余 婕閆夢真陳桂婷周婷婷李世剛,2

(1.三峽大學(xué) 醫(yī)學(xué)院,湖北 宜昌443002；2.湖北省長盛川青磚茶研究所,湖北 宜昌443000)

非酒精性脂肪肝(nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD)是指除酒精和其他明確的肝損傷因素引起,以肝細胞內(nèi)脂肪聚積和脂肪變性為主要特征的臨床病理綜合癥.NAFLD 已成為世界上最常見的慢性肝病,影響了我國約15%～20%的普通人群,在西方國家的患病率高達30%以上,且近年來有年輕化的趨勢[1-2].它包括一系列肝臟表現(xiàn),從非酒精性脂肪肝(也稱為脂肪變性)到非酒精性脂肪性肝炎,肝纖維化和肝硬化,最終可能發(fā)展為肝細胞癌[3-4],嚴重威脅著人類的健康.但是,目前各種抗NAFLD 藥物正處于臨床前開發(fā)階段,尚未有用于治療NAFLD 的特效藥物.因此,探索新穎高效且具有最小毒副作用的藥物,對防治NAFLD 具有理論及臨床應(yīng)用價值.

茶葉是我國常見的的飲品.其中,黑茶作為中國六大茶類之一,通常歸屬于后發(fā)酵茶,主產(chǎn)于湖南、湖北、四川、廣西等省地[5].黑茶含有較多有益的特有成分,能夠改善人體健康,并且具有良好的降脂減肥作用[6].青磚茶是我國黑茶中的一種,其保健功效顯著而深受人們喜愛,是西北高脂飲食地區(qū)少數(shù)民族的生活必需品[7].近年來研究表明,青磚茶具有明顯的抗氧化和降脂作用[8-9],但大多是宏觀水平的研究,其具體作用機理不明.NAFLD的重要特征是甘油三酯(Triglyceride,TG)的堆積,因此可通過建立體外脂肪變性模型來研究NAFLD.本研究旨在探討青磚茶水提物(green brick tea water extract,GBT-WE)對Hep G2細胞脂肪變性的影響,以期對其機制有進一步的了解,為NAFLD 的治療提供一定的實驗依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

青磚茶(湖北省長盛川青磚茶研究所提供)；Hep G2細胞(上海賽百慷生物技術(shù)股份有限公司)；胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)(浙江天杭生物科技有限公司)；MEM培養(yǎng)基(上海源培生物科技股份有限公司)；胰蛋白酶(吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司)；青鏈霉素混合液(HyClone公司,美國)；辛伐他汀(＞99%,細胞培養(yǎng)級)(大連美侖生物技術(shù)有限公司)；CCK-8 活力檢測試劑盒(Dojindo公司,日本)；油紅O 染液(南京建成科技有限公司)；TG 酶法測定試劑盒、總膽固醇(Total cholesterol,TC)酶法測定試劑盒、BCA 蛋白濃度測定試劑盒(均北京普利萊基因技術(shù)有限公司)；β-actin抗體(武漢谷歌生物科技有限公司)；固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白1c(Sterolregulatory element binding proteins 1c,SREBP1c)抗體(Santa Cruz Biotechnology公司,美國)；脂肪酸合成酶(Fatty acid synthase,FAS)抗體(Cell Signaling Technology公司,美國)；HRP標(biāo)記羊抗兔二抗和HRP標(biāo)記羊抗鼠二抗(均武漢賽維爾科技有限公司)；ECL顯影液(碧云天生物技術(shù)有限公司).

1.2 實驗方法

1.2.1 青磚茶水提物的制備

將青磚茶敲碎,按照1∶15的質(zhì)量比,將青磚茶在100℃沸水中熬煮40 min,將煮好的茶湯通過液體濃縮分離罐濃縮至原濃度的16倍,最后將濃縮后的茶湯-80℃過夜,次日進行冷凍干燥,得到青磚茶水提物粉末,并將其置于4℃冰箱保存待用.

1.2.2 細胞的培養(yǎng)

用含10%FBS 的MEM培養(yǎng)基培養(yǎng)HepG2 細胞,置于CO2體積分數(shù)為5%、37℃培養(yǎng)箱中,3～5 d傳代,取對數(shù)生長期細胞用于后續(xù)實驗.

1.2.3 Hep G2細胞脂肪變性模型的建立

設(shè)置正常對照組和模型組,模型組分別利用含有30%、50%、70%的FBS培養(yǎng)液培養(yǎng),采用CCK-8法、ELISA 法(測定TG、TC)以及油紅O染色來確定造模劑量.

