郭 欣，郭 萌，陳 蓮

橘青霉侵染對楊梅果實酚類物質(zhì)代謝作用的影響

*郭 欣1,2，郭 萌1,2，陳 蓮3

（1. 漳州職業(yè)技術(shù)學(xué)院食品工程學(xué)院，福建，漳州 363000；2. 農(nóng)產(chǎn)品深加工及安全福建省高校應(yīng)用技術(shù)工程中心，福建，漳州 363000；3. 閩南師范大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，福建，漳州 363000）

以采前套袋控制病原菌潛伏侵染的楊梅果實為材料，采后接種橘青霉病菌，旨在研究橘青霉侵染對楊梅果實酚類物質(zhì)含量及相關(guān)氧化酶活性變化的影響。結(jié)果表明：橘青霉侵染初期，楊梅果實細(xì)胞多酚氧化酶(PPO) 、過氧化物酶 (POD)活性呈上升趨勢，酚類物質(zhì)快速合成以提高自身的抗病能力。而同時期苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性并沒有相應(yīng)增加，反而下降較快，致使木質(zhì)素合成受阻，說明橘青霉侵染雖然誘導(dǎo)楊梅果實產(chǎn)生一定的抗病性，但這種抗病能力有限。貯藏中后期，雖然POD活性略有下降，PPO活性保持平穩(wěn)，但二者始終處于較高水平，從而導(dǎo)致前期積累的酚類物質(zhì)被大量降解，加上前期木質(zhì)素合成受阻的影響，橘青霉更容易穿透楊梅果實細(xì)胞壁，進(jìn)入細(xì)胞組織內(nèi)繁殖生長，最終導(dǎo)致果實腐敗。

楊梅；橘青霉；酚類物質(zhì)代謝；抗病性；防御酶

楊梅是我國的特色水果之一，因果實色澤艷麗、柔軟多汁、酸甜適口而深受消費(fèi)者喜愛。楊梅果實采收于5~6月高溫多雨季節(jié)，其果肉組織細(xì)膩，細(xì)胞膜飽和度高，并且無果皮包裹，在貯存和運(yùn)輸過程中極易被碰傷，從而易受到病原菌的侵染。饒漢宗[1]等人研究發(fā)現(xiàn)，綠霉病是楊梅果實成熟期主要的真菌性病害，該病由橘青霉() 侵染引起，受害楊梅果實發(fā)軟腐敗。本課題組以前研究認(rèn)為，楊梅果實采后腐爛與采前橘青霉?jié)摲秩居嘘P(guān)。目前，國內(nèi)外針對楊梅果實病害的研究多集中于病原菌的分離鑒定和綜合防控技術(shù)方面[2-3]，但對于采前病原菌潛伏侵染引起的楊梅果實腐敗生理生化機(jī)制研究文獻(xiàn)報道較少。

酚類物質(zhì)是果實體內(nèi)一類重要的次生代謝物質(zhì)。許多學(xué)者研究證明，酚類物質(zhì)代謝與植物抗病性密切相關(guān)。唐永萍等[4]研究了不同灰霉病抗性蘋果果實中酚類物質(zhì)代謝特征，發(fā)現(xiàn)抗性品種苯丙氨酸解氨酶（PAL）、過氧化物酶（POD）、多酚氧化酶（PPO）活性都發(fā)生顯著的先升后降的變化，且均高于感病品種。Wang等[5]通過熱處理誘導(dǎo)楊梅果實中幾丁質(zhì)酶、β-1,3葡聚糖酶等酶活性的上升，提高果實的抗病性，有效降低楊梅采后綠霉病的發(fā)生。劉美艷等[6]研究表明，甘薯塊根受黑斑病浸染后，PAL及PPO活性上升，同時綠原酸及總酚含量也顯著增加，有利于提高甘薯抗黑斑病的能力。

本研究以楊梅果實為材料，研究人工接種橘青霉楊梅果實體內(nèi)酚類代謝相關(guān)酶活性的變化，旨在闡述酚類物質(zhì)代謝在楊梅果實綠霉病抗病性喪失及果實腐敗過程中的作用，為解釋楊梅果實采后綠霉病發(fā)病生理機(jī)制和增強(qiáng)防治措施提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與處理

供試楊梅采自福建省漳州市浮宮鎮(zhèn)，采收當(dāng)天用冷藏車運(yùn)至實驗室。挑選大小一致、無病蟲害和機(jī)械損傷的果實，用無菌蒸餾水沖洗3次。晾干后將果實浸泡于橘青霉孢子懸浮液中接種，以此作為處理組。以未接種的楊梅果實作為對照組，在25℃培養(yǎng)箱中保溫培養(yǎng)，每1 d取樣1次，進(jìn)行各指標(biāo)測定。

1.2 測定指標(biāo)及方法

1.2.1 總酚含量測定

參照林河通等[7]的方法。取果肉2 g，經(jīng)含1% HCl的甲醇溶液研磨成勻漿并抽提2 h，過濾定容，在280 nm處測定吸光值，結(jié)果以mg/g FW表示。

1.2.2 木質(zhì)素含量測定

參照鞠志國等[8]方法，略有改動。取2 g果肉，用25 mL 86%（V/V）硫酸水解4 h，隨后在250 mL蒸餾水煮沸1 h。真空過濾后試紙連同濾渣烘干后稱重，按下列公式計算。

木質(zhì)素%＝（烘干后濾紙連同濾渣總重-濾紙重）/樣品重×100% （1）

1.2.3 苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性的測定

參照Duan[9]的方法。取1 g果肉，加入10 mL·0.1 mol/L硼酸緩沖液研磨成勻漿后在10000 rpm 轉(zhuǎn)速離心15 min。取3 mL上清液與3 mL 0.02 mol/L L-苯丙氨酸、5 mL 0.1 mol/L硼酸緩沖液和2 mL蒸餾水混勻，在30 ℃水浴中反應(yīng)30 min后用HCl終止反應(yīng)。于290 nm處測定吸光值，結(jié)果以U/mg protein表示。

1.2.4 多酚氧化酶(PPO)和過氧化物酶(POD)活性的測定

參照林河通[10]和朱廣廉等[11]的方法，但略有修改。稱取果肉1 g于勻漿機(jī)中，加入10 mL pH ＝5.5 50 mmo1/L PBS中研磨成漿，隨后15 000 rpm 4℃離心20 min，取上清液重復(fù)上述操作，制得酶液。PPO活性測定采用鄰苯二酚法，取1.0 mL酶液，加入PPO反應(yīng)底物液，置于35 ℃水浴中反應(yīng)10 min隨即終止反應(yīng)，于525 nm處測定吸光值。以U/mg protein表示。POD活性測定采用愈創(chuàng)木酚法，取0.1 mL酶液，加入POD反應(yīng)底物液，在35℃下保溫15 min，隨后加入2 mL 20% TCA終止反應(yīng)，于470 nm處測定OD值。以U/mg protein表示。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有指標(biāo)測定數(shù)據(jù)均重復(fù)3 次，應(yīng)用SPSS數(shù)據(jù)分析軟件，對數(shù)據(jù)進(jìn)行差異性和相關(guān)系分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 橘青霉侵染后楊梅果實總酚含量的變化

酚類化合物是植物體內(nèi)一類重要的次生代謝物質(zhì)，對植物病原菌有不同程度的毒性，與植物抗病性密切相關(guān)。從圖1可以看出，楊梅接種橘青霉后的第1 d果實體內(nèi)總酚含量快速增加，顯著高于對照(＜0.05)。在第2 d達(dá)到峰值，同比對照增加了34%，但在隨后的第3 d和第4 d果實總酚含量下降較快，甚至低于同期對照，之后始終維持較低水平。而對照組總酚含量在整個貯藏期間均變化相對平緩。

2.2 橘青霉侵染后楊梅果實木質(zhì)素含量的變化

據(jù)報道，病原菌的侵染能誘導(dǎo)細(xì)胞快速合成木質(zhì)素而在細(xì)胞壁上形成一道致密、不易穿透的物理屏障，從而限制病原菌分泌的酶和毒素在細(xì)胞內(nèi)的擴(kuò)散。圖2表明，對照處理果實木質(zhì)素的含量隨貯藏期的延長呈增加趨勢，但增加范圍并不大，整個貯藏期間僅提高0.18%。

