童柏陸,劉曉倩,汪 洌

(浙江大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院感染與免疫研究中心,中國(guó)浙江 杭州 310058)

DCAF (DDB1- and CUL4-associated factor)全稱DNA 損傷結(jié)合蛋白1 和CUL4 相關(guān)因子。2006年,Jin 等[1]在人源胚胎腎細(xì)胞系293T 中首次發(fā)現(xiàn)18 種之前未被鑒定的蛋白質(zhì),這些蛋白質(zhì)都可被CRL4-DDB1 (cullin-ring ligase 4-DNA damage-binding protein 1)復(fù)合物識(shí)別并構(gòu)成E3 泛素連接酶復(fù)合物,因此將其命名為DCAF 蛋白。隨著串聯(lián)親和純化或標(biāo)準(zhǔn)免疫純化技術(shù)的發(fā)展,人們通過對(duì)DDB1 底物受體的系統(tǒng)性搜索,已累計(jì)發(fā)現(xiàn)60 種新的DCAF 蛋白[2]。本文主要就DCAF家族蛋白的主要成員DCAF1～DCAF17 的功能及其作用機(jī)制展開論述。

1 DCAF家族蛋白簡(jiǎn)介

從分子結(jié)構(gòu)上來看,大多數(shù)DCAF 蛋白擁有WD40 重復(fù)序列,該序列由40～60 個(gè)氨基酸構(gòu)成,并以色氨酸-天冬氨酸二肽終止。WD40 重復(fù)序列后面通常連接有單個(gè)非保守的氨基酸或保守的精氨酸殘基,因此也稱之為“WDXR”基序。DCAF 家族蛋白通過“WDXR”基序與DDB1 識(shí)別并相互作用構(gòu)成復(fù)合物[3]。

就功能上而言,DCAF 家族蛋白通常與CRL4、DDB1 共同構(gòu)成 E3 泛素連接酶(圖 1),從而對(duì)靶蛋白進(jìn)行泛素化修飾。DCAF 家族蛋白廣泛參與調(diào)控細(xì)胞的生長(zhǎng)、發(fā)育、分化、凋亡等各種生命活動(dòng),并與腫瘤、發(fā)育障礙等一系列疾病的發(fā)生、進(jìn)展密切相關(guān)。表1 總結(jié)了DCAF 家族蛋白成員DCAF1～DCAF17 的主要功能。

2 DCAF家族蛋白的主要作用

2.1 DCAF1

DCAF1,又名 VprBP (Vpr binding protein),其最早是作為人類免疫缺陷病毒1 型(HIV-1)病毒蛋白R(shí) (viral protein regulatory,Vpr)的結(jié)合蛋白被報(bào)道[4]。目前,針對(duì)DCAF1 的研究主要集中在以下3 個(gè)方面：1) DCAF1 在HIV 感染中的作用;2) DCAF1 對(duì)細(xì)胞周期的調(diào)控機(jī)制; 3) DCAF1 與腫瘤的相關(guān)性及其機(jī)制。

圖1 CRL4-DDB1-DCAF E3 泛素連接酶DCAF 家族蛋白可以和DDB1、CUL4、ROC1 構(gòu)成E3 泛素連接酶,將泛素分子連接到靶蛋白上,從而對(duì)底物進(jìn)行泛素化修飾。Fig.1 CRL4-DDB1-DCAF E3 ligaseE3 ligase complex is composed of DDB1,CUL4 and ROC1,which recognizes and ubiquitinates the substrate.

