羅文婕,蔣國(guó)民,趙大芳,熊 鼎,瞿符發(fā),曹申平,徐文倩,劉 臻*,李建中,印遇龍

(1.長(zhǎng)沙學(xué)院生物與環(huán)境工程學(xué)院水生動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與品質(zhì)調(diào)控湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,中國(guó)湖南 長(zhǎng)沙 410022; 2.湖南省水產(chǎn)科學(xué)研究所,中國(guó)湖南 長(zhǎng)沙 410153; 3.湖南師范大學(xué)淡水魚(yú)發(fā)育生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室湖南省動(dòng)物腸道生態(tài)與健康國(guó)際聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物腸道功能調(diào)控湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,中國(guó)湖南 長(zhǎng)沙 410081)

瘦素(leptin)是肥胖基因編碼,主要由脂肪細(xì)胞分泌的一類(lèi)激素樣蛋白質(zhì)[1]。瘦素的作用部位主要在中樞神經(jīng)系統(tǒng),其通過(guò)與中樞神經(jīng)系統(tǒng)及外周組織的瘦蛋白受體結(jié)合,形成二聚體,繼而激活下游一系列信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,影響機(jī)體的代謝[2]。瘦素基因在調(diào)節(jié)食物攝入、能量代謝和生殖方面具有重要作用,目前已經(jīng)在草魚(yú)[3]、虹鱒[4]、黃顙魚(yú)[5]、紅鰭東方鲀[6]、大西洋鮭[7]、日本青鳉[8]、大黃魚(yú)[9]、大馬哈魚(yú)[10]、羅非魚(yú)[11]、斑馬魚(yú)[12]、石斑魚(yú)[13]和鯉[14]等魚(yú)類(lèi)中被廣泛研究。注射試驗(yàn)表明,重組瘦蛋白會(huì)誘導(dǎo)短期的強(qiáng)烈厭食行為[3,15～17],引起肝糖原、肌糖原以及循環(huán)激素水平的變化[15～16];在分子水平上顯著上調(diào)糖原性和糖酵解能力、葡萄糖激酶活性以及葡萄糖轉(zhuǎn)染反應(yīng)相關(guān)基因mRNA 水平[17],同時(shí)也可顯著上調(diào)解偶聯(lián)蛋白2、瘦素和脂肪酸結(jié)合蛋白基因的mRNA 表達(dá)[3,18],而脂蛋白脂肪酶基因的表達(dá)受到抑制[3]。有意思的是,在長(zhǎng)期實(shí)驗(yàn)中,厭食行為消失[3]。以上信息提示,瘦素在調(diào)節(jié)食物攝入、能量代謝和脂質(zhì)代謝上具有急性作用。此外,鼠重組瘦蛋白對(duì)雄性歐洲鱸魚(yú)促性腺激素釋放激素(gonadotropin-releasing hormone,GnRH)誘導(dǎo)的促黃體生成激素(luteinizing hormone,LH)的釋放具有累加或抑制作用,表明瘦蛋白是魚(yú)類(lèi)生殖系統(tǒng)的調(diào)節(jié)劑[19～20]; 人類(lèi)重組瘦素可以在雌性虹鱒離體腦垂體促性腺激素分泌中發(fā)揮作用[21]。異源重組瘦蛋白的注射試驗(yàn)表明,瘦素在進(jìn)化上可能具有高度保守性,在生物體內(nèi)均能發(fā)揮其調(diào)節(jié)能量代謝的作用,這為瘦素應(yīng)用與人類(lèi)疾病的治療提供了參考。

