鄧平　張立強(qiáng)　艾桃山　喻運(yùn)珍　余少梅　羅楊志　鄭青

摘要：以平均體質(zhì)量為（6.45±0.14） g克氏原螯蝦為研究對象，分別投喂含1%姜黃素、肝膽利康散、穿梅三黃散的配合飼料，飼養(yǎng)42 d后檢測并比較不同中草藥對克氏原螯蝦肝胰腺抗氧化應(yīng)激指標(biāo)和組織結(jié)構(gòu)的影響。結(jié)果表明，3種中草藥均顯著提高了克氏原螯蝦肝胰腺SOD和CAT活性，其中姜黃素對CAT活性的促進(jìn)作用更顯著;3種中草藥均明顯降低了肝胰腺的MDA含量，但對GSH-Px活性無顯著影響。組織學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)3種中草藥對克氏原螯蝦肝胰腺未造成明顯損失。由此可見，飼料中添加1%劑量的3種中草藥可明顯增強(qiáng)克氏原螯蝦肝胰腺的抗氧化能力，且安全可靠。

關(guān)鍵詞：克氏原螯蝦;肝胰腺;抗氧化;組織結(jié)構(gòu);中草藥

中圖分類號： S942.1;S942.2+6

文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2020）02-0183-05

收稿日期：2018-10-31

作者簡介：鄧 平（1979—），女，湖北枝江人，博士，工程師，主要從事水產(chǎn)養(yǎng)殖生態(tài)學(xué)研究。E-mail：sssdp@126.com。

通信作者：張立強(qiáng)，博士，高級工程師，主要從事魚類病害研究。E-mail：280585404@qq.com。

克氏原螯蝦（Procambarus clarkii），俗稱小龍蝦，是中國淡水蝦類中的重要資源[1]。其肉味鮮美、營養(yǎng)豐富，深受廣大消費(fèi)者喜愛，成為國內(nèi)廣泛養(yǎng)殖的一種重要經(jīng)濟(jì)水生動物[2]。隨著克氏原螯蝦集約化養(yǎng)殖規(guī)模的擴(kuò)大，病害問題日趨嚴(yán)重[3]，而抗生素等化學(xué)藥物的濫用不僅會造成致病菌多重抗藥性，還會引發(fā)藥物殘留等問題，危害環(huán)境和食品安全。因此，尋求綠色環(huán)保、安全高效的免疫強(qiáng)劑對克氏原螯蝦養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。

目前，有關(guān)中草藥促進(jìn)甲殼動物非特異免疫功能的報道已見于克氏原螯蝦[4]、凡納濱對蝦[5-6]、羅氏沼蝦[7]、斑節(jié)對蝦[8]、中華絨螯蟹[9]等。姜黃素、肝膽利康散和穿梅三黃散具有保肝護(hù)肝作用，姜黃素和肝膽利康散還能提高水產(chǎn)養(yǎng)殖動物肝胰臟的抗氧化能力[10-12]，而3種中草藥對克氏原螯蝦的肝胰腺是否具有保護(hù)作用還未見報道。本試驗(yàn)通過連續(xù)投喂3種中草藥制劑姜黃素、肝膽利康散、穿梅三黃散42 d，研究克氏原螯蝦肝胰腺抗氧化應(yīng)激指標(biāo)[包括超氧化物歧化酶（SOD）活性、過氧化氫酶（CAT）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）活性、丙二醛（MDA）含量]的變化及對肝胰腺組織結(jié)構(gòu)的影響，探討中草藥的作用機(jī)理，為中草藥在克氏原螯蝦飼料中的合理應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)飼料的制備本試驗(yàn)選取姜黃素、肝膽利康散（武漢中博水產(chǎn)生物技術(shù)有限公司提供成品，主要有茵陳、大黃、郁金、連翹、柴胡）、穿梅三黃散（武漢中博水產(chǎn)生物技術(shù)有限公司提供成品，主要有大黃、黃芩、黃柏、穿心蓮、烏梅）為試驗(yàn)原料，按1%比例加入飼料，攪拌加水混勻，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。飼料的主要營養(yǎng)成分包括粗蛋白28.0%、粗脂肪4.0%、粗纖維10.0%、粗灰分12.0%、水分13.0%、鈣0.6%、磷0.9%。

1.2 試驗(yàn)蝦的飼養(yǎng)與管理

試驗(yàn)蝦取自武漢市農(nóng)業(yè)科學(xué)院水產(chǎn)研究所山坡基地養(yǎng)殖場，在武漢中博水產(chǎn)生物技術(shù)有限公司養(yǎng)魚房進(jìn)行試驗(yàn)。將克氏原螯蝦暫養(yǎng)7 d后，分成對照組和3個試驗(yàn)組（姜黃素、肝膽利康散、穿梅三黃散），每組設(shè)置3個平行，每組投放10尾克氏原螯蝦，養(yǎng)殖在50 L水族箱中。水族箱底放置PVC管，供克氏原螯蝦蛻皮隱蔽用。每天投喂蝦飼料1次，投喂量為蝦體質(zhì)量的3%～5%，次日投喂飼料前采用虹吸管吸出殘餌與糞便并換水1/3，以保證水質(zhì)清潔。試驗(yàn)周期為6周。

