李曉麗，林 銳，李繼昌，符 洋

1)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院老年病科；河南省高等學(xué)校臨床醫(yī)學(xué)重點(diǎn)學(xué)科開放實(shí)驗(yàn)室 鄭州 450052 2)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院消化內(nèi)科 鄭州 450052 3)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院胃腸外科 鄭州 450052

環(huán)氧合酶-2(cyclooxygenase-2, COX-2)和誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase, iNOS)為兩種誘生型酶，且兩者啟動子區(qū)域含有核轉(zhuǎn)錄因子-κB(nuclear factor-κB, NF-κB)結(jié)合位點(diǎn)。NF-κB作為一種重要的核轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)節(jié)著多種基因的表達(dá)，并參與炎癥、免疫反應(yīng)、腫瘤發(fā)生等多種生物學(xué)進(jìn)程[1-3]。三者在胃腺癌組織中的表達(dá)及作用如何，目前少有報道。本研究采用免疫組化法對人胃腺癌組織中COX-2、iNOS及NF-κBp65蛋白的表達(dá)情況進(jìn)行檢測，分析三者在胃腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用，現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1標(biāo)本與試劑胃腺癌及其癌旁正常胃黏膜組織標(biāo)本各85例均來源于我院病理科，為2016年3月至2017年12月手術(shù)切除標(biāo)本。85例胃腺癌患者中，男49例，女36例；年齡33～78歲，≤60歲36例，>60歲49例；腫瘤直徑≤5 cm 39例，>5 cm 46例；分化程度：高、中分化52例，低分化33例；浸潤深度：浸潤淺肌層35例，浸潤深肌層50例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況：無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移37例，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移48例。所有患者均無長期服用糖皮質(zhì)激素及非甾體抗炎藥物史，術(shù)前均未行化療或放療，病理證實(shí)均為腺癌。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，受試者均簽署知情同意書。兔抗人COX-2、iNOS多克隆抗體和鼠抗人NF-κBp65單克隆抗體及SABC即用型試劑盒均購于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，DAB顯色試劑購自武漢博士德生物技術(shù)有限公司。

1.2 2種組織中COX-2、iNOS及NF-κBp65蛋白的檢測采用免疫組化SABC法。常規(guī)組織切片脫蠟至水；體積分?jǐn)?shù)3%H2O2封閉內(nèi)源性過氧化物酶15 min；高壓抗原修復(fù)5 min；血清封閉劑封閉非特異性抗原，37 ℃20 min；分別滴加COX-2、iNOS、NF-κBp65一抗，稀釋度分別為1∶200、1∶100、1∶200，4 ℃孵育過夜(>12 h)；滴加生物素標(biāo)記的二抗(按1∶100稀釋)37 ℃30 min；滴加SABC，37 ℃孵育30 min；DAB顯色后自來水沖洗；蘇木精復(fù)染，分化，脫水透明，封片。應(yīng)用PBS代替一抗作為陰性對照，用已知胃癌組織陽性染色切片作為陽性對照。綜合染色強(qiáng)度及陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)對染色結(jié)果進(jìn)行半定量分析[4]。COX-2、iNOS、NF-κBp65蛋白陽性表達(dá)呈棕黃色。高倍鏡下觀察并判定染色強(qiáng)度:無染色為0分,染色弱但明顯強(qiáng)于陰性對照為1分,染色清晰為2分，染色強(qiáng)為3分。每例觀察5個高倍視野，每個視野計(jì)數(shù)100個細(xì)胞，陽性細(xì)胞比例<10%為0分，10%～為1分，25%～為2分，50%～為3分。結(jié)果取兩項(xiàng)評分之和，0～1分為陰性，≥2分為陽性。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 24.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。胃腺癌和癌旁正常胃黏膜組織中COX-2、iNOS與NF-κBp65蛋白表達(dá)情況的比較采用配對資料的χ2檢驗(yàn)；三者在胃腺癌組織中的表達(dá)與臨床病理學(xué)特征的關(guān)系采用χ2檢驗(yàn)進(jìn)行分析，三者間的關(guān)系采用Pearson等級相關(guān)進(jìn)行分析。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1胃腺癌及癌旁正常胃黏膜組織中COX-2、iNOS與NF-κBp65蛋白的表達(dá)情況COX-2主要表達(dá)于胃腺癌細(xì)胞胞質(zhì)和(或)胞膜中，呈彌漫狀分布。iNOS主要表達(dá)于胃腺癌細(xì)胞胞質(zhì)和(或)胞膜中，呈顆粒狀分布。NF-κBp65主要表達(dá)于胃腺癌細(xì)胞胞質(zhì)和(或)胞核中，呈彌漫狀分布。胃腺癌組織中COX-2、iNOS及NF-κBp65蛋白的陽性表達(dá)率均高于癌旁正常胃黏膜組織，見圖1、表1～3。

1：癌旁正常胃黏膜組織(×200)；2：胃腺癌組織(×400)；A:COX-2；B:iNOS;C:NF-κBp65

表1 胃腺癌及癌旁正常胃黏膜組織中COX-2蛋白的表達(dá)情況 例

表2 胃腺癌及癌旁正常胃黏膜組織中iNOS蛋白的表達(dá)情況 例

表3 胃腺癌及癌旁正常胃黏膜組織中NF-κBp65蛋白的表達(dá)情況 例

2.2胃腺癌組織中COX-2、iNOS、NF-κBp65蛋白的表達(dá)與臨床病理學(xué)特征的關(guān)系胃腺癌組織中COX-2、iNOS及NF-κBp65蛋白的表達(dá)與患者的性別、年齡和腫瘤直徑無關(guān)；而三者與胃腺癌的組織浸潤深度和有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，浸潤深肌層組陽性表達(dá)率高于浸潤淺肌層組，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組；COX-2蛋白在高、中分化胃腺癌組表達(dá)高于低分化組，而iNOS及NF-κBp65蛋白表達(dá)與胃腺癌分化程度無關(guān)。見表4。

表4 胃腺癌組織中COX-2、iNOS、NF-κBp65蛋白的表達(dá)與臨床病理學(xué)特征的關(guān)系 例

2.3胃腺癌組織中COX-2、iNOS、NF-κBp65蛋白表達(dá)的關(guān)系COX-2與NF-κBp65表達(dá)呈正相關(guān)(rP=0.359,P<0.001)；iNOS與NF-κBp65表達(dá)呈正相關(guān)(rP=0.405,P<0.001)，見表5。COX-2與iNOS表達(dá)呈正相關(guān)(rP=0.366，P<0.001)，見表6。

表5 胃腺癌組織中COX-2、iNOS與NF-κBp65蛋白表達(dá)的關(guān)系 例

表6 胃腺癌組織中COX-2與iNOS蛋白表達(dá)的關(guān)系 例

3 討論

胃癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率與病死率均較高[5]。早發(fā)現(xiàn)與早診治是降低胃癌病死率的重要措施。因胃癌中95%以上為胃腺癌，故本實(shí)驗(yàn)選取胃腺癌組織進(jìn)行檢測，并初步探討COX-2、iNOS及NF-κBp65與胃腺癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系。

COX是花生四烯酸轉(zhuǎn)化為前列腺素過程中的關(guān)鍵性限速酶。COX 存在兩種同工酶，即COX-1和COX-2，COX-2呈誘導(dǎo)型表達(dