吳嚴(yán)冰

（鄭州大學(xué)體育學(xué)院，河南 鄭州 450000）

安絡(luò)小皮傘（Marasmiellus androsaceus） 因其有黑褐色、細(xì)長密集的針狀菌索，所以民間又稱鬼毛針、茶褐小皮傘，是一種生長在密林中的真菌，屬白蘑科 （Tricholomataceae） 皮傘屬 （Marasmius）[1]。安絡(luò)小皮傘菌是一種具有很高價(jià)值的中藥，含有多種鎮(zhèn)痛成份，常被用于治療跌打損傷、骨折等外傷，也用于偏頭痛、坐骨神經(jīng)痛和風(fēng)濕等病癥的鎮(zhèn)痛治療，具有通經(jīng)活絡(luò)，活血止痛的功效[2]。

1 安絡(luò)小皮傘多糖的鎮(zhèn)痛作用

安絡(luò)小皮傘中具有鎮(zhèn)痛作用的化學(xué)物質(zhì)有多種，有研究認(rèn)為是麥角甾醇等甾醇類化合物、羥基肉桂酸等有機(jī)酸，也有研究認(rèn)為是其多糖、糖蛋白類物質(zhì)，還有認(rèn)為是一些生物堿和黃酮類化合物具有鎮(zhèn)痛作用[2]。經(jīng)綜合考慮，提取有效成分加以分析，根據(jù)其成分理化性質(zhì)不同，利用特征顯色、沉淀反應(yīng)對安絡(luò)小皮傘有效成分進(jìn)行定性檢查。

2 安絡(luò)小皮傘生物堿類定性試驗(yàn)

制備酸性乙醇供試液用于檢查安絡(luò)小皮傘內(nèi)是否含有生物堿[3]。安絡(luò)小皮傘菌樣品粉末由湖北欣愷生物科技有限公司生產(chǎn)（含水量≤10%，乙醇提取物≥50%）。稱取安絡(luò)小皮傘粉末1 g，加入0.5%鹽酸乙醇溶液5 mL，在60℃水浴中回流15 min，立即過濾，得酸性乙醇提取液備用。

生物堿檢查采用硅鎢酸試驗(yàn)、碘化鉍鉀試驗(yàn)和碘化汞鉀試驗(yàn)3種方法來檢測[3]。觀察試管反應(yīng)現(xiàn)象，硅鎢酸試劑滴入后產(chǎn)生淺黃色或灰白色沉淀物；碘化鉍鉀滴入后產(chǎn)生淺黃色或紅棕色沉淀物；碘化汞鉀滴入后產(chǎn)生白色或淡黃色沉淀物。上述試驗(yàn)均表明安絡(luò)小皮傘粉末樣品中含有生物堿成分。

3 安絡(luò)小皮傘多糖含量檢測

通過安絡(luò)小皮傘中的多糖活性物質(zhì)測定和分析，以確定其藥理活性的主要成分。多糖的含量檢測方法采用比色法進(jìn)行檢測，應(yīng)用苯酚-硫酸法測定安絡(luò)小皮傘多糖中總糖含量。采用苯酚-硫酸法驗(yàn)證多糖檢測方法。

3.1 安絡(luò)小皮傘多糖樣品溶液制備

取安絡(luò)小皮傘粉末0.1 g、0.2 g、0.3 g、0.4 g、0.5 g、0.6 g、0.7 g、0.8 g、0.9 g、1.0 g，分別加蒸餾水至50 mL。放入恒溫水浴鍋在（90±2）℃條件下回流提取2 h。取出后得到安絡(luò)小皮傘多糖樣品溶液10組。

3.1.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作

取葡萄糖對照品溶液0、0.1 mL、0.2 mL、0.3 mL、0.4 mL、0.5 mL、0.6 mL、0.7 mL、0.8 mL，加蒸餾水至2 mL。加入濃度為6%苯酚溶液1 mL，快速混合均勻、再加入濃硫酸5 mL快速混合均勻。放入恒溫箱在（25±2）℃條件下靜置1 h。在500 nm波長處用紫外可見分光光度計(jì)測定吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

3.1.2 多糖樣品總糖含量測定

將安絡(luò)小皮傘多糖粉末稀釋至標(biāo)準(zhǔn)曲線之內(nèi)的濃度，得到多糖粉末稀釋液，在1 mL稀釋液中加入濃度6%的苯酚1 mL快速混合均勻，再加入濃硫酸5 mL快速混合均勻。放入恒溫箱在（25±2）℃條件下靜置1 h。在510 nm波長處用紫外可見分光光度計(jì)測吸光度，代入回歸方程求出樣品粗多糖中總糖含量。

3.1.3 測試溶液穩(wěn)定性

任取1份安絡(luò)小皮傘多糖樣品溶液，分別于顯色后 0、0.5 h、1 h、1.5 h、2 h、2.5 h、3 h 測定其于510 nm處的吸光度，對多糖樣品溶液的穩(wěn)定性進(jìn)行測量。

3.1.4 方法的精密度考察

計(jì)算上述10組安絡(luò)小皮傘多糖樣品的提取率、平均提取率以及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，以此考察方法精密度。

3.1.5 加樣回收率考察

任取5份安絡(luò)小皮傘多糖樣品溶液1 mL，分別加入無水葡萄糖1 mg，稀釋至適宜濃度，使其測量范圍在標(biāo)準(zhǔn)曲線之內(nèi)。按多糖含量測定方法顯色，根據(jù)安絡(luò)小皮傘多糖含量與葡萄糖加入量，加樣回收率（HR，%） 計(jì)算公式為：

式中：X1為測定的總量（mg·mL-1）；X2為樣品原含量（mg·mL-1）；M為加入量（mg）。

3.2 多糖含量檢測

3.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

標(biāo)準(zhǔn)曲線測量結(jié)果如表1所示。

由表1可知，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程y=12.38x+0.014 4，R2=0.998 6，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示。

表1 苯酚-硫酸法葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線結(jié)果Tab.1 Result of standard curve of phenol-vitriol

由圖1可知，葡萄糖在濃度范圍內(nèi)具有線性關(guān)系。

3.2.2 測試溶液穩(wěn)定性考察

在510 nm波長下每隔30 min檢測各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的吸光度，其吸光度隨時(shí)間變化如表2所示。

表2 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果Tab.2 Stability results

由表2可以看出，安絡(luò)小皮傘多糖樣品溶液吸光度在3 h內(nèi)變化不明顯，平均值為0.402，標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.52%，RSD僅有1.280%，符合含量測定的要求，樣品溶液穩(wěn)定性良好。

3.2.3 測試溶液精密度考察

10份樣品多糖含量測定結(jié)果見表3。

表3 精密度試驗(yàn)結(jié)果Tab.3 Precision of test results

有表3可知，平均含量值為4.072%，標(biāo)準(zhǔn)偏差為8.230%，RSD為2.020%，符合精密度要求。

3.2.4 加樣回收率考察

根據(jù)計(jì)算公式得回收率測定結(jié)果如表4所示。

表4 回收率試驗(yàn)結(jié)果Tab.4 Recovery test results

由表4可知，平均回收率為97.84%，RSD為2.49%，基本符合加樣回收率考察準(zhǔn)確度要求。

4 麥角甾醇的定性檢測

麥角甾醇又稱麥角固醇，是由酵母及麥角菌（Claveceps）產(chǎn)生的。因其從谷類患麥角菌病而產(chǎn)生的物質(zhì)中分離得到而得名，是維生素D的重要來源。甾醇類化合物有一定的抗炎鎮(zhèn)痛作用。

麥角甾醇的定性檢測利用其與碘化反應(yīng)的生成物[4]，在紫外線照射下有綠色熒光的特點(diǎn)來進(jìn)行檢測。取安絡(luò)小皮傘菌樣品粉末10 g，加入甲醇100 mL萃取，靜置24 h后加入濃度為5 mol·L-1的氫氧化鈉100 mL和的無水乙醇30 mL進(jìn)行皂化處理150 min，然后用水洗皂化液，加入石油醚或乙醚萃取可得萃取液。采用薄層色譜法顯色，取少量萃取液滴在色譜板上，將碘加熱升華至飽和狀，取層析板涼干后放入反應(yīng)40 s，觀察層析板發(fā)現(xiàn)有褐色斑點(diǎn)產(chǎn)生，隨后又消失，用長波紫外線照射可發(fā)現(xiàn)有斑點(diǎn)，證明萃取液中含有麥角甾醇物質(zhì)。