1.3 肝胰腺免疫酶學(xué)指標(biāo)的測定及切片

分別于養(yǎng)殖42 d后從每個平行組隨機(jī)取5尾活體進(jìn)行解剖，剖取的肝胰腺組織用生理鹽水漂洗后，一部分置于 -20 ℃ 冰箱冷凍保存，肝胰腺中SOD、CAT、GSH-Px活性及MDA、總蛋白（TP）含量均采用相應(yīng)的試劑盒檢測。

另取一部分肝胰腺組織用4%中性甲醛固定，經(jīng)洗滌、脫水、透明、滲透和包埋后，切成厚度為 5 μm 的薄片，HE染色，再經(jīng)脫水和透明后用中性樹膠封片，光鏡下觀察組織學(xué)特征。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

不同中草藥對克氏原螯蝦胰腺免疫酶學(xué)指標(biāo)的影響采用單因素方差分析（A-NOVA）進(jìn)行分析（SPSS 19.0，P<0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 3種中草藥制劑對肝胰腺抗氧化指標(biāo)的影響由3種中草藥對克氏原螯蝦肝胰腺SOD、CAT、GSH-Px活性和MDA含量的影響（圖1）可知，與對照組相比，養(yǎng)殖42 d各添加組均能顯著提高克氏原螯蝦肝胰腺SOD活性（P<0.05），但各添加組間無顯著性差異（P>0.05）。各添加組克氏原螯蝦肝胰腺CAT活性均較對照組高（P<0.05），且各添加組間差異顯著（P<0.05），姜黃素組克氏原螯蝦肝胰腺CAT活性最高。各添加組克氏原螯蝦肝胰腺的GSH-Px活性與對照組之間無明顯差異（P>0.05）。與對照組相比，3種中草藥均能顯著降低克氏原螯蝦肝胰腺M(fèi)DA含量（P<0.05），但各添加組間無顯著性差異（P>0.05）。

2.2 3種中草藥制劑對肝胰腺組織結(jié)構(gòu)的影響

連續(xù)投喂中草藥42 d后解剖克氏原螯蝦的肝胰腺進(jìn)行HE染色，結(jié)果如圖2所示。與沒有投喂中草藥的空白對照組相比，中草藥各組的肝胰腺結(jié)構(gòu)基本無損，肝小體排列整齊，基膜完整，肝小管呈星形，肝小體細(xì)胞排列緊湊無散落;肝小體間隙的血細(xì)胞無明顯變化（100×）?？瞻捉M和3種中草藥組肝小體細(xì)胞層的分泌細(xì)胞（B細(xì)胞）和吸收細(xì)胞（R細(xì)胞）均完整，R細(xì)胞無明顯增多，部分B細(xì)胞體積有一定的增大（400×）。組織學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，克氏原螯蝦用1%劑量的中草藥是安全的，對肝胰腺組織結(jié)構(gòu)不會產(chǎn)生明顯損傷。

3 討論與結(jié)論

3.1 3種中草藥制劑對肝胰腺抗氧化指標(biāo)的影響

肝胰腺是甲殼動物最主要的免疫器官，其SOD、CAT、GSH-Px活性及MDA含量等與多種生理代謝和免疫反應(yīng)有關(guān)，能綜合反映甲殼動物的抗氧化防御系統(tǒng)功能[13-14]。

SOD和CAT是生物體內(nèi)抗氧化防御功能的關(guān)鍵酶，它們能有效地清除活性氧自由基，減少脂質(zhì)過氧化損傷。關(guān)于姜黃素提高水產(chǎn)養(yǎng)殖動物肝胰臟抗氧化能力已有較多報道，張滕閑等以姜黃素投喂黃顙魚，肝胰臟SOD和CAT活性均顯著提高[15];余少梅等用姜黃素投喂肝損傷的草魚，能明顯增強(qiáng)草魚肝臟的SOD和CAT活性[12]。肝膽利康散對水產(chǎn)養(yǎng)殖動物脂肪肝有治療作用[11]，也有關(guān)于提高肝損傷草魚肝臟SOD和CAT活性的報道[12]。穿梅三黃散具有殺菌和輔助肝損傷修復(fù)的作用，其主要成分大黃、黃芪等，能明顯促進(jìn)羅氏沼蝦、凡納濱對蝦和克氏原螯蝦肝胰腺的SOD和CAT活性[14，16-17]，而復(fù)方中草藥制劑穿梅三黃散對水產(chǎn)養(yǎng)殖動物非特異性免疫方面的研究還未見報道。本試驗(yàn)中分別以1%姜黃素、肝膽利康散、穿梅三黃散飼養(yǎng)克氏原螯蝦42 d，其肝胰腺SOD和CAT活性均明顯升高，其中3種中草藥添加組SOD活性差異不顯著，而3種中草藥對CAT活性影響差異顯著，以姜黃素對CAT活性促進(jìn)作用更明顯。該結(jié)果表明，3種中草藥對克氏原螯蝦抗氧化系統(tǒng)的SOD與CAT協(xié)同發(fā)揮作用，而姜黃素作用于CAT的效果更強(qiáng)。