在哺乳動(dòng)物中,瘦素參與復(fù)雜的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),主要包括JAK-STAT 信號(hào)傳送途徑、磷酸肌醇3-激酶-蛋白激酶B (phosphatidylinositol 3-kinaseprotein kinase B,PI3K/PKB)途徑和絲裂原激活蛋白激酶-胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2 (mitogen-activated protein kinase-extracellular signal-regulated protein kinase 1/2,MAPK-ERK1/2)途徑[22]。瘦素 β 受體大量存在于下丘腦中,可激活JAK2 依賴和非依賴途徑[23],而JAK2 參與許多激素信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo),包括瘦素[23]、生長(zhǎng)激素和鈉離子偶聯(lián)的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)[24]。研究表明,在大鼠中瘦素可通過(guò)質(zhì)子依賴性寡肽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1 (oligopeptide transporter 1,PepT1)增加小肽穿過(guò)小腸上皮屏障的轉(zhuǎn)運(yùn)效率[25]。小肽吸收進(jìn)入小腸細(xì)胞這一過(guò)程依賴于小肽轉(zhuǎn)運(yùn)載體PepT1 和PepT2。膳食中添加賴氨酰-甘氨酸二肽可顯著增加虹鱒中PepT1 和瘦素的mRNA 表達(dá)[26];同時(shí),瘦素可通過(guò)JAK2-STAT3 信號(hào)途徑參與調(diào)控非洲爪蟾腸道PepT1 的表達(dá),從而介導(dǎo)甘氨酸-甘氨酸二肽的轉(zhuǎn)運(yùn)[22,24],提示JAK2 廣泛參與小肽的轉(zhuǎn)運(yùn)。然而JAK2-STAT3 信號(hào)途徑是否介導(dǎo)了草魚(yú)的小肽轉(zhuǎn)運(yùn),尚不明晰。

草魚(yú)是我國(guó)淡水養(yǎng)殖的四大家魚(yú)之一,因其食性簡(jiǎn)單、飼料來(lái)源廣泛、養(yǎng)殖方便、產(chǎn)量高并且生長(zhǎng)迅速,所以具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值[27],已成為我國(guó)主要精養(yǎng)對(duì)象之一。目前,關(guān)于重組瘦蛋白對(duì)草魚(yú)脂質(zhì)代謝和攝食的影響已有報(bào)道[3]。然而有關(guān)草魚(yú)攝食因子瘦素信號(hào)通路對(duì)小肽轉(zhuǎn)運(yùn)的研究還很少,本研究通過(guò)構(gòu)建草魚(yú)瘦素基因的重組質(zhì)粒,獲得草魚(yú)瘦素原核表達(dá)蛋白質(zhì),并通過(guò)體內(nèi)注射草魚(yú)重組瘦蛋白研究瘦蛋白對(duì)草魚(yú)瘦素受體及JAK2、STAT3 mRNA 水平的影響,為進(jìn)一步研究草魚(yú)瘦素及其對(duì)JAK2-STAT3 信號(hào)通路的調(diào)控機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

本實(shí)驗(yàn)所用草魚(yú)購(gòu)于湖南省水產(chǎn)科學(xué)研究所(45±5 g)。原核表達(dá)載體 pGEX4T-1、E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞和E.coli BL21 感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自北京天根生化科技有限公司。

1.2 目的片段的獲取

利用Trizol 法提取草魚(yú)腦垂體組織總RNA,并利用PrimeScriptTMⅡ1st Strand cDNA Synthesis Kit (大連寶生物工程有限公司)將其反轉(zhuǎn)錄成cDNA?；诓蒴~(yú)瘦素基因(GenBank 登錄號(hào)：EU-719623.1) cDNA 序列,克隆出草魚(yú)瘦素的開(kāi)放閱讀框(open reading frame,ORF),利用Premier 5.0設(shè)計(jì)引物L(fēng)eptin-F/Leptin-R(表1)。以反轉(zhuǎn)錄獲得的草魚(yú)cDNA 為模板,通過(guò)PCR 擴(kuò)增得到含有瘦素ORF 序列的目的片段。以此序列作為模板,用SignaIP-5.0 軟件(http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)預(yù)測(cè)草魚(yú)leptin 蛋白的信號(hào)肽序列,根據(jù)瘦素基因信號(hào)肽序列位點(diǎn)和pGEX4T-1 質(zhì)粒的酶切位點(diǎn),委托上海鉑尚生物技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)1 對(duì)去除信號(hào)肽的含EcoRⅠ及XhoⅠ雙酶切位點(diǎn)的特異性引物(LeptinEcoRⅠ-F/LeptinXhoⅠ-R)。通過(guò)PCR 擴(kuò)增,獲得去除信號(hào)肽的目的片段。PCR 擴(kuò)增反應(yīng)體系為 50 μL：cDNA 1 μL、LeptinEcoRⅠ-F 1 μL、LeptinXhoⅠ-R 1 μL、dNTP mix 8 μL、10×LATaq Plus DNA 聚合酶 buffer 5 μL、LATaq Plus DNA 聚合酶 0.5 μL、ddH2O 33.5 μL。反應(yīng)條件：94 ℃ 4 min; 94 ℃ 30 s,48 ℃ 30 s,72 ℃ 3 min,32 個(gè)循環(huán),72 ℃ 10 min; 4 ℃保存。PCR 產(chǎn)物用2.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。挑選條帶位置正確的PCR 產(chǎn)物,送往上海鉑尚生物技術(shù)有限公司測(cè)序,將測(cè)序結(jié)果與已知序列進(jìn)行比對(duì),如果一致,則說(shuō)明獲得了草魚(yú)瘦素基因的目的片段。