接種處理組果實細(xì)胞木質(zhì)素含量在貯藏的第1 d下降很快，從原始0.8%迅速下降至0.526%，顯著低于對照的0.85%。雖然在第3 d木質(zhì)素含量有所增加，但隨后第4 d又快速下降，并在貯藏后期始終處于較低水平，顯著低于對照(＜0.05)。

圖2 橘青霉侵染后楊梅果實木質(zhì)素含量的變化

2.3 橘青霉侵染后楊梅果實多酚氧化酶(PPO)和過氧化物酶(POD)活性的變化

多酚氧化酶(PPO)可將酚類物質(zhì)氧化成對病原菌具有高毒性的醌類物質(zhì)，可以阻止病原菌進(jìn)一步侵入[12-13]。POD是苯丙烷類代謝途徑的末端酶，可參與植物體內(nèi)木質(zhì)素的合成，從而起到抗病菌作用。如圖3所示，接種及對照處理楊梅果實PPO活性隨貯藏時間延長均呈先上升后下降的趨勢。區(qū)別在于對照處理PPO活性增加較為平緩，第3 d達(dá)到峰值，隨后緩慢下降。而接種處理PPO活性則有兩個快速增加階段，分別出現(xiàn)在第1 d和第4 d，增幅分別達(dá)到53%和40%。整個貯藏期間，接種處理PPO活性整體高于對照，二者差異顯著(＜0.05)。如圖4所示，接種及對照處理楊梅果實POD活性出現(xiàn)兩種不同的變化趨勢。接種處理POD活性在貯藏前期增加較快，在第2 d即出現(xiàn)峰值38.971 U/mg protein，約為當(dāng)天對照的1.5倍。隨后在第3 d快速下降至30.219 U/mg protein，貯藏后期變化不大。而對照處理POD活性整個貯藏期間內(nèi)則緩慢增加。

圖3 橘青霉侵染后楊梅果實多酚氧化酶(PPO)活性的變化

圖4 橘青霉侵染后楊梅果實過氧化物酶(POD)活性的變化

2.4 橘青霉侵染后楊梅果實苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性的變化

PAL是植物體內(nèi)苯丙烷類代謝途徑的限速酶，催化L-苯丙氨酸脫氨生成肉桂酸，再經(jīng)過各種酶促反應(yīng)最終生成木質(zhì)素的前體[14]。由圖5可見，接種處理的楊梅果實PAL活性在第1 d快速下降，顯著低于對照的53.234 U/mg protein。貯藏中后期PAL活性有所回升。而對照處理PAL活性在貯藏前2 d緩慢上升至峰值，隨后略微下降，并于貯藏后期相對穩(wěn)定。

圖5 橘青霉侵染后楊梅果實苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性的變化

3 討論

大量研究表明，酚類化合物及其中間產(chǎn)物對植物病原菌都有不同程度的毒性作用[15]，植物可通過對酚類物質(zhì)代謝的調(diào)節(jié)來起到抵御病原菌侵染的作用。李文娟等[16]研究發(fā)現(xiàn)氯化鉀可提高玉米莖髓酚類物質(zhì)含量，從而提高玉米莖髓抗莖腐病的能力。李磊等[17]利用高效液相色譜分析法檢測出黃冠梨果皮中主要酚類物質(zhì)為綠原酸，并且發(fā)現(xiàn)浸鈣和普魯蘭多糖涂膜處理可延緩黃冠梨儲藏期間綠原酸等酚類物質(zhì)含量的下降速度，降低了黃冠梨雞爪病發(fā)病率。本研究表明，橘青霉侵染楊梅后的第1 d和第2 d，果實細(xì)胞積累了大量的酚類物質(zhì)，同時POD、PPO活性也快速上升。說明果實細(xì)胞對病原菌發(fā)生識別，激活細(xì)胞內(nèi)防御系統(tǒng)，從而使果實細(xì)胞產(chǎn)生抗病性，防止病原菌的進(jìn)一步侵入。但這種抗病性能力有限，只持續(xù)了2 d。貯藏第3 d開始，酚類物質(zhì)含量不增反降，甚至低于對照水平，不能強(qiáng)有力地持續(xù)抑制病原菌，有利于病原菌在細(xì)胞內(nèi)擴(kuò)散，這可能是接種處理楊梅果實較對照易敗壞的原因之一。筆者推測有兩個原因：一是橘青霉分泌的某些物質(zhì)可能導(dǎo)致貯藏中后期酚類物質(zhì)合成受阻，這有待進(jìn)一步證實。二是貯藏中后期POD、PPO活性不斷增加，導(dǎo)致前期積累的酚類物質(zhì)被大量降解（圖3、圖4）。

