柴彬彬，王麗，李勁濤，張曉菲，夏陽，吉元，盛望，韓曉東

北京工業(yè)大學(xué) a.生命科學(xué)與生物工程學(xué)院；b.固體微結(jié)構(gòu)與性能研究所；北京 100124

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤，已成為癌癥致死的第二大病因[1]。三陰性乳腺癌（triple negative breast cancer，TNBC），是指孕激素受體（PR）、雌激素受體（ER）、人表皮生長因子受體2（HER2）均為陰性的浸潤性乳腺癌，占所有乳腺癌病例的10%～20%，與非TNBC 相比其惡性程度更高[2]。由于缺乏有效的靶向治療，TNBC 患者的預(yù)后普遍較差[3]。因此，尋找TNBC 治療靶點和治療方式是當(dāng)前的研究熱點。

表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）是酪氨酸激酶受體ErbB 家族的4個成員之一，是一種跨膜糖蛋白。EGFR 通過多種機(jī)制異常激活，包括受體過度表達(dá)、突變、配體依賴性受體二聚化、配體非依賴性激活等，并且與多種人類癌癥的發(fā)生有關(guān)[4]。EGFR 與配體表皮生長因子（EGF）結(jié)合后形成二聚體，誘導(dǎo)其自身磷酸化，從而啟動下游信號通路，促進(jìn)細(xì)胞增殖，抑制凋亡和促進(jìn)細(xì)胞侵襲[5]。

間質(zhì)表皮轉(zhuǎn)化因子（cellular mesenchymal-ep?ithelial transition factor，c-Met）即肝細(xì)胞生長因子受體，是由原癌基因c-met 編碼的受體酪氨酸激酶，屬于RON 亞族，與配體肝細(xì)胞生長因子（he?patocyte growth factor，HGF）具有高度結(jié)合性[6]。配體與c-Met 在胞外區(qū)結(jié)合后，誘導(dǎo)c-Met 磷酸化，激活多種細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)途徑，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲[7]。c-Met 通路的失調(diào)在胃癌、肺癌、結(jié)腸癌、乳腺癌、膀胱癌等多種人類癌癥中均有報道。

EGFR 和 c-Met 在 TNBC 中 的 異常 高表 達(dá) ，使之成為受關(guān)注的治療TNBC 的重要藥物靶點。有研究利用免疫共沉淀的方法，鑒定了EGFR/c-Met復(fù)合物的存在[8]，但尚未對它們的聚合形式進(jìn)行細(xì)胞學(xué)直觀驗證。

結(jié)合已有經(jīng)驗，我們在三陰性乳腺癌細(xì)胞中用EGFR 和c-Met 特異的核酸適配體介導(dǎo)鏈接納米金顆粒，采用掃描電子顯微鏡的單分子成像技術(shù)，在納米尺度對EGFR 和c-Met 在細(xì)胞膜表面的表達(dá)數(shù)量及聚集狀態(tài)及二者共定位關(guān)系進(jìn)行了表征，探究了EGFR 和c-Met 的共定位關(guān)系及相互作用機(jī)制，為更清晰地了解蛋白功能及調(diào)控機(jī)制提供了新的可視化研究手段，也為藥物研發(fā)和開展精準(zhǔn)靶向治療研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

三陰性乳腺癌MB-231 細(xì)胞系購于美國ATCC；鏈霉親和素修飾的納米金顆粒（10 和30 nm）由NANOCS 公司合成；特異性結(jié)合EGFR 的核酸 適 配 體 TuTu22（5′-TGCCGTTTCTTCTCTTTCGC TTTTTTTGCTTTTGAGCATG-3′）[9]和特異性結(jié)合 c-Met 的 核酸適配體 SL1（5′-ATCAGGCTGGATGGT AGCTCGGTCGGGGTGGGTGGGTTGGCAAGTCTGAT-3′）[10]由生工生物工程股份有限公司合成；ITO 導(dǎo)電玻璃購于上海聚笛玻璃公司。

1.2 MB-231細(xì)胞培養(yǎng)

在生物安全柜中將ITO 玻璃置于75%酒精中浸泡10 min，紫外燈照射30 min 后放入24 孔板中，接種 3×104/孔 MB-231 細(xì)胞，培養(yǎng) 24 h 后每孔加入1 mL 4%多聚甲醛固定細(xì)胞30 min，加入PBS 反復(fù)洗滌ITO 玻璃5 次，晾干后備用。

1.2.1 單一標(biāo)記 將20 nmol/L 生物素標(biāo)記的c-Met 配體室溫敷育在ITO 導(dǎo)電玻璃上，于濕盒中敷育2 h，用超純水清洗干凈，晾干后將鏈霉親和素標(biāo)記的金顆粒（30 nm）超純水稀釋至1/10，滴在細(xì)胞上，濕盒中敷育2 h，超純水清洗ITO 導(dǎo)電玻璃5 次后洗凈，晾干待測。用同樣方法在別組ITO 導(dǎo)電玻璃以30 nm 的金顆粒標(biāo)記EGFR，超純水反復(fù)沖洗后晾干。

1.2.2 共同標(biāo)記 以上述方法用納米金顆粒（30 nm）單一標(biāo)記c-Met 后，用同樣方法繼續(xù)在本組ITO 導(dǎo)電玻璃上以10 nm 的金顆粒標(biāo)記EGFR，超純水反復(fù)沖洗后晾干。

1.3 掃描電鏡表征

實驗設(shè)備為FEI 公司的Quanta 600 環(huán)境掃描電鏡（ESEM），采用二次電子（SE）探頭和背散射電子（BSE）信號成像，加速電壓10～20 kV，放大倍率500～200 000。

1.4 統(tǒng)計分析

用imageJ 軟件隨機(jī)選擇細(xì)胞不同位置的照片5 張進(jìn)行分析統(tǒng)計。分別統(tǒng)計2 種膜蛋白的單體、二聚體、多聚體數(shù)量及比值，分析異源二聚體和多聚體的形態(tài)并計算比例。

2 結(jié)果

2.1 MB-231細(xì)胞表面EGFR、c-Met單分子成像

圖1 是三陰性乳腺癌MB-231 細(xì)胞在不同倍數(shù)下的背散射電子像。圖1A 為1400 倍鏡下拍攝的細(xì)胞群照片，MB-231 細(xì)胞能夠平整分散地在ITO 導(dǎo)電玻璃上自然生長，可以開展高分辨成像研究。圖1B、C 清晰展現(xiàn)了50 000 倍鏡下局部細(xì)胞膜表面的單分子成像，細(xì)胞膜上存在大量30 nm 金顆粒偶聯(lián)的 EGFR 和 c-Met，背景清晰，可以進(jìn)行統(tǒng)計分析。

2.2 MB-231細(xì)胞表面EGFR、c-Met單分子聚合形態(tài)觀察

圖1 納米金顆粒（30 nm）標(biāo)定EGFR、c-Met 在掃描電鏡下的細(xì)胞和單分子成像

圖2 納米金顆粒（30 nm）標(biāo)定EGFR、c-Met 在掃描電鏡下的單分子成像

圖2 是三陰性乳腺癌MB-231 細(xì)胞膜表面EGFR、c-Met 在50 000 倍鏡下的背散射電子像。由于一個膜蛋白只能連接一個納米金顆粒，即圖中每一個金顆粒代表一個膜蛋白，因此納米金顆粒的聚集狀態(tài)實際反映了膜蛋白的聚合形態(tài)。圖2C 是EGFR、c-Met 表達(dá)的定量統(tǒng)計直方圖。經(jīng)計算，EGFR 單體、二聚體、多聚體的占比分別為48.60%、29.83%、21.57%，c-Met 單體、二聚體、多聚體的占比分別為38.24%、27.66%、34.10%?？傮w來說，在正常狀態(tài)下，EGFR 和c-Met 主要存在形式為包括二聚體在內(nèi)的多聚體，這與前期研究結(jié)果相同，因此，我們將繼續(xù)利用這一方法共同標(biāo)記2 種蛋白。