GSH-Px能幫助機(jī)體保持正常的免疫系統(tǒng)功能，并具有抗氧化作用和整合解毒作用。3種中草藥（或主要成分）對水產(chǎn)養(yǎng)殖動物GSH-Px活性的影響不盡相同，姜黃素可顯著提高肝損傷草魚、黃顙魚和奧尼羅非魚肝胰臟的GSH-Px活性，但降低了大菱鲆幼魚血清中的GSH-Px活性[12，15，18-19]。肝膽利康散提高了肝損傷草魚肝臟的GSH-Px活性[12]。大黃素可明顯提高克氏原螯蝦肝胰腺 GSH-Px 活性[17]。本試驗(yàn)中3種中草藥對克氏原螯蝦肝胰腺GSH-Px活性無顯著激活作用，可能與3種中草藥對克氏原螯蝦抗氧化酶的促進(jìn)作用和酶的種類有關(guān)。

MDA是最重要的脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物，它的含量反映了細(xì)胞受損傷的程度和脂質(zhì)過氧化程度，從而間接反映體內(nèi)活性氧的積累情況[20]。本研究中3種中草藥添加組克氏原螯蝦肝胰腺的MDA含量明顯降低，說明飼喂3種中草藥的克氏原螯蝦機(jī)體抗氧化系統(tǒng)在此時能夠?qū)ι傻难踝杂苫M(jìn)行及時清除，脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的水平較低。這與3種中草藥（或主要成分）對草魚、凡納濱對蝦及克氏原螯蝦等水產(chǎn)養(yǎng)殖動物的研究結(jié)果[12，16-17]一致。

3.2 3種中草藥制劑對肝胰腺組織結(jié)構(gòu)的影響

克氏原螯蝦肝胰腺和其他甲殼動物一樣，肝小體是其結(jié)構(gòu)和功能的基本單位[21]。肝小體主要由基膜、細(xì)胞層和肝小管組成，細(xì)胞層中的細(xì)胞可分為分泌細(xì)胞（B細(xì)胞）、存儲細(xì)胞（R細(xì)胞）、纖維細(xì)胞（F細(xì)胞）和胚細(xì)胞（E細(xì)胞），其中B細(xì)胞和R細(xì)胞數(shù)量較多[22]。在本試驗(yàn)采樣過程中發(fā)現(xiàn)，投喂中草藥的克氏原螯蝦肝胰腺色澤紅潤。肝胰腺組織切片HE染色后，投喂姜黃素、肝膽利康散、穿梅三黃散的克氏原螯蝦肝胰腺組織結(jié)構(gòu)無顯著病理變化。盧婉怡也有研究表明，灌喂高劑量的姜黃素未引起奧利羅非魚肝胰腺的病理變化[19]。姜黃素和肝膽利康散還可改善肝損傷草魚肝組織的病理變化[12]，而連續(xù)投喂含烏梅的復(fù)方中草藥對凡納濱對蝦的肝胰腺沒有產(chǎn)生損害[23]。這說明本試驗(yàn)所用的3種中草藥對克氏原螯蝦肝胰腺組織不會產(chǎn)生明顯損傷。

綜上所述，在飼料中投喂3種中草藥均增強(qiáng)了克氏原螯蝦肝胰腺抗氧化功能，并且對機(jī)體沒有損傷，因此具有良好的應(yīng)用前景。

參考文獻(xiàn)：

[1]徐加濤，閻斌倫，徐國成. 克氏原螯蝦產(chǎn)業(yè)發(fā)展背景、現(xiàn)狀與展望[J]. 水產(chǎn)科技情報，2011，38（4）：172-176，180.

[2]農(nóng)業(yè)部漁業(yè)政策管理局.中國漁業(yè)統(tǒng)計(jì)年鑒[M]. 北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2018.

[3]何琦瑤，汪開毓，劉 韜，等. 湖北省潛江地區(qū)克氏原螯蝦白斑綜合征PCR診斷及組織病理學(xué)觀察[J]. 水產(chǎn)學(xué)報，2018，42（1）：131-140.