表1 DCAF 家族蛋白的主要功能Table 1 The main functions of DCAF family proteins

DCAF1 參與HIV 體內(nèi)感染復(fù)制。Vpr 參與協(xié)助HIV-1 整前復(fù)合物(HIV-1 pre-integration comp-lex,PIC)的細(xì)胞核轉(zhuǎn)運(yùn),對(duì)HIV-1 在其宿主細(xì)胞中的復(fù)制具有重要的意義[5]。研究發(fā)現(xiàn),Vpr 可以通過結(jié)合DCAF1,調(diào)控CRL4-DDB1-DCAF1 E3泛素連接酶的活性,進(jìn)而對(duì)DNA 修復(fù)酶ExoI、SAMHD1 和HLTF 進(jìn)行泛素化降解,以此來拮抗ExoI、SAMHD1 和 HLTF 等對(duì) HIV-1 體內(nèi)復(fù)制的抑制功能[6～7]。

DCAF1 參與細(xì)胞周期的調(diào)控。研究發(fā)現(xiàn),DCAF1 的缺陷會(huì)引起G2 期組蛋白突變體H2A.X的磷酸化水平顯著升高,造成細(xì)胞周期阻滯在G1、G2 期[6]。進(jìn)一步的研究報(bào)道,DCAF1 是通過調(diào)控p53 介導(dǎo)的靶基因轉(zhuǎn)錄來影響細(xì)胞周期的[8]。當(dāng)細(xì)胞處于應(yīng)激條件下時(shí),p53 會(huì)招募組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶(histone acetyltransferase,HAT),對(duì)靶基因啟動(dòng)子區(qū)的組蛋白實(shí)施乙?；?提高靶基因的轉(zhuǎn)錄活性。DCAF1 可識(shí)別未被乙酰化的組蛋白H3尾,并通過其C 端的LisH 結(jié)構(gòu)域與組蛋白H3 尾結(jié)合,招募組蛋白去乙?；?histone deacetylase,HDAC),從而阻礙p300 介導(dǎo)的H3 組蛋白乙?；?而H3 的乙酰化被認(rèn)為是p53 介導(dǎo)的靶基因活化的關(guān)鍵標(biāo)志[9]。

在臨床腫瘤研究中,DCAF1 被視為一個(gè)癌基因。研究發(fā)現(xiàn),DCAF1 可抑制由抑癌基因p53 介導(dǎo)活化的 p21、Noxa 的表達(dá)[8],而 p21、Noxa 參與細(xì)胞周期阻滯和早期細(xì)胞凋亡。所以,DCAF1 是p53 抑制腫瘤發(fā)展的關(guān)鍵。已有研究發(fā)現(xiàn),DCAF1還參與原癌基因YAP 的活化,在抑癌基因merlin缺陷的細(xì)胞系中,DCAF1 復(fù)合物可促進(jìn)Lats1/2的泛素化,并有效地抑制YAP 的磷酸化,提高YAP 的活性,促進(jìn)TEAD 依賴的細(xì)胞增殖相關(guān)基因的活化,這也促進(jìn)了腫瘤的發(fā)生、進(jìn)展、轉(zhuǎn)移[10]。

2.2 DCAF2

DCAF2,又名CDT2,其功能與DCAF1 類似,同樣參與細(xì)胞周期的調(diào)控。化學(xué)藥物、紫外線、輻射等一系列可引起DNA 損傷的刺激,會(huì)引起細(xì)胞內(nèi)p21 表達(dá)水平的上升。p21 高表達(dá)可抑制周期蛋白依賴性激酶2 (cyclin dependent kinase 2,CDK2),阻滯細(xì)胞周期進(jìn)入S 期并進(jìn)行DNA 損傷修復(fù)。研究表明在低劑量的UV 照射下,CRL4-DDB1-DCAF2 E3 泛素連接酶會(huì)誘導(dǎo)S 期的p21泛素化[11]。近期研究發(fā)現(xiàn),C/EBPα 可通過影響DCAF2 的表達(dá)水平,調(diào)控CRL4-DDB1-DCAF2 E3 泛素連接酶介導(dǎo)的p21 泛素化。在UVB 誘導(dǎo)DNA 損傷時(shí),細(xì)胞 C/EBPα 表達(dá)水平上升,后者通過與E2F1 互作阻礙E2F1 介導(dǎo)的DCAF2 的轉(zhuǎn)錄,進(jìn)而抑制CRL4-DDB1-DCAF2 E3 泛素連接酶介導(dǎo)的p21 泛素化[12]。

