高鳳菊，張淑紅，張運峰，宋瑞生，韓靖玲，劉海英

（1. 唐山師范學(xué)院 生命科學(xué)系，河北 唐山 063000；2. 唐山市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，河北 唐山 063000）

草莓（Fragaria×ananassa Duch.）為薔薇科草莓屬多年生草本植物，含有豐富的維生素、胡蘿卜素、蘋果酸、葉酸、鐵、鈣等營養(yǎng)物質(zhì)，具有維護(hù)上皮組織健康、明目養(yǎng)肝、促進(jìn)食物消化和生長發(fā)育等功效。草莓適合采摘、鮮食，也可以加工生產(chǎn)飲料，具有很高的營養(yǎng)價值和經(jīng)濟(jì)價值，已成為世界廣泛栽培的經(jīng)濟(jì)作物之一。草莓喜光、喜水，但不耐澇，不耐鹽堿，在栽培過程中極易產(chǎn)生病害問題。草莓白粉病是世界上草莓產(chǎn)區(qū)普遍發(fā)生的一種病害，主要危害葉片、葉柄、花、花梗和果實，嚴(yán)重時整個葉片枯黃、花蕾不能開放、幼果不能正常膨大，在設(shè)施栽培過程中極易流行，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[1-5]。在生產(chǎn)上主要采用化學(xué)防治，但由于防治白粉病的藥劑品種較少，防治效果受施藥時期和環(huán)境條件影響較大，且因抗藥性增強加大藥量易產(chǎn)生藥害等因素，使化學(xué)防治方法受到很大的限制。采用抗病品種是解決該問題的最佳途徑之一，而選育抗病品種離不開抗病基因的篩選和鑒定[6-8]。

RPW8（Resistance to powdery mildew 8）是在擬南芥上發(fā)現(xiàn)的具有白粉病抗性的重要抗病基因，分為RPW8.1 和RPW8.2 兩種類型[9]。RPW8.1和RPW8.2 在擬南芥Ms-0 生態(tài)型里緊密連鎖，并且主要存在于抗白粉病的擬南芥生態(tài)型中，而感病的擬南芥生態(tài)型中則缺乏這2 個基因[10]。研究發(fā)現(xiàn)，RPW8 基因?qū)M南芥霜霉菌和煙草花葉病毒等也表現(xiàn)出較高的抗性，具有廣譜抗病性[11,12]，是抗病育種的最佳抗病基因來源。本文利用草莓基因組數(shù)據(jù)，鑒定出15 個草莓RPW8 同源基因，在進(jìn)行序列分析的基礎(chǔ)上，對其結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行分析預(yù)測，為草莓抗病育種提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 草莓RPW8 同源基因的獲得

草莓基因組和蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)下載于JGI（Joint Genome Institute）的Phytozome 數(shù)據(jù)庫（https://phytozome.jgi.doe.gov）。利用 Uniprot 數(shù)據(jù)庫（https://www.uniprot.org）檢索擬南芥的RPW8 基因，以擬南芥的RPW8.1 和RPW8.2 的氨基酸序列對草莓的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行Blastp 比對，獲得與擬南芥RPW8.1 和RPW8.2 高度同源的草莓RPW8同源基因。

1.2 草莓RPW8 同源基因的序列特征分析

利用PFAM 數(shù)據(jù)庫（http://pfam.xfam.org/）對草莓RPW8 同源基因進(jìn)行結(jié)構(gòu)域分析，分析其可能功能，利用在線分析軟件 SMS（Sequence manipulation suite，http://www.bioinformatics.org/sms2/dna_stats.html）對RPW8 基因家族的核酸特征進(jìn)行分析，利用在線軟件 ProParam（https://web.expasy.org/protparam/）分析RPW8 基因家族氨基酸的理化性質(zhì)。