1.2.4 CCK-8法檢測細胞的增殖

Hep G2細胞以每孔4 000 個細胞接種于96 孔板,待細胞過夜貼壁后加藥.將GBT-WE設(shè)置4個質(zhì)量濃度,分別為120μg/m L、240μg/m L、360μg/m L、480μg/m L,每個質(zhì)量濃度設(shè)5個平行孔,2個空白對照孔,24 h后依照CCK-8試劑盒說明書每100μL 完全培養(yǎng)基加10μL CCK-8試劑,于CO2體積分數(shù)為5%、37℃培養(yǎng)箱中作用2h 后,用酶標(biāo)儀測定A450 nm 值.以對照組為基礎(chǔ),計算實驗組細胞增殖率.

1.2.5 GBT-WE干預(yù)Hep G2細胞脂肪變性

干預(yù)實驗分為5組:1)空白對照組(Control)；2)模型組(Model)；3)GBT-WE 低劑 量 組；4)GBT-WE高劑量組；5)Simvastatin組.Simvastatin是一種降脂藥,臨床上常用來治療NAFLD,主要用來觀察GBTWE的降脂能力是否與常規(guī)藥物效果一致[10].且質(zhì)量濃度設(shè)置為5μg/m L[11].除正常對照組外,其余各組均利用高質(zhì)量濃度FBS造模(濃度依據(jù)1.2.3所確定的劑量)48 h；除正常對照組和模型組外,其余各組造模成功后分別加入不同質(zhì)量濃度的藥物(依照1.2.4節(jié)CCK-8結(jié)果確定的對細胞無明顯毒性的藥物質(zhì)量濃度)干預(yù)24 h(正常對照組和模型組則加入含有10%FBS的培養(yǎng)基).

1.2.6 油紅O 染色

將HepG2細胞以密度為2×105個/m L 接種于6孔板中,待細胞過夜貼壁后,造模孵育,加藥24 h時終止培養(yǎng),棄上清培養(yǎng)液,無磷酸鈣的PBS洗3遍.而后用4%的多聚甲醛固定40 min,加入油紅O 染色1 h,水性封固劑封片,顯微鏡下觀察拍照,用Image Pro Plus分析平均光密度值.

1.2.7 TG、TC含量的測定

棄去培養(yǎng)基加入PBS 洗滌細胞3 次,加入0.2 m L裂解液進行裂解,混勻后室溫靜置10 min,以2 000 g的轉(zhuǎn)速離心5 min取適量上清,用TG、TC 測定試劑盒分別測定TG、TC含量.余下上清用于BCA法蛋白定量試劑盒進行蛋白定量,最后以每克蛋白濃度校正TG、TC含量,單位為mmol/gprot.

1.2.8 Western blot檢測相關(guān)蛋白SREBP1c、FAS的表達

用預(yù)冷PBS洗滌細胞3次,最后一次徹底吸干殘留液,加入細胞裂解液(使用前數(shù)分鐘內(nèi)加入蛋白酶抑制劑),迅速將細胞刮下收集細胞.冰浴30 min,期間用移液器反復(fù)吹打,確保細胞完全裂解,12 000 rpm,4℃,離心10 min,收集上清,即得到總蛋白溶液.采用BCA 法測定細胞裂解后的蛋白濃度.將蛋白溶液按照4∶1的比例加入蛋白上樣緩沖液,100℃變性5 min.每組取50μg蛋白樣品進行SDS-PAGE 電泳,轉(zhuǎn)至PVDF 膜上,常溫下用5%的脫脂奶粉搖床上封閉1 h,按照1∶1 000的稀釋比例分別加入β-actin、SREBP1c、FAS一抗,4℃孵育過夜,TBST 洗膜3次.而后加入相應(yīng)的二抗稀釋液(1∶5000),室溫孵育1 h,TBST 洗膜3次.ECL 發(fā)光顯影,用β-actin作內(nèi)對照標(biāo)化來表示各組中SREBP1c和FAS的相對表達量.

1.3統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS19.0軟件進行統(tǒng)計分析,計量資料用均值±標(biāo)準(zhǔn)差±s)表示,兩組間的比較采用t 檢驗,多組間的比較采用單因素方差分析,以α=0.05為檢驗水準(zhǔn).

2 結(jié)果

2.1 HepG2細胞脂肪變性模型的建立

為了研究不同濃度的FBS對細胞脂肪變性程度的影響,對不同組細胞進行油紅O染色,結(jié)果觀察到,對照組細胞內(nèi)可見少許紅色脂滴.隨著血清濃度的上升,細胞內(nèi)聚積的脂滴逐漸增多,與對照組相比,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05).其中,30%FBS組紅色脂滴數(shù)量增多,但脂滴大小較對照組無明顯差異；而50%FBS 組則出現(xiàn)數(shù)量多,面積大的脂滴堆積,呈泡狀性；70%FBS組脂滴數(shù)量也較多,但是存在部分細胞凋亡的現(xiàn)象.證明50%的FBS可致Hep G2細胞脂肪變性,如圖1所示.