DCAF2 也是一個(gè)腫瘤相關(guān)蛋白質(zhì)。研究報(bào)道,DCAF2 在肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)患者中的表達(dá)水平較高,且其表達(dá)水平與疾病的嚴(yán)重程度以及預(yù)后密切相關(guān)[13]。Pan 等[13]在對(duì)242 位肝細(xì)胞癌患者的長(zhǎng)期隨訪中發(fā)現(xiàn),在p53基因突變的患者中高表達(dá)DCAF2 往往伴隨有較大的腫塊、較低的腫瘤分化度以及較低的10年生存率,然而在p53 基因正常的患者中這種趨勢(shì)則不明顯。雖然該研究團(tuán)隊(duì)當(dāng)時(shí)只是驗(yàn)證了DCAF2與PTTG1、CDT1 等腫瘤相關(guān)基因的聯(lián)系,并未給出DCAF2 高表達(dá)的成瘤機(jī)制,但是在一定程度上指出了DCAF2 與腫瘤發(fā)生、進(jìn)展、預(yù)后的相關(guān)性。除了肝細(xì)胞癌,DCAF2 在乳腺癌[14]、胃癌[15]患者中也存在異常高表達(dá)。這一系列研究表明,DCAF2 在腫瘤的形成、進(jìn)展中具有重要的作用,且這種作用是普遍的。遺憾的是,根據(jù)目前的研究結(jié)果,我們只能推斷DCAF2 高表達(dá)可能會(huì)影響細(xì)胞周期調(diào)控基因的異常表達(dá),從而導(dǎo)致細(xì)胞的惡性增殖,具體分子機(jī)制仍有待進(jìn)一步探索。

2.3 DCAF3

DCAF3,又名AMBRA,主要參與調(diào)控細(xì)胞的自噬和發(fā)育。DCAF3 的缺陷或突變會(huì)引起小鼠神經(jīng)胚形成期間細(xì)胞的過度增殖,進(jìn)而造成中腦、后腦的神經(jīng)管缺陷、外翻甚至脊柱裂[16]。同時(shí),該研究發(fā)現(xiàn),DCAF3 與 BECLIN1、Vps34 自噬相關(guān)因子互作構(gòu)成穩(wěn)定復(fù)合物,DCAF3 蛋白水平下調(diào)會(huì)影響B(tài)ECLIN1 與Vps34 互作的穩(wěn)定性,導(dǎo)致BECLIN1 介導(dǎo)的細(xì)胞自噬水平顯著降低[16]。DCAF3促進(jìn)細(xì)胞自噬的功能可以被線粒體上的Bcl-2 拮抗。抗凋亡因子Bcl-2 可通過NAF-1 對(duì)BECLIN1/Vps34 誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬進(jìn)行負(fù)調(diào)控。正常情況下,DCAF3 會(huì)優(yōu)先與線粒體上的Bcl-2 相結(jié)合,但當(dāng)細(xì)胞自噬啟動(dòng)時(shí),這種互作會(huì)被破壞,DCAF3 大量與BECLIN1 結(jié)合,促進(jìn)BCEN1/Vps34誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬[17]。此外,相關(guān)研究報(bào)道,正常狀態(tài)下DCAF3 與動(dòng)力蛋白輕鏈1(dynein light chains 1)結(jié)合,當(dāng)誘導(dǎo)自噬后,自噬信號(hào)ULK1 使DCAF3磷酸化,從而使其與動(dòng)力蛋白輕鏈1 解離,并在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)富集,隨后 DCAF3 通過與 BECLIN1、Vps34 構(gòu)成穩(wěn)定復(fù)合物誘導(dǎo)自噬體的形成,所以DCAF3 是連接自噬信號(hào)和自噬體形成的關(guān)鍵因子[18]。另有研究表明,自噬的誘導(dǎo)需要BECLIN1的K63 泛素化,而該泛素化過程依賴CRL4-DDB1-DCAF3 E3 泛素連接酶的參與[19]。