1.3 原核表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定

使用超微量核酸蛋白測(cè)定儀(IMPLEN,德國(guó))測(cè)定目的片段與pGEX4T-1 質(zhì)粒的濃度。采用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和XhoⅠ(大連寶生物工程有限公司)于37 ℃條件下對(duì)pGEX4T-1 質(zhì)粒和目的片段進(jìn)行雙酶切10 min。目的片段酶切體系：10× QuickCut buffer (大連寶生物工程有限公司)9 μL、EcoRⅠ3 μL、XhoⅠ3 μL、PCR 產(chǎn)物≤0.2 μg,加 ddH2O 補(bǔ)足至 90 μL。質(zhì)粒酶切體系：10×QuickCut buffer 5 μL、EcoRⅠ1 μL、XhoⅠ1 μL、質(zhì)粒 DNA≤1 μg,加 ddH2O 補(bǔ)足至 50 μL。連接體系：目的片段酶切產(chǎn)物2 μL、質(zhì)粒酶切產(chǎn)物0.5 μL、SolutionⅠ2.5 μL,4 ℃連接過(guò)夜。把連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞BL21 中,涂布在含有氨芐青霉素的平板上37 ℃培養(yǎng)24 h 后,選取陽(yáng)性克隆菌株,測(cè)序(委托上海鉑尚生物技術(shù)有限公司進(jìn)行)成功后擴(kuò)大培養(yǎng)。

1.4 pGEX4T-1-CiLEP的原核誘導(dǎo)表達(dá)

利用HiPure Plasmid EF Micro Kit 質(zhì)粒提取試劑盒(廣州美基生物科技有限公司)提取重組質(zhì)粒。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞BL21,熱激后涂布在含有氨芐青霉素的平板上37 ℃培養(yǎng)12 h。挑取單克隆到含氨芐青霉素抗性的液體培養(yǎng)基(胰蛋白胨10 g、酵母浸出粉5 g、氯化鈉10 g,加 ddH2O 至 1 000 mL 溶解,用氫氧化鈉調(diào)pH 至7.0 后高溫滅菌30 min)中擴(kuò)大培養(yǎng); 當(dāng)OD值達(dá)到0.6 時(shí),添加誘導(dǎo)劑異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)后繼續(xù)培養(yǎng)。在該環(huán)節(jié),以未添加誘導(dǎo)劑的樣品為陰性對(duì)照,通過(guò)選擇不同濃度的IPTG 及不同培養(yǎng)溫度、時(shí)間來(lái)對(duì)誘導(dǎo)條件進(jìn)行優(yōu)化,使重組蛋白質(zhì)的表達(dá)量達(dá)到較高水平。誘導(dǎo)培養(yǎng)后離心棄上清,收集菌體。用磷酸鹽緩沖液(PBS,德國(guó)Magen 公司) 懸浮收集到的菌體,并使用超聲破碎儀將其充分裂解; 離心后收集上清,在沉淀中加入緩沖液A (8 mol/L 尿素、50 mmol/L三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽、300 mmol/L 氯化鈉,pH 8.0)重懸。分別將上清和沉淀與2×上樣緩沖液(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)1︰1 混勻,100 ℃水浴10 min 后準(zhǔn)備SDS-PAGE 檢測(cè)。