5 小鼠醋酸扭體法鎮(zhèn)痛試驗(yàn)

試驗(yàn)選用昆明小鼠10只，體重（22±3）g，由上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動物有限公司提供，生產(chǎn)許可SCXK（滬） 2018-0006。對試驗(yàn)動物進(jìn)行適應(yīng)性喂養(yǎng)，正常飼養(yǎng)條件，自由進(jìn)食進(jìn)水，適應(yīng)性喂養(yǎng)第3天腹腔注射0.8%的醋酸2 mL·100-1g-1，觀察小鼠有無腹部收縮、臀部扭曲或后肢伸蹬現(xiàn)象，對無表現(xiàn)的小鼠視為異常不適宜試驗(yàn)動物，予以剔除，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后進(jìn)行分組試驗(yàn)，按雌雄隨機(jī)分成2組，每組5只，試驗(yàn)組腹腔注射安絡(luò)小皮傘菌樣品溶液1 mL·100-1g-1，對照組腹腔注射生理鹽水1 mL·100-1g-1，30 min后再給2組小鼠注射0.8%的醋酸2 mL·100-1g-1，記錄小鼠20 min內(nèi)扭體的次數(shù)，取各組平均值為扭體次數(shù)。

小鼠醋酸扭體法鎮(zhèn)痛試驗(yàn)結(jié)果如表5所示。表5試驗(yàn)結(jié)果顯示，試驗(yàn)組與對照組相比，20 min內(nèi)扭體次數(shù)明顯減少（P＜0.05），具有顯著差異性，說明安絡(luò)小皮傘菌樣品溶液具有一定的鎮(zhèn)痛效果。

表5 安絡(luò)小皮傘菌樣品對小鼠扭體試驗(yàn)的影響Tab.5 Effect of Marasmiellus adrosaceus on writhing test in mice

6 小鼠熱板法鎮(zhèn)痛試驗(yàn)

對上述小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)第3天將熱板儀溫度調(diào)到55℃，將小鼠放置在墊板上，觀察小鼠有無舔足或逃離現(xiàn)象，剔除無舔足和有逃離現(xiàn)象的表現(xiàn)異常小鼠，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后進(jìn)行選擇雌性小鼠進(jìn)行分組試驗(yàn)，隨機(jī)分成2組，每組5只，試驗(yàn)組腹腔注射安絡(luò)小皮傘菌樣品溶液1 mL·100-1g-1，對照組腹腔注射生理鹽水1 mL·100-1g-1，熱板儀溫度調(diào)到55℃，注射后15 min、30 min、45 min各記錄1次小鼠痛反應(yīng)閾值，小鼠痛反應(yīng)閾值為小鼠放于熱板上到受刺激有舔足反應(yīng)的時(shí)間，如大于60 s按60 s記錄，取各組平均值為小鼠痛反應(yīng)閾值。小鼠熱板法鎮(zhèn)痛試驗(yàn)結(jié)果如表6所示。

表6 安絡(luò)小皮傘菌樣品對小鼠熱板試驗(yàn)的影響Tab.6 Effect Effect of Marasmiellus adrosaceus sample on hot plate test in mice

由表6可知，試驗(yàn)組與對照組相比，小鼠痛反應(yīng)閾值明顯增加（P＜0.01），具有顯著差異性，說明安絡(luò)小皮傘菌樣品溶液具有一定的鎮(zhèn)痛活性。

7 結(jié)論

安絡(luò)小皮傘內(nèi)含的生物堿、多糖和麥角甾醇類物質(zhì)，具有消炎、鎮(zhèn)痛的效果[5]。在對安絡(luò)小皮傘內(nèi)含的鎮(zhèn)痛物質(zhì)定性和定量檢測的基礎(chǔ)上，通過小鼠醋酸扭體和熱板鎮(zhèn)痛試驗(yàn)表明，安絡(luò)小皮傘中提取物中含有的鎮(zhèn)痛物質(zhì)，具有消除和緩解各種神經(jīng)痛的作用，對小鼠的外部熱刺激疼痛和體內(nèi)化學(xué)刺激疼痛均有減輕或消除效果。