圖1不同濃度的FBS處理細胞后的油紅O 染色

同時,隨著FBS濃度的逐漸增加,HepG2細胞中的TG 和TC 含量也在不斷增加,當(dāng)FBS 濃度達到50%以上時,與對照組相比表現(xiàn)出明顯的差異性(P＜0.05),且TG 的增長相對于TC 更為顯著(P＜0.01).另外,根據(jù)CCK-8實驗,當(dāng)胎牛血清濃度達到70%時,細胞增殖受到抑制,可能歸因于高濃度的胎牛血清中游離脂肪酸含量過高對細胞造成了毒性作用,與油紅O 染色觀察到的現(xiàn)象一致.而50%的FBS就足以造成細胞脂肪變性,確定50%的FBS濃度為造模劑量.且根據(jù)前期實驗發(fā)現(xiàn),24 h不足以使脂質(zhì) 積聚,確定造模時間為48 h,見表1.

表1不同濃度的FBS對細胞增殖率和TG、TC的影響

2.2 GBT-WE對HepG2細胞增殖的影響

高濃度的GBT-WE 會抑制細胞生長,對細胞產(chǎn)生一定的毒性作用.因此需要通過CCK-8實驗選取無毒性的藥物濃度進行后續(xù)干預(yù)細胞脂肪變性模型的實驗.藥物作用24 h后可觀察到,隨著GBT-WE質(zhì)量濃度的上升,細胞的存活率下降,當(dāng)質(zhì)量濃度超過240μg/m L時,GBT-WE對細胞的抑制作用明顯.因此,為了實現(xiàn)各組之間的差異性,通過前期預(yù)實驗確定后續(xù)用于干預(yù)實驗的GBT-WE低劑量組為60μg/m L,GBT-WE高劑量組為240μg/m L.

圖2 GBT-WE對HepG2細胞增殖能力的影響

2.3 GBT-WE改善HepG2細胞脂肪變性

2.3.1 GBT-WE干預(yù)Hep G2細胞脂肪變性后的油紅O 染色

油紅染色顯示,與對照組相比,模型組細胞發(fā)生脂肪變性,細胞內(nèi)聚集了大量的紅色脂滴(P＜0.01),并存在脂滴融合現(xiàn)象,說明脂肪變性模型建立成功；經(jīng)GBT-WE 干預(yù)后,與模型組相比,GBT-WE與Simvastatin處理后細胞中的紅色脂滴均有所降低(P＜0.01),說明GBT-WE 可以有效地改善細胞內(nèi)的脂質(zhì)積累,如圖3所示.

2.3.2 GBT-WE 抑制Hep G2細胞脂肪變性后TG和TC含量的增加

與正常對照組相比,模型組的TG、TC顯著升高.而加入不同質(zhì)量濃度的GBT-WE處理24 h之后,隨著茶濃度的增加,Hep G2細胞內(nèi)的TG、TC值相較于模型組都在逐漸下降,且劑量依賴性下降(P ＜0.01).特別地,240μg/m L 的GBT-WE 干預(yù)模型后細胞內(nèi)TG、TC水平與陽性藥物Simvastatin效果相似,相較于對照組無明顯差異性(P＞0.05),見表2.

圖3 GBT-WE干預(yù)后各組細胞的油紅O 染色

表2 GBT-WE對各組細胞TG、TC表達的影響

2.3.3 GBT-WE抑制脂質(zhì)代謝相關(guān)蛋白SREBP1c、FAS的表達

SREBP1c是脂肪生成過程中的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子,其下游目標(biāo)FAS主要調(diào)控脂肪酸的生物合成,在脂質(zhì)代謝中起到重要作用.Western blot法測定結(jié)果發(fā)現(xiàn):與對照組相比,模型組SREBP1c和FAS呈高表達(P＜0.01)；GBT-WE干預(yù)后,與模型組相比,SREBP1c和FAS的蛋白表達量降低,并且隨著GBT-WE的質(zhì)量濃度增加,其表達量逐漸降低,呈現(xiàn)藥物劑量-效應(yīng)關(guān)系.表明GBT-WE 改善細胞脂肪變性可能是通過SREBP1c/FAS信號通路實現(xiàn)的.如圖4所示.