1.5 重組蛋白質(zhì)的純化

將IPTG 誘導(dǎo)后的細(xì)胞培養(yǎng)液離心去培養(yǎng)基,沉淀用緩沖液B [50 mmol/L 三羥甲基氨基甲烷(Tris)、300 mmol/L 氯化鈉、0.2 mmol/L 苯甲基磺酰氟(PMSF)、0.1% 聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)、2 mmol/L 二硫蘇糖醇(DTT)、1 mmol/L 乙二胺四乙酸(EDTA),pH 8.0]重懸。將重懸液置于冰上,經(jīng)超聲破碎(2 s,暫停6 s,以此為一個(gè)循環(huán))后離心收集上清,沉淀用150 mL 緩沖液C (2 mol/L 尿素、50 mmol/L Tris、300 mmol/L 氯化鈉、0.1% Triton X-100、2 mmol/L DTT、1 mmol/L EDTA,pH 8.0)重懸后,上下顛倒混勻以進(jìn)一步裂解,裂解后的溶液經(jīng)離心收集上清,將兩次收集的上清液合并。用10倍柱床體積的緩沖液D(25 mmol/L Tris、150 mmol/L氯化鈉,pH 8.0)平衡柱子(上海生工生物工程有限公司),流速5 mL/min; 將兩次收集的上清液合并后與5 mL GST-NTA(上海生工生物工程有限公司)混勻,孵育2 h; 將孵育后的混合物上柱,收集粗蛋白流出液; 用25 mL 緩沖液D 清洗平衡柱子,收集洗雜流出液;用40～50 mL 緩沖液E[50 mmol/L Tris、300 mmol/L 氯化鈉、50 mmol/L 谷胱甘肽(GSH),pH 8.0]洗脫,在洗脫過(guò)程中檢測(cè)洗脫得到的蛋白質(zhì)樣品,若檢測(cè)沒(méi)有蛋白質(zhì)則繼續(xù)清洗柱子,同時(shí)停止接樣,一般接下來(lái)的洗脫液體積在30 mL左右; 收集洗脫流出液。將粗蛋白流出液、洗雜流出液、洗脫流出液分別與2×上樣緩沖液1︰1 混勻,100 ℃水浴處理10 min,準(zhǔn)備SDS-PAGE 檢測(cè)。將純度較好的3 種組分透析到緩沖液F (50 mmol/L Tris、300 mmol/L 氯化鈉、2 mmol/L DTT,pH 8.0)中,透析結(jié)束后用PEG20000 濃縮,0.22 μm 濾膜過(guò)濾后按每管1 mL 分裝,-80 ℃保存。

1.6 重組蛋白質(zhì)的檢測(cè)

SDS-PAGE 檢測(cè)：將純化后的蛋白質(zhì)與 2×上樣緩沖液(上海碧云天生物技術(shù)有限公司) 1︰1 混勻,100 ℃水浴10 min 后取出待用;用蛋白膠試劑盒(美國(guó)Bio-Rad 公司)制作13%的蛋白膠;將樣品和蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)(大連寶生物工程有限公司)分別以10 μL 上樣,電泳開(kāi)始時(shí)恒壓80 V,樣品進(jìn)入分離膠后恒壓120 V,直至溴酚藍(lán)走至前沿為止。

Western-blot 驗(yàn)證：蛋白質(zhì)樣品經(jīng) 13% SDSPAGE 電泳后,將其置于半干電轉(zhuǎn)儀(美國(guó)Bio-Rad公司)中250 mA 轉(zhuǎn)膜90 min; 5%脫脂奶粉封閉搖床2 h;加入一抗(兔抗GST 標(biāo)簽,稀釋比例1︰500,上海生工生物工程有限公司)后置于搖床上室溫孵育 60 min,用 PBS 洗膜 3 次,每次 10 min,隨后用二抗(羊抗兔,稀釋比例1︰8 000,上海生工生物工程有限公司)室溫孵育60 min,再經(jīng)PBS 洗膜3 次,最后用TMB 顯色試劑盒(上海生工生物工程有限公司)顯色5 min,并用化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(美國(guó)Bio-Rad 公司)成像觀察。

蛋白質(zhì)濃度測(cè)定：采用非干擾型蛋白質(zhì)定量試劑盒Cat.No.C503071 (上海生工生物工程有限公司)測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。