2.3 MB-231細(xì)胞表面EGFR、c-Met形成異源二聚體和多聚體

圖3 是三陰性乳腺癌MB-231 細(xì)胞膜表面EGFR 和c-Met 在100 000 倍鏡下的背散射電子像。利用10 和30 nm 的金顆粒對細(xì)胞膜表面的EGFR、c-Met 進(jìn)行共定位，圖片清晰地展示了在正常狀態(tài)下，細(xì)胞膜表面不僅存在EGFR、c-Met各自的單體、同源二聚體和多聚體，二者還能結(jié)合形成異源二聚體和異源多聚體。圖3B 是EGFR和c-Met 表達(dá)的定量統(tǒng)計直方圖。經(jīng)計算，EGFR和c-Met 單體、二聚體、多聚體所占比例分別為50.15%、25.57%和24.28%。其中，異源二聚體占二聚體總數(shù)的13.71%，異源多聚體占多聚體總數(shù)的24.42%。該結(jié)果證實了EGFR、c-Met 異源二聚體和多聚體的存在，也預(yù)示著這2 種膜蛋白可能存在結(jié)構(gòu)和功能上的相互作用，共同協(xié)同調(diào)控下游通路。

3 討論

在三陰性乳腺癌細(xì)胞中，EGFR 和c-Met 同時過表達(dá)。它們激活促進(jìn)細(xì)胞生長、侵襲和轉(zhuǎn)移的多種信號傳導(dǎo)途徑，主要包括Ras/ERK 和PI3K/AKT 途徑。當(dāng)前，能夠抑制 EGFR 和 c-Met 通路的分子靶向藥物主要有單克隆抗體和單靶點或多靶點的酪氨酸激酶抑制劑。Cetuximab 和Panitu?mumab 等單克隆抗體特異性結(jié)合EGFR 的胞外域，Gefitinib、Erlotinib 等小分子抑制劑結(jié)合在胞內(nèi)酪氨酸激酶域上的ATP 位點。但大量臨床數(shù)據(jù)表明，隨著時間的推移，EGFR 治療存在耐藥性。

同樣地，HGF 或c-Met 的單克隆抗體能夠防止HGF 與受體連接、受體二聚化，并誘導(dǎo)降解c-Met[11]。c-Met 的酪氨酸激酶抑制劑，例如Crizo?tinib 和 Cabozanix 已被美國 FDA 批準(zhǔn)上市[12]，Cap?matinib、AMG337 等特異性更強(qiáng)的小分子抑制劑也處于臨床研究階段。

研究表明，c-Met 可能是導(dǎo)致EGFR 酪氨酸激酶抑制劑獲得性耐藥的關(guān)鍵因素[13]?；诖?，有研究選定EGFR 和c-Met 的抑制劑Lapatinib 和Foretinib 在 TNBC 的 MB-231 細(xì)胞系中進(jìn)行協(xié)同治療，彌補(bǔ)了單一療法的不足，提高了治療效率[14]。我們的研究確定了二者異源聚合現(xiàn)象的存在，我們認(rèn)為針對TNBC 的一種新的潛在治療方法是聯(lián)合靶向 EGFR 和 c-Met。

總之，本研究驗證了在三陰性乳腺癌細(xì)胞膜表面EGFR 和c-Met 會形成異源二聚體和多聚體，明確了其占據(jù)一定的比例。結(jié)合2 種膜蛋白的結(jié)構(gòu)和功能特性研究，我們推測2 個蛋白的功能發(fā)揮有一定的相關(guān)性。這將在后續(xù)研究中得到證實，并進(jìn)一步揭示EGFR 和c-Met 在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的功能、調(diào)控機(jī)制及相互作用關(guān)系，為開展精準(zhǔn)靶向治療提供新的科研手段。

圖3 納米金顆粒標(biāo)定EGFR（10 nm）和c-Met（30 nm）在掃描電鏡下的共定位成像