圖4 GBT-WE對各組細胞SREBP1c、FAS蛋白表達的影響

3 討論

肝臟是脂質(zhì)代謝的重要器官[12].通過4 種主要途徑調(diào)節(jié):循環(huán)脂質(zhì)的攝取,從頭脂肪生成(De novo lipogenesis,DNL),脂肪酸氧化以及極低密度脂蛋白的脂質(zhì)輸出[13].NAFLD 的發(fā)生是由脂質(zhì)獲取和脂質(zhì)處理之間的不平衡引起的,一種或多種途徑的破壞都可能導(dǎo)致肝臟內(nèi)脂肪的聚集.研究表明,NAFLD患者的重要特征是DNL異常升高[14].在NAFLD 肥胖患者中,大約26%的肝甘油三酯來自DNL,這進一步證實了DNL在NAFLD 中的重要性,表明DNL是潛在的治療靶標(biāo)[15].

DNL作為脂質(zhì)代謝的重要途徑,主要調(diào)節(jié)糖酵解,飽和脂肪酸以及TG的合成[16].SREBP1c 是DNL的轉(zhuǎn)錄調(diào)控關(guān)鍵因子,主要參與調(diào)控脂肪酸、TG 合成相關(guān)酶基因(乙酰輔酶A 羧化酶,FAS和硬脂酰輔酶A 去飽和酶等)的表達[17].其中,FAS是脂肪酸生物合成的限速酶,SREBP1c可與FAS的啟動子結(jié)合以啟動TG合成[18].這些肝臟脂肪生成轉(zhuǎn)錄因子的高表達可激活脂肪酸鏈合成,導(dǎo)致TG 過量合成和肝臟脂質(zhì)積聚.有研究發(fā)現(xiàn)SREBP1c表達在NAFLD 患者和動物模型中增高,升高的SREBP1c促進FAS 表達增加[19-20],而SREBP1c敲除小鼠中FAS則表達下降[21-22],也就是說SREBP1c/FAS 系統(tǒng)在NAFLD 的發(fā)生與發(fā)展中起到關(guān)鍵作用.因此,阻斷SREBP1c/FAS的高表達將降低肝臟中TG的合成.

在周紅宇,陽學(xué)風(fēng)[23]的實驗中,用含有50%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)人肝L-O2細胞24 h后建立肝細胞脂肪變性模型,提示血清蛋白的過量使用能增加細胞內(nèi)TG的含量.所以在本實驗中選擇Hep G2細胞為研究對象[24],用加入含有50%FBS的MEM培養(yǎng)基來處理Hep G2 細胞48 h,結(jié)果顯示細胞中的脂質(zhì)積累和TG 含量顯著增加,與脂肪肝細胞的形態(tài)學(xué)具有相似性,證實FBS誘導(dǎo)的Hep G2細胞脂肪變性模型適合于體外評估NAFLD.

盡管黑茶都具有一定的降脂減肥效果,但由于不同黑茶之間功能物質(zhì)組成及比例的差異,降脂減肥的作用效果也必定存在一定的差異.黑茶主要包括普洱茶、青磚茶、茯磚茶、千兩茶、黑磚茶、六堡茶等數(shù)十個品種.其中,大量關(guān)于普洱茶的研究顯示,普洱茶能夠降低PPAR-γ和SREBP-1c及其下游基因FAS、ACC的表達,抑制肝臟脂肪酸吸收和脂肪合成,改善大鼠NAFLD 脂肪變性[25].傅冬和等對茯磚茶各部分萃取,發(fā)現(xiàn)對PPAR-γ、PPAR-δ均有激活作用,對FXR有抑制作用,從而實現(xiàn)降脂減肥功效[26].TG在肝細胞的細胞質(zhì)中的積累是NAFLD 的標(biāo)志[22].在以前的研究中同樣發(fā)現(xiàn)青磚茶的降脂作用顯著[9,27],但具體機制不明.在本研究中將青磚茶GBT-WE 用于干預(yù)肝脂肪變性模型從而評價GBT-WE青磚茶對體外NAFLD 的影響.同時,使用Simvastatin作為抗脂質(zhì)積累的陽性對照,已知Simvastatin不僅降低膽固醇,還可降低甘油三酯.在臨床研究中,Simvastatin可有效降低血清甘油三酯水平[28].研究結(jié)果顯示高濃度的FBS可刺激SREBP1c高表達并增強下游FAS表達導(dǎo)致脂肪過量合成.而GBT-WE則顯著減少了Hep G2細胞中脂質(zhì)的過度積累,降低了細胞內(nèi)TG、TC水平,極大地抑制了脂質(zhì)代謝相關(guān)蛋白SREBP1c及其下游目標(biāo)FAS 的表達.由此可見,GBT-WE可通過SREBP1c/FASBS 信號通路減少從頭脂肪生成,從而抑制TG 的合成,最終對NAFLD 的發(fā)展起到保護作用,GBT-WE有望開發(fā)成為治療NAFLD的有效藥物.因此,后續(xù)還需進行相關(guān)體內(nèi)實驗來進一步闡述其機制.