1.7 草魚(yú)融合重組瘦蛋白的注射

在湖南省水產(chǎn)研究院室外養(yǎng)殖池對(duì)草魚(yú)進(jìn)行注射試驗(yàn)。兩組草魚(yú)(體重30±5 g,每組15 尾)分別注射 100 μL 含 30 μg 融合重組瘦蛋白(GST 標(biāo)簽蛋白和重組瘦蛋白的融合蛋白)的PBS (LEP 組)或 100 μL 含 30 μg GST 標(biāo)簽蛋白(上海生工生物工程有限公司)的 PBS (GST 組)。注射 4 h 后(禁食)取樣,每組隨機(jī)3 尾。采用Trizol 法分別提取各組腦垂體和腸道的總RNA,使用cDNA 合成試劑盒(大連寶生物工程有限公司)將其反轉(zhuǎn)錄成cDNA,-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.8 熒光定量PCR

為了評(píng)價(jià)重組瘦蛋白注射對(duì)草魚(yú)瘦素受體(leptin-receptor,Lep-R)基因及 JAK2-STAT3 信號(hào)通路 JAK2、STAT3 和 PepT1 基因表達(dá)的影響,以基因文庫(kù)中可用序列設(shè)計(jì)Lep-R、JAK2、STAT3和PepT1 的熒光定量PCR 引物(表1),并以草魚(yú)β-actin 基因?yàn)槟０逶O(shè)計(jì)內(nèi)參基因熒光定量特異性引物(β-actin-F/β-actin-R),進(jìn)行熒光定量 PCR。根據(jù)熒光定量試劑盒(SYBR? Premix Ex TaqTMⅡ,大連寶生物工程有限公司)說(shuō)明書(shū),熒光定量PCR擴(kuò)增反應(yīng)(14 μL)使用 7 μL 預(yù)混酶 Ex Taq(TliRNaseH Plus,2×)、1 μL cDNA、1 μL 上下游引物(10 μmol/L)、0.4 μL Rox 和 4.6 μL ddH2O。熒光定量 PCR 反應(yīng)條件：50 ℃ 5 min,在 95 ℃孵育 10 min,95 ℃變性15 s,40 個(gè)循環(huán),60 ℃退火并延伸60 s。每個(gè)樣品3 個(gè)重復(fù),利用 2-ΔΔCt方法[3]和 CFX Manager 軟件系統(tǒng)(美國(guó)Bio-Rad 公司)分析mRNA 相對(duì)表達(dá)量。ΔΔCt=實(shí)驗(yàn)組(Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因)-對(duì)照組(Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因)。

1.9 數(shù)據(jù)處理

實(shí)時(shí)熒光定量PCR 所得到的數(shù)據(jù)用Excel 2007 軟件進(jìn)行初步處理,采用SPSS 19.0 軟件進(jìn)行單因素方差分析,結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,以 P＜0.05 為顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)。用Prism 6.0 軟件制圖。

2 結(jié)果

2.1 原核重組載體的構(gòu)建及表達(dá)

根據(jù)草魚(yú)瘦素基因的cDNA 序列,利用SignaIP-5.0 軟件(http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)在線預(yù)測(cè)草魚(yú)瘦蛋白的信號(hào)肽序列,該信號(hào)肽包括20 個(gè)氨基酸,則酶切位點(diǎn)位于第20 個(gè)氨基酸和第21 個(gè)氨基酸之間(MYSPVLLYTCFLSILGMIDG^RSIPIHQDNLKNLVKLQADTIIHRIKEHNEKLKLSPKILIGDSELYPEVPADKPIQGLGSIVDTLTTFQKILQTLPKGHVSQLHNDMSTLLEYFKDRMTFMRCTLKEPANGKSLDTFIEKNATHHITFGYMALDRLKQFMQKLIANLDQLKSC,^ 代表酶切位點(diǎn))。用EcoRⅠ和XhoⅠ酶切瘦素基因序列并將產(chǎn)物連接到經(jīng)同樣酶切后的pGEX4T-1 載體,構(gòu)建重組質(zhì)粒pGEX4T-1-CiLEP。構(gòu)建的載體經(jīng)測(cè)序分析,確認(rèn)插入片段的序列無(wú)移碼突變。將重組質(zhì)粒在大腸桿菌中原核表達(dá),得到的重組蛋白質(zhì)包含瘦素的N 端,并包含382 個(gè)氨基酸殘基,其相對(duì)分子質(zhì)量(MW)為44 210.9,預(yù)測(cè)的等電點(diǎn)(pI)為7.63。

