀腺組織中mTOR 的水平較高，而自噬相關(guān)蛋白LC3B-II的水平較低，這表明過量的碘與HT的發(fā)生密切相關(guān)，過量碘會誘導(dǎo)甲狀腺上皮細胞的異常自噬[39]。通過此細胞系進行了一系列的機制實驗，結(jié)果顯示此細胞系可用來研究HT 相關(guān)病理機制，補充了HT細胞實驗的空白。

表1 HT動物模型造模方法比較

3 實驗?zāi)Ｐ驮u價指標

HT 的臨床診斷為甲狀腺腫大，甲狀腺功能檢查顯示抗甲狀腺球蛋白抗體（anti-Tg）和抗甲狀腺過氧化物酶抗體（anti-TPO）顯著升高，甲狀腺細針穿刺顯示甲狀腺組織中有大量淋巴細胞浸潤及纖維化。動物模型制備過程中，因無法進行動物的甲狀腺細針穿刺技術(shù)，且無法在動物存活期間進行甲狀腺病理切片分析，因此，結(jié)合HT 的臨床診斷，所以動物模型成模的指標為：動物血清中TgAb 和TPOAb 水平，其中，尤以血清中TPOAb 水平最重要。臨床結(jié)果也發(fā)現(xiàn)TPOAb 的水平與HT 組織病理學(xué)呈正相關(guān)[40]。存在的問題是，NOD小鼠可以自發(fā)產(chǎn)生TPOAb，因此一般無法使用人TPO 作為抗原進行測量。隨著技術(shù)的發(fā)展，有課題組[41]使用重組小鼠TPO作為抗原檢測，才成功檢測出小鼠血清中的TPOAb。因此，HT疾病模型在動物中的成模評價指標，應(yīng)以動物血清中的TPOAb水平為主。

4 討論

綜上所述，目前有多種方法可構(gòu)建HT 基礎(chǔ)實驗?zāi)Ｐ汀T 是一種自身免疫性疾病，西醫(yī)對于此病無確切的針對病因的治療，而對于此病，中醫(yī)藥的療效是顯著的。但研究相關(guān)作用機制需成熟且國際認可度高的實驗?zāi)Ｐ?，通過查閱國內(nèi)外相關(guān)文獻，目前為止，誘導(dǎo)HT 疾病模型的方法主要為：（1）免疫佐劑結(jié)合碘劑誘導(dǎo)。（2）單純性碘劑誘導(dǎo)。（3）單純性免疫佐劑誘導(dǎo)。（4）質(zhì)粒轉(zhuǎn)染。但價格合適，重復(fù)性高且成模率好的方法為皮下注射免疫佐劑聯(lián)合碘劑誘導(dǎo)的方式。而對于實驗動物的選擇，經(jīng)歷了大小鼠、OS 雞，最后選擇以大小鼠中幾種特定品系構(gòu)建模型，由于大小鼠具有繁殖力旺盛的特點，且可更好的模擬人HT 發(fā)病的機制，是最佳的構(gòu)建HT 疾病模型的動物選擇。

對于HT 細胞層面的機制探索，目前選用的主要是甲狀腺上皮濾泡細胞株Nthy-ori3-1，對于這方面的研究，江蘇大學(xué)毛朝明課題組研究較多，其課題組主要是通過臨床HT 患者的血清分析，然后再通過細胞株進行相關(guān)機制驗證。這也為研究HT 細胞層面的研究提供了很好的思路。HT 的實驗?zāi)Ｐ蜆?gòu)建是進行科學(xué)研究的難點與重點，目前中醫(yī)藥領(lǐng)域?qū)τ诖瞬〉难芯慷嗍桥R床患者的隨機對照試驗，而中藥療效的具體作用機制需相關(guān)基礎(chǔ)實驗的補充與完善。構(gòu)建HT 動物模型還在繼續(xù)探索完善中，每種HT 模型構(gòu)建都有各自的優(yōu)缺點，因此在基礎(chǔ)實驗過程中，應(yīng)根據(jù)本實驗室的實際特點，選擇合適的模型構(gòu)建方法。本文對橋本氏甲狀腺炎模型構(gòu)建的動物選擇、模型構(gòu)建方法及模型評價體系進行了簡單綜述，為相關(guān)科研工作者提供一些思路查找。