1.3 草莓RPW8 基因的系統(tǒng)進(jìn)化分析

利用 Uniprot 數(shù)據(jù)庫（https://www.uniprot.org/）獲得番茄、谷子、小麥等其它植物的RPW8同源基因的氨基酸序列，利用Mega 7.0.4 軟件對草莓及其它植物的RPW8 同源基因進(jìn)行氨基酸序列的比對和系統(tǒng)進(jìn)化分析，建立系統(tǒng)進(jìn)化樹，通過同源性比較確定草莓RPW8 基因的類型。Align選用Muscle，Phylogeny 選用Maximum Parsimony，校驗參數(shù)BootStrap 重復(fù)為1 000 次，其他參數(shù)均為默認(rèn)值。

2 結(jié)果和分析

2.1 草莓RPW8 同源基因的獲得

通過對草莓蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行Blastp 比對，獲得了1 個擬南芥RPW8.1 草莓同源基因：mrna 27107.1-v1.0-hybrid（score 35.4，E-value 3.3 E-3，LG5:23 157 394-23 157 774 reverse），并命名為FaRPW8.1；獲得了14 個擬南芥RPW8.2 的草莓同源基因，分別命名為FaRPW8.2-1～14，見表1。

表1 草莓的擬南芥RPW8.2 同源基因

分析這15 個草莓RPW8 同源基因在染色體上 的位置，發(fā)現(xiàn)FaRPW8.2-12 和FaRPW8.2-13 與FaRPW8.1 在同一條染色體 LG5 并相鄰，F(xiàn)aRPW8.2-6、FaRPW8.2-8 和FaRPW8.2-14 分別位于LG1、LG4 和LG3，F(xiàn)aRPW8.2-4 在未定位染色體上，其余8 個同源基因都位于LG6 染色體的相鄰位置上。

2.2 草莓RPW8 同源基因編碼蛋白的結(jié)構(gòu)域分析

分析草莓RPW8 同源基因的PFAM 結(jié)構(gòu)域，結(jié)果見圖1。

從圖1 可以看出，草莓RPW8 同源基因編碼的蛋白含有1～4 個結(jié)構(gòu)域，其中RPW8 為特征結(jié)構(gòu)域，存在于所有蛋白序列中。FaRPW8.1 為單結(jié)構(gòu)域蛋白，只有1 個RPW8；FaRPW8.2-2～9 和FaRPW8.2-11～13 等11 個草莓RPW8 同源基因為雙結(jié)構(gòu)域蛋白，除了含有一個RPW8 外，還包括另一個RPW8、NB-ARC 或Protein tyrosine kinase結(jié)構(gòu)；FaRPW8.2-1 和FaRPW8.2-14 為三結(jié)構(gòu)域，均含有RPW8 和NB-ARC，另外分別含有一個Ulp1 protease 和Ring finger domain；FaRPW8.2-10 為四結(jié)構(gòu)域，含有2 個RPW8、1 個NB-ARC 和1 個AAA domain。

圖1 草莓RPW8 同源基因編碼蛋白的結(jié)構(gòu)域分析

2.3 核酸序列特征分析

利用SMS 分析草莓RPW8 同源基因的核苷酸序列特征，結(jié)果顯示各堿基的比例相差較小，其中基因FaRPW8.2-6 的堿基G+C 含量最低為40.77%，而堿基A+T 的含量最高為59.22%?；騀aRPW8.1 的堿基G+C 含量最高為45.93%，而堿基A+T 的含量最低為54.06%（見表2）。

表2 草莓同源基因的核酸特征分析

2.4 氨基酸序列特征分析

草莓RPW8 同源基因編碼蛋白間的相對分子量相差較大，最小的是FaRPW8.1（14 734.2 Da），最大的是FaRPW8.2-10（196 956.9 Da）；理論等電點范圍為5.05～8.52；FaRPW8.2-10 帶的負(fù)電荷和正電荷氨基酸數(shù)量均最高，分別為225 和200，F(xiàn)aRPW8.1 帶負(fù)電荷和正電荷氨基酸數(shù)量均最低，分別為19 和21；蛋白質(zhì)不穩(wěn)定性指數(shù)為39.35～53.50，最低為FaRPW8.2-2，最高為FaRPW8.2-1；脂肪族指數(shù)93.19～108.68 之間；氨基酸組成成分以亮氨酸（Leu）和賴氨酸（Lys）為主，Leu 含量最高，平均為13.92%，其次為Lys，平均為8.08%（表3）。