2.2 重組蛋白質(zhì)的表達(dá)、純化及鑒定

與未經(jīng)IPTG 誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)組分相比,在IPTG 誘導(dǎo)下表達(dá)的原核重組蛋白質(zhì),經(jīng)SDSPAGE 電泳分析可見(jiàn)1 條47 kD 的特異性條帶,與預(yù)期目的條帶大小一致,說(shuō)明pGEX4T-1-CiLEP重組質(zhì)粒在大腸桿菌中正確表達(dá)。隨后,通過(guò)考察IPTG 濃度及不同培養(yǎng)溫度、時(shí)間,我們挑選了20 ℃培養(yǎng)16 h、37 ℃培養(yǎng)4 h 兩種表達(dá)量較高的條件,并對(duì)其所培養(yǎng)菌體裂解后的上清和沉淀(分別稱(chēng)作 20 ℃上清、20 ℃沉淀、37 ℃上清和37 ℃沉淀)進(jìn)行了蛋白質(zhì)分析,結(jié)果顯示重組蛋白質(zhì)主要存在于37 ℃沉淀中(圖1),表明在添加0.5 mmol/L誘導(dǎo)劑IPTG 條件下,37 ℃培養(yǎng)4 h 時(shí)菌體中融合重組瘦蛋白的表達(dá)量最高。在此條件下擴(kuò)大培養(yǎng),并對(duì)未用IPTG 誘導(dǎo)的GST 標(biāo)簽蛋白及融合重組瘦蛋白、37 ℃條件下誘導(dǎo)的GST 標(biāo)簽蛋白及融合重組瘦蛋白、純化后的GST 標(biāo)簽蛋白及融合重組瘦蛋白分別進(jìn)行SDS-PAGE 檢測(cè),結(jié)果表明純化后的組分得到單一條帶,表明GST 標(biāo)簽蛋白及融合重組瘦蛋白純化成功(圖2)。

為進(jìn)一步確定純化獲得的蛋白質(zhì)為融合重組瘦蛋白,按照Western-blot 步驟用TMB 顯色試劑盒顯色。結(jié)果顯示在相應(yīng)位置出現(xiàn)明顯條帶,表明該蛋白質(zhì)確實(shí)是融合重組瘦蛋白(圖3)。采用非干擾型蛋白質(zhì)定量試劑盒Cat.No.C503071 測(cè)定第1 批蛋白質(zhì)濃度為0.27 mg/mL,待測(cè)樣品體積為20 μL; 第 2 批蛋白質(zhì)濃度為 0.30 mg/mL,待測(cè)樣品體積為20 μL,結(jié)果得到2 mg 的融合重組瘦蛋白,滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求。

表1 引物參數(shù)Table 1 Primers used in this study

圖1 IPTG 誘導(dǎo)表達(dá)的重組蛋白質(zhì)的SDS-PAGE 分析圖M：蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)(Cat.No.C600525); 1：誘導(dǎo)前總蛋白質(zhì);2：20 ℃上清;3：20 ℃沉淀;4：37 ℃上清;5：37 ℃沉淀。Fig.1 SDS-PAGE analysis of recombinant protein expression induced by IPTGM：Protein marker (Cat.No.C600525); 1：Total protein before induction;2：20 °C supernatant;3：20 °C precipitation;4：37 °C supernatant; 5：37 °C precipitation.

2.3 注射重組瘦蛋白對(duì)JAK2-STAT3信號(hào)通路相關(guān)基因表達(dá)的影響

以純化得到的融合重組瘦蛋白進(jìn)行注射實(shí)驗(yàn)(每條 30 μg)。結(jié)果顯示,與 GST 對(duì)照組相比,LEP組腦垂體和腸中 Lep-R、JAK2、STAT3 及 PepT1的mRNA 表達(dá)水平上調(diào),其中腦垂體Lep-R、JAK2、STAT3 基因和腸 Lep-R、JAK2、PepT1 基因在兩組之間的表達(dá)存在顯著差異(P＜0.05)。此外,不同組織間基因表達(dá)存在差異,腦垂體中STAT3 表達(dá)量最高,PepT1 表達(dá)量最低,而腸道中則是PepT1 表達(dá)量最高,Lep-R 表達(dá)量最低; Lep-R 和JAK2 在腦垂體中的mRNA 表達(dá)量高于腸道,而STAT3 與PepT1 在腸道中的mRNA 表達(dá)量則高于腦垂體(圖 4,圖 5)。