[4]孔舒舒. 加拿大一枝黃花抑菌提取物對克氏原螯蝦抗菌性和免疫性的影響[D]. 揚(yáng)州：揚(yáng)州大學(xué)，2015.

[5]Lin H Z，Li Z J，Chen Y Q，et al. Effect of dietary traditional Chinese medicines on apparent digestibility coefficients of nutrients for white shrimp Litopenaeus vannamei，Boone[J]. Aquaculture，2006，253（1/2/3/4）：495-501.

[6]劉 波，冷向軍，李小勤，等. 中草藥對凡納濱對蝦生長、血淋巴非特異性免疫和肌肉成分的影響[J]. 上海海洋大學(xué)學(xué)報，2014，23（4）：528-534.

[7]Liu B，Ge X P，He Y H，et al. Effects of anthraquinones extracted from Rheum officinale Bail on the growth，non-specific immune response of Macrobrachium rosenbergii[J]. Aquaculture，2010，310（1/2）：13-19.

[8]Balasubramanian G，Sarathi M，Venkatesan C，et al. Oral administration of antiviral plant extract of Cynodon dactylon on a large scale production against white spot syndrome virus （WSSV） in Penaeus monodon[J]. Aquaculture，2008，279（1/2/3/4）：2-5.

[9]劉麗平，薛 暉，周 剛. 復(fù)方中草藥對中華絨螯蟹免疫因子的影響[J]. 南京師大學(xué)報（自然科學(xué)版），2008，31（1）：109-113.

[10]程玉冰，潘庭雙，侯冠軍，等. 不同中草藥添加劑對草魚生長及肝膽綜合癥的影響[J]. 安徽農(nóng)學(xué)通報，2008，14（23）：146，155.

[11]楊敬輝，潘 娟，劉占民. 肝膽利康散、L-肉毒堿、膽汁酸對草魚脂肪肝的治療作用的比較[J]. 中國獸醫(yī)雜志，2013，49（1）：78-80.

[12]余少梅，喻運(yùn)珍，艾桃山，等. 姜黃素對草魚肝損傷修復(fù)作用研究[J]. 中國獸藥雜志，2013，47（8）：29-31.

[13]段亞飛，董宏標(biāo)，王 蕓，等. 干露脅迫對日本囊對蝦抗氧化酶活性的影響[J]. 南方水產(chǎn)科學(xué)，2015，11（4）：102-108.

[14]劉 波，明俊超，謝 駿，等. 大黃蒽醌提取物對羅氏沼蝦高溫下抗氧化能力與熱應(yīng)激蛋白70基因表達(dá)的影響[J]. 水產(chǎn)學(xué)報，2010，34（6）：972-980.

[15]張滕閑，陳 錢，張寶龍，等. 姜黃素對黃顙魚（Pelteobagrus fulvidraco）生長、消化與抗氧化能力的影響[J]. 漁業(yè)科技進(jìn)展，2017，38（6）：56-63.

[16]王 蕓，李 健，劉 淇，等. 5種中草藥對凡納濱對蝦生長及非特異性免疫功能的影響[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007，35（26）：8236-8239.

[17]楊維維，沈美芳，劉文斌，等. 大黃素對克氏螯蝦生長、免疫、肝臟抗氧化以及腸道消化酶的影響[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報，2013，29（6）：1405-1410.

[18]王雅慧，王裕玉，麥康森，等. 飼料中添加姜黃素對大菱鲆幼魚生長、體組成及抗氧化酶活力的影響[J]. 水產(chǎn)學(xué)報，2016，40（9）：1299-1308.

[19]盧婉怡. 姜黃素的生物學(xué)功能及其在奧尼羅非魚養(yǎng)殖上的應(yīng)用研究[D]. 廣州：華南理工大學(xué)，2009.

[20]徐德立，趙小立，張 銘. 低溫脅迫下草魚ZC-7901細(xì)胞系內(nèi)丙二醛含量的變化[J]. 曲阜師范大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2003，29（4）：88-90.

[21]李 霞. 水產(chǎn)動物組織胚胎學(xué)[M]. 北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2006：199-200.

[22]李二超，陳立僑，曾 嶒，等. 不同鹽度下餌料蛋白質(zhì)含量對凡納濱對蝦生長、體成分和肝胰腺組織結(jié)構(gòu)的影響[J]. 水產(chǎn)學(xué)報，2008，32（3）：425-433.

[23]姜 燕. 凡納濱對蝦急性肝胰腺壞死病防治中草藥的篩選[D]. 大連：大連海洋大學(xué)，2013：41-42.劉小莉，王 榮，王 帆，等. 溫度和pH值條件對白魚內(nèi)源性蛋白酶活性的影響[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2020，48（2）：188-192.