在腫瘤形成早期,癌基因的異常表達(dá)和抑癌基因的突變往往會(huì)抑制異常細(xì)胞凋亡程序的啟動(dòng),導(dǎo)致腫瘤進(jìn)展。DCAF3 作為調(diào)控細(xì)胞自噬的關(guān)鍵因子,與腫瘤的進(jìn)展有著密切的聯(lián)系。DCAF3 可通過促進(jìn)c-Myc 的去磷酸化和降解來抑制腫瘤的進(jìn)展[20]。此外,DCAF3 還可通過調(diào)控ATG12 的表達(dá)來改善乳腺癌細(xì)胞對(duì)表阿霉素的敏感性,提高治愈率[21]?？偟膩碇v,根據(jù)目前研究報(bào)道,DCAF3 作為抑癌因子可通過對(duì)癌基因的修飾、降解或者提高癌細(xì)胞的自噬凋亡水平來抑制癌癥的發(fā)生與進(jìn)展。

2.4 DCAF4

目前,關(guān)于DCAF4 的研究報(bào)道相對(duì)較少。DCAF4 被認(rèn)為與腫瘤形成相關(guān),GWAS 分析提示,DCAF4 的rs2535913 單核苷酸突變常常與散發(fā)性黑色素瘤等疾病相關(guān)聯(lián)[22]。此外,有研究報(bào)道,DC-AF4 在rs12587742 的單核苷酸點(diǎn)突變與肺鱗狀細(xì)胞癌密切相關(guān)[23]。但是,DCAF4 在腫瘤發(fā)生或進(jìn)展中的具體作用及其分子機(jī)制仍未明確,有待進(jìn)一步研究。

2.5 DCAF5

DCAF5 可與CRL4-DDB1 構(gòu)成 E3 泛素連接酶,從而對(duì)靶蛋白進(jìn)行泛素化降解調(diào)控。SOX2(sex determining region Y-related HMG-box 2)是調(diào)控胚胎干細(xì)胞自我更新和分化的關(guān)鍵蛋白質(zhì),CRL4-DDB1-DCAF5 E3 泛素連接酶在L3MBTL3(lethal 3 malignant brain tumor-like protein 3)的招募下,可與Lys-42 甲基化的SOX2 結(jié)合,從而促進(jìn)SOX2 的泛素化降解[24]。此外,DNMT1(DNA methyltransferase 1)、E2F1 (E2F transcription factor 1)的泛素化降解也依賴DCAF5。L3MBTL3 在識(shí)別單甲基化的DNMT1、E2F1 后,會(huì)招募CRL4-DDB1-DCAF5 E3 泛素連接酶,從而對(duì)它們進(jìn)行泛素化降解,抑制由DNMT1、E2F1 介導(dǎo)的非組蛋白的甲基化引發(fā)的蛋白質(zhì)降解,以此調(diào)控許多甲基化非組蛋白的穩(wěn)定性[25]。

2.6 DCAF6

DCAF6,又稱 NRIP、IQWD1,最早是作為轉(zhuǎn)錄輔助因子被發(fā)現(xiàn)的[26],可與DDB2 競(jìng)爭(zhēng)性地結(jié)合雄激素受體,從而提高雄激素受體的穩(wěn)定性,防止其被蛋白酶體降解,進(jìn)而促進(jìn)前列腺癌的發(fā)生和進(jìn)展[27]。同時(shí),DCAF6 還是人乳頭瘤病毒(human papillomavirus,HPV) E2 的互作蛋白質(zhì),可使E2去磷酸化,從而抑制E2 的多聚泛素化和降解,維持E2 穩(wěn)定性,進(jìn)而提高HPV 的表達(dá)水平[28]。

2.7 DCAF7

DCAF7 的研究相對(duì)較少,目前發(fā)現(xiàn)DCAF7主要參與調(diào)控細(xì)胞的增殖和分化。雙特異性酪氨酸磷酸化調(diào)節(jié)激酶1A(dual-specificity tyrosine phosphorylation-regulated kinase 1A,DYRK1A)是調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和分化之間的平衡的一個(gè)重要激酶,研究發(fā)現(xiàn)DCAF7 與DYRK1A 互作,參與維持其穩(wěn)定性[29]。同時(shí),該研究進(jìn)一步排除了DCAF7 對(duì)DYRK1A 在mRNA 轉(zhuǎn)錄水平以及蛋白質(zhì)降解方面的影響,但對(duì)其具體調(diào)控機(jī)制并沒有給出合理的解釋。后續(xù)研究發(fā)現(xiàn),亨廷頓相關(guān)蛋白1 (Hap1)可以與 DYRK1A 競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合DCAF7,并抑制DCAF7 的核轉(zhuǎn)運(yùn),在Hap1 敲除的小鼠中DYRK1A的表達(dá)水平明顯增加,這進(jìn)一步說明DCAF7 對(duì)DYRK1A 存在穩(wěn)定性調(diào)控[30]。至于DCAF7 參與DYRK1A 穩(wěn)定性調(diào)控的分子機(jī)制,目前尚不清楚。

2.8 DCAF9

DCAF9,又名WDTC1。群體遺傳學(xué)研究發(fā)現(xiàn),DCAF9 的單核苷酸突變與肥胖存在顯著相關(guān)性,因此該研究認(rèn)為DCAF9 的突變體可以作為一種肥胖標(biāo)志物[31]。相關(guān)研究認(rèn)為,DCAF9 的表達(dá)可導(dǎo)致那些與脂肪生成(Fasn、Dgat1 和 Dgat2)、脂解(Agtl)和長(zhǎng)鏈脂肪β-氧化相關(guān)的基因的表達(dá)適度降低。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),DCAF9 通過與CRL4-DDB1 構(gòu)成E3 泛素連接酶,對(duì)組蛋白H2A 在K119進(jìn)行單泛素化,從而抑制這些基因的表達(dá),發(fā)揮其抑制脂肪生成的功能[32]。

2.9 DCAF11

DCAF11 與 CRL4-DDB1 復(fù)合物構(gòu)成 E3 泛素連接酶,通過在S 期末對(duì)莖環(huán)結(jié)構(gòu)結(jié)合蛋白(Stem-loop binding protein,SLBP)進(jìn)行泛素化降解來抑制組蛋白合成,從而保障細(xì)胞周期的正常進(jìn)行。SLBP 在Thr61/Ala 上的點(diǎn)突變會(huì)影響DCAF11的識(shí)別,阻礙SLBP 的降解,導(dǎo)致突變體細(xì)胞大量死亡[33]。DCAF11 還參與 p21 的單泛素化降解,從而調(diào)控細(xì)胞周期[32]。

2.10 DCAF13

目前關(guān)于DCAF13 的研究主要集中在功能定位上。DCAF13 是RNA 結(jié)合蛋白[34],其表達(dá)下降會(huì)導(dǎo)致40S 核糖體亞基前體的成熟障礙[35]。最近研究發(fā)現(xiàn),小鼠卵母細(xì)胞中DCAF13 的條件性敲除,會(huì)引起卵母細(xì)胞發(fā)育停滯。DCAF13 參與卵母細(xì)胞的18S rRNA 加工及成熟過程,其缺失導(dǎo)致卵母細(xì)胞的核糖體組裝紊亂,引起蛋白質(zhì)合成減少,最終導(dǎo)致卵母細(xì)胞發(fā)育停滯[36]。