木質(zhì)素是高等植物細(xì)胞壁的組成部分，也是一類重要的酚類物質(zhì)。苯草酸在PAL的作用下發(fā)生苯丙烷類代謝，產(chǎn)生對香豆醇、芥子醇和松柏醇，再經(jīng)POD脫氫聚合形成木質(zhì)素[18]。PAL是催化苯丙烷類代謝第一步反應(yīng)的酶，同時也是苯丙烷類代謝途徑的關(guān)鍵酶和限速酶。本研究發(fā)現(xiàn)，橘青霉侵染初期，雖然PPO、POD這兩個與木質(zhì)素合成的相關(guān)酶類活性增加，但PAL活性并沒有相應(yīng)增加，反而下降較快，致使木質(zhì)素合成受阻，這與圖2中顯示的木質(zhì)素含量下降表現(xiàn)出一致性。

4 小結(jié)

楊梅在感染橘青霉初期，通過調(diào)節(jié)楊梅果肉組織中PPO和POD活性，誘導(dǎo)果實體內(nèi)產(chǎn)生大量酚類物質(zhì)以提高自身的抗病能力，但這種自身調(diào)節(jié)能力有限。橘青霉感染中后期，隨著酚類物質(zhì)和木質(zhì)素自身合成受阻及不斷被降解，橘青霉更容易穿透楊梅果實細(xì)胞壁，進(jìn)入植物細(xì)胞組織內(nèi)繁殖生長，最終導(dǎo)致楊梅果實腐敗。

[1] 饒漢宗,王華弟,沈穎,等. 楊梅果實腐爛主要病害與綜合防控技術(shù)研究[J].浙江農(nóng)業(yè)科學(xué)2016,57(11):1892-1895.

[2] 王根鍔,劉又高,王益光,等. 楊梅貯藏中的病蟲害種類及其危害情況[J].中國南方果樹, 2002,31: 26-27.

[3] 戚行江,王連平,梁森苗,等. 楊梅氣調(diào)貯藏保鮮后果實真菌區(qū)系研究[J].浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報,2003,15( 1):28-30.

[4] 唐永萍,石亞莉,賀軍花,等. 不同灰霉病抗性蘋果果實中酚類物質(zhì)代謝特征[J].西北植物學(xué)報,2017,37(3): 0510-0516.

[5] Wang K T,Cao S F,Jin P,et al.Effect of hot air treatment on postharvest mould decay in Chinese bayberry fruit and possible mechanisms[J].Inter.J.Food Microbiol,2010,141: 11-16.

[6] 劉美艷,孫厚俊,王景景,等. 甘薯塊根抗黑斑病酚類物質(zhì)代謝的研究[J].中國農(nóng)學(xué)通報,2012,28(24):226-230.

[7] 林河通,甕紅利,張居念,等. 果實采前套袋對龍眼果實品質(zhì)和耐貯性的影響[J].農(nóng)業(yè)工程學(xué)報,2006,22(11): 232-237.

[8] 鞠志國,劉成連,原永兵,等. 萊陽茌梨酚類物質(zhì)合成的調(diào)節(jié)及其對果實品質(zhì)的影響[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué),1993,26(4): 44-48.

[9] Duan X W, Su X G,You Y L,et al. Effect of nitric oxide on pericarp browning of harvested longan fruit in relation to phenolic metabolism [J]. Food Chemistry,2007,104(2): 571- 576.