圖2 最終純化蛋白質(zhì)的SDS-PAGE 分析圖M：蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn); 1：未經(jīng)誘導(dǎo)的 GST 標(biāo)簽蛋白; 2：37 ℃條件下經(jīng) IPTG 誘導(dǎo)的 GST 標(biāo)簽蛋白; 3：純化后的GST 標(biāo)簽蛋白; 4：未經(jīng)誘導(dǎo)的融合重組瘦蛋白; 5：37 ℃條件下經(jīng)IPTG 誘導(dǎo)的融合重組瘦蛋白; 6：純化后的融合重組瘦蛋白。Fig.2 SDS-PAGE analysis of the final purified proteinM：Protein marker; 1：Non-induced GST tag protein; 2：GST tag protein induced at 37 ℃; 3：Purified GST tag protein; 4：Non-induced recombinant fusion leptin protein; 5：Recombinant fusion leptin protein induced at 37 ℃ ; 6：Purified recombinant fusion leptin protein.

圖3 最終純化蛋白質(zhì)的Western-blot 分析圖M：蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)(Cat.No.C610013); 1：融合重組瘦蛋白。Fig.3 Western-blot analysis of the final purified proteinM：Protein marker (Cat.No.C610013); 1：Recombinant fusion leptin protein.

圖4 重組瘦蛋白的注射對(duì)草魚(yú)腦垂體中相關(guān)基因表達(dá)的影響a,b 字母表示差異顯著。Fig.4 Effects of leptin injection on the expression of related genes in the pituitaryLetters“a”and“b”mean a significant difference.

圖5 重組瘦蛋白的注射對(duì)草魚(yú)腸道相關(guān)基因表達(dá)的影響a,b 字母表示差異顯著。Fig.5 Effect of leptin injection on related genes in the intestineLetters“a”and“b”mean a significant difference.

3 討論

在魚(yú)類(lèi)研究中,人們已經(jīng)在pET-3c 質(zhì)粒中構(gòu)建了草魚(yú)瘦素的原核重組表達(dá)載體[3],在pET-32a 和pGEX4T-1 質(zhì)粒中構(gòu)建了建鯉瘦素的原核重組表達(dá)載體[28]。為了方便蛋白質(zhì)的純化回收,本文選用了含有GST 標(biāo)簽的原核表達(dá)載體pGEX4T-1,用于構(gòu)建草魚(yú)瘦素的重組表達(dá)載體。構(gòu)建的重組質(zhì)粒pGEX4T-1-CiLEP 表達(dá)重組蛋白質(zhì)后,GST標(biāo)簽的相對(duì)分子質(zhì)量大小約27.8 kD、目的蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量大小為19.2 kD、重組蛋白質(zhì)總的相對(duì)分子質(zhì)量約為47 kD,與圖2 的結(jié)果一致,這說(shuō)明本文構(gòu)建的重組質(zhì)粒pGEX4T-1-CiLEP 成功表達(dá)了融合重組瘦蛋白。

原核生物沒(méi)有核膜,缺乏復(fù)雜的蛋白質(zhì)折疊和質(zhì)量控制機(jī)制。通常,原核表達(dá)不需要信號(hào)肽的定位作用,其邊轉(zhuǎn)錄邊表達(dá),沒(méi)有區(qū)域間隔。信號(hào)肽大多是疏水性,溶解性較差,在原核細(xì)胞中表達(dá)信號(hào)肽蛋白容易產(chǎn)生包涵體[29～30]。另外,原核生物的基因中是不存在信號(hào)肽片段的,信號(hào)肽序列中的密碼子對(duì)原核生物來(lái)說(shuō)可能是稀有密碼子,多余的信號(hào)肽不能被細(xì)胞識(shí)別并切除,從而影響蛋白質(zhì)的正確折疊。因此,我們?cè)跇?gòu)建原核表達(dá)質(zhì)粒時(shí)先進(jìn)行了信號(hào)肽預(yù)測(cè),通過(guò)設(shè)計(jì)不含信號(hào)肽的引物構(gòu)建了不含信號(hào)肽的原核表達(dá)質(zhì)粒pGEX4T-1-CiLEP。