2.11 DCAF14

DCAF14 又名 WDR11。目前,DCAF14 的研究方向主要集中于DCAF14 與腫瘤及發(fā)育障礙等疾病的相關(guān)性。DCAF14 基因位于染色體10q25～26。10q25～26 位置上基因的缺失所造成的疾病被稱為10q26 缺失綜合征,患者表現(xiàn)出顱面畸形、智力障礙、心臟結(jié)構(gòu)缺損、生長(zhǎng)遲緩等一系列生長(zhǎng)發(fā)育障礙。研究提示,DCAF14 基因無義突變是導(dǎo)致10q26 缺失綜合征的重要原因[37]。同時(shí),10q25～26和19q13.3～13.4 的等位基因缺失是神經(jīng)膠質(zhì)瘤中最常見的遺傳改變,Chernova 等[38]在腫瘤細(xì)胞系上證實(shí)這種遺傳改變往往伴隨DCAF14 基因的缺失,提示DCAF14 可能是一個(gè)重要的腫瘤抑制基因,但其抑制腫瘤形成的機(jī)制仍有待探索。

2.12 DCAF15

目前關(guān)于DCAF15 的研究比較少?，F(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道,DCAF15 可與CRL4-DDB1 復(fù)合物構(gòu)成 E3泛素連接酶,并參與抗癌藥物indisulam 介導(dǎo)的對(duì)RBM39 的泛素化降解,從而靶向破壞前體mRNA的剪接,抑制癌細(xì)胞發(fā)生發(fā)展[39]。

2.13 DCAF17

DCAF17 參與維持正常的精卵細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育。研究發(fā)現(xiàn),在DCAF17 敲除的小鼠模型中,其精卵細(xì)胞數(shù)目明顯減少并伴隨功能缺陷,無法正常繁殖出子代[40]。進(jìn)一步的研究證實(shí),DCAF17 的缺陷會(huì)引起生殖細(xì)胞凋亡增加,但DCAF17 不參與配子形成減數(shù)分裂這一過程的調(diào)控[41]?？偟膩碇v,DCAF17 調(diào)控生殖細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育的分子機(jī)制仍不明確,有待進(jìn)一步探究。

3 結(jié)語

自2006年發(fā)現(xiàn)DCAF 家族蛋白到現(xiàn)在,針對(duì)DCAF 家族蛋白的研究已經(jīng)取得了很大的進(jìn)展。就目前研究結(jié)果而言,DCAF 家族蛋白是機(jī)體維持正常生長(zhǎng)發(fā)育所需的重要蛋白質(zhì),其功能涉及細(xì)胞的增殖、分化、凋亡等一系列調(diào)控; 同時(shí),DCAF 蛋白通過與CRL4-DDB1 復(fù)合物構(gòu)成E3泛素連接酶,對(duì)p21、p53 進(jìn)行泛素化修飾,參與細(xì)胞周期的調(diào)控。例如：DCAF1、DCAF2、DCAF6、DCAF13 的缺陷會(huì)引起細(xì)胞增殖能力下降,相反DCAF3、DCAF6 的缺失則會(huì)引起細(xì)胞的大量異常增殖。此外,DCAF 家族蛋白的過表達(dá)或缺失與臨床上很多腫瘤、發(fā)育障礙等疾病的發(fā)生、進(jìn)展密切相關(guān)?？偟膩碇v,DCAF 家族蛋白的研究,可以加深我們對(duì)細(xì)胞周期調(diào)控分子機(jī)制的認(rèn)識(shí),為今后腫瘤的臨床治療提供新方向。當(dāng)然,關(guān)于DCAF家族蛋白的研究仍有很多問題需要完善。首先,截至目前,仍有許多DCAF 家族蛋白的功能及其分子機(jī)制未被發(fā)現(xiàn); 其次,目前關(guān)于DCAF 家族蛋白的研究大多集中在其對(duì)機(jī)體生長(zhǎng)發(fā)育的影響(比如對(duì)細(xì)胞周期的調(diào)控),而關(guān)于其在代謝、免疫等其他方面的研究相對(duì)較少,既然DCAF 蛋白與腫瘤和HIV 感染等一些疾病存在密切的相關(guān)性,那它在機(jī)體免疫過程中是否發(fā)揮重要的角色？或許也值得進(jìn)一步探索。