[10] 林河通. 龍眼果實采后果皮褐變機(jī)理和采后處理技術(shù)研究[D].杭州:浙江大學(xué),2003.

[11] 朱廣廉,鐘誨文,張愛琴. 植物生理學(xué)實驗[M].北京:北京大學(xué)出版社,1990:37-40.

[12] 高必達(dá),陳捷. 生理植物病理學(xué)[M].北京:科學(xué)出版社,2006:160-161.

[13] 周兵,閆小紅,楊芳珍. 果皮對不同甜蕎和苦蕎品種種子萌發(fā)特性的影響[J].井岡山大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版, 2016,37(6):42-47.

[14] 郭欣. 焦腐病菌侵染導(dǎo)致龍眼果皮敗壞的作用機(jī)理研究[D].福州:福建農(nóng)林大學(xué),2010.

[15] 梁建根,張炳欣,喻景權(quán). 促生菌CH1對黃瓜酚類物質(zhì)代謝的影響及與抗猝倒病的關(guān)系[J].植物保護(hù)科學(xué),2007,23(6):462-466.

[16] 李文娟,何萍,金繼運(yùn). 氯化鉀對玉米莖腐病抗性反應(yīng)中酚類物質(zhì)代謝的影響[J].植物營養(yǎng)與肥料學(xué)報,2008,14(3): 508-514.

[17] 李磊,寇曉虹.黃冠梨儲藏期間果皮酚類物質(zhì)代謝與雞爪病發(fā)生的關(guān)系[J].河南工業(yè)大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版,2011,32(4):74-79.

[18] 梁敏華,雷建敏,邵佳,等. UV-C處理對桃果實酚類物質(zhì)代謝和貯藏品質(zhì)的影響[J].核農(nóng)學(xué)報,2015,29(6): 1088-1093.

EFFECT ON PHENOLIC METABOLISM IN CHINESE BAYBERRY FRUIT INFECTED BY

*GUO Xin1,2, GUO Meng1,2, CHEN Lian3

（1. College of Food Engineering, Zhangzhou Institute of Technology, Zhangzhou, Fujian 363000, China; 2. The Applied Technical Engineering Center of Further Processing and Safety of Agricultural Products, Higher Education Institutions in Fujian Province, Zhangzhou, Fujian 363000, China; 3. School of Biological Science and Biotechnology, Minnan Normal University, Zhangzhou, Fujian 363000, China)

Using Chinese bayberry fruit bagged to control the latent infestation of pathogenic bacteria before harvest as the material, fruit after harvest were vaccinated by, in order to study the effects on the phenolics content and the activities of some related oxidases. The results exhibited that the activities of PPO and POD in the fruit cells of bayberry increased, and phenolics were rapidly generated to improve their disease resistance on early stage ofinfection. At the same time, the PAL activity did not increase correspondingly, but decreased rapidly, resulting in lignin synthesis blocking. It indicated that the infection ofinduced certain disease resistance of the fruits, but it was limited. Although the activity of POD decreased slightly and the activity of PPO remained stable during the middle and late storage stages, they were both always at a high level, leading to the degradation of the phenolic substances accumulated in the early stage. Combined with the blocking of lignin synthesis in the early stage,could penetrate the cell wall and enter into the cell tissue to grow and reproduction, eventually lead to fruit spoilage.

Chinese bayberry;; phenolic metabolism; disease resisitance; defense enzyme

1674-8085(2020)01-0043-05

TS255.3

A

10.3969/j.issn.1674-8085.2020.01.009

2019-11-02；

2019-12-06

福建省科技計劃項目（2018N2002）

*郭 欣(1984-)，女，福建閩侯人，講師，碩士，主要從事農(nóng)產(chǎn)品加工及貯藏研究(E-mail:623849111@qq.com);

郭 萌(1984-)，女，湖北襄陽人，講師，碩士，主要從事食品加工技術(shù)研究(E-mail:8671840@qq.com);

陳 蓮(1979-)，女，福建漳州人，副教授，博士，主要從事農(nóng)產(chǎn)品保鮮研究(E-mail:49471170@qq.com).