表3 草莓同源基因的氨基酸特征分析

2.5 系統(tǒng)進(jìn)化分析

利用Mega 軟件建立草莓及擬南芥、谷子、番茄等植物的系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果見圖2。

從圖2 可知，草莓RPW8 同源基因可以分為三類：A 類為FaRPW8.2-3 與番茄、蜜柑、橙子等RPW8 同源基因，但同源性較低；B 類全部為草莓RPW8 同源基因，包括FaRPW8.1、FaRPW8.2-1～2、FaRPW8.2-3～11 和FaRPW8.2-14 等12 個草莓RPW8 同源基因；C 類包括 FaRPW8.2-12 和FaRPW8.2-13 及谷子、小麥、水稻的RPW8 同源基因遺傳距離較小。

3 討論和結(jié)論

圖2 草莓RPW8 同源基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹

基于草莓基因組獲得了15 個草莓的RPW8 同源基因，在數(shù)量上多于擬南芥（6 個）、油菜（7個）、桃子（12 個）和梨（12 個），略低于杏[9,11,13]（16 個），說明RPW8 基因在草莓基因組有所擴(kuò)展，說明草莓基因組中具有較深厚的白粉病抗性潛力，如果加以合理利用，將對草莓的抗病育種有很大貢獻(xiàn)。

草莓RPW8 同源基因主要位于LG5 和LG6 染色體，僅有個別基因位于其它染色體上，說明在進(jìn)化上可能由于基因重復(fù)、插入、缺失、交換等事件的發(fā)生，使RPW8 基因得以擴(kuò)增并發(fā)生了序列上的變化。草莓的RPW8 同源基因G+C 含量（平均 42.3%）低于 A+T 含量（平均 57.6%），(A+T)/(G+C)為1.36，該研究結(jié)果與杏RPW8 同源基因相似[11][G+C 含量41.1%，A+T 含量58.8%，(A+T)/(G+C)為 1.43]，推測(A+T)/(G+C)可能為RPW8 基因的核酸序列重要特征之一。

草莓RPW8 同源基因的編碼蛋白間的分子量、理論等電點和不穩(wěn)定指數(shù)差異較大，但都以亮氨酸和賴氨酸的含量最豐富，這主要與RPW8 基因含有NB-LRR 結(jié)構(gòu)有關(guān)。NB-LRR 類蛋白是植物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的最龐大的一類抗病蛋白，它們包含N端的核苷酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域（nucleotide-binding domain，NB）和C-端的富含亮氨酸重復(fù)（leucinerich repeat，LRR）結(jié)構(gòu)域[14]。LRR 結(jié)構(gòu)域主要參與無毒基因產(chǎn)物與抗病蛋白的識別和結(jié)合，并誘導(dǎo)寄主植物產(chǎn)生一系列的抗病反應(yīng)[15]。草莓RPW8同源基因編碼蛋白的結(jié)構(gòu)域分析結(jié)果也證明了這一點，在15 個草莓RPW8 同源基因中有11 個基因都存在NB-LRR 結(jié)構(gòu)域。

系統(tǒng)進(jìn)化分析中，除了FaRPW8.2-3、FaRPW 8.2-12 和FaRPW8.2-13 與番茄、谷子、小麥等植物的RPW8 同源基因有較高的同源性以外，其它12 個草莓RPW8 同源基因聚為一類，推測草莓RPW8 同源基因在進(jìn)化過程中產(chǎn)生了分化，形成了某些特有的功能特點。