在原核表達(dá)體系,如E.coli 大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng),外源基因的表達(dá)通常需要誘導(dǎo)劑的參與才能進(jìn)行。目前常用的誘導(dǎo)劑為IPTG,其作用極強(qiáng)且穩(wěn)定。在IPTG 存在時(shí),誘導(dǎo)劑可與Lac 阻遏物(阻遏蛋白)結(jié)合,使得阻遏蛋白構(gòu)象發(fā)生變化,導(dǎo)致阻遏物從基因上解離下來(lái),確保RNA 聚合酶的工作不受阻礙,最終啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄。不同的載體在誘導(dǎo)溫度、誘導(dǎo)時(shí)間以及IPTG 濃度上存在差異,低溫通常會(huì)減少包涵體的形成。在本研究中,采用37 ℃、0.5 mmol/L IPTG、4 h 的誘導(dǎo)條件能誘導(dǎo)出融合重組瘦蛋白,而且從重組蛋白質(zhì)的表達(dá)分析上看,其主要存在于沉淀中,這為后續(xù)的蛋白質(zhì)純化以及瘦素功能研究提供了基礎(chǔ)。

為了了解融合重組瘦蛋白在草魚(yú)中的活性,我們通過(guò)活體注射實(shí)驗(yàn),評(píng)估了Lep-R 和JAK2-STAT3 信號(hào)通路相關(guān)基因JAK2、STAT3 及PepT1的mRNA 表達(dá)水平。為了消除GST 標(biāo)簽蛋白的干擾,我們以注射GST 標(biāo)簽蛋白為對(duì)照組。瘦蛋白通過(guò)腦垂體中表達(dá)Lep-R 的細(xì)胞起作用從而控制能量平衡,瘦素與Lep-R 結(jié)合后,Lep-R 發(fā)生二聚化,導(dǎo)致酪氨酸磷酸化(PY-985 和PY-1138)并激活JAK2。Lep-R 的PY-1138 募集含有轉(zhuǎn)錄因子 STAT3 的 Src 同源 2 結(jié)構(gòu)域,導(dǎo)致 STAT3 酪氨酸磷酸化及轉(zhuǎn)錄入核[31～34]。瘦素促進(jìn)表達(dá)Lep-R的細(xì)胞中STAT3 的酪氨酸磷酸化,研究報(bào)道,在表達(dá)Lep-R 的神經(jīng)元中缺乏STAT3 的小鼠顯示出過(guò)度肥胖,表明STAT3 信號(hào)傳導(dǎo)在瘦素作用中起關(guān)鍵作用[33～36]。在大鼠中,胃分泌瘦素并進(jìn)入腸道直接作用于腸上皮細(xì)胞,增強(qiáng)PepT1 對(duì)肽的吸收[37～38]。相關(guān)研究表明,利用瘦素長(zhǎng)期誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞能激活PepT1 基因的轉(zhuǎn)錄,提高PepT1 mRNA的穩(wěn)定性,導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)PepT1 表達(dá)量增加[39],其中JAK2 介導(dǎo)瘦素調(diào)控PepT1 的表達(dá)[40]; 草魚(yú)腦中JAK2 mRNA 的相對(duì)表達(dá)量顯著高于腸系膜[41],STAT3 在腦中存在較低的表達(dá)[42]。我們的研究結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,LEP 組瘦蛋白能上調(diào)腦垂體和 腸道 Lep-R、JAK2、STAT3 及 PepT1 的mRNA 表達(dá)水平,Lep-R 與JAK2 在腦垂體中的mRNA 表達(dá)量顯著高于腸道,而腸道PepT1 和STAT3 的mRNA 表達(dá)量則顯著高于腦垂體。這表明我們制備的草魚(yú)融合重組瘦蛋白具有生物學(xué)活性,為之后深入了解草魚(yú)瘦素基因的功能及調(diào)控機(jī)制提供了理論依據(jù)。

4 結(jié)論

本研究構(gòu)建了草魚(yú)瘦素基因的原核表達(dá)載體,在0.5 mmol/L IPTG、37 ℃條件下成功誘導(dǎo)了融合重組瘦蛋白的表達(dá),并利用活體注射實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)純化的融合重組瘦蛋白能夠顯著上調(diào)草魚(yú)腸道和腦垂體中 Lep-R、JAK2、STAT3 和 PepT1 基因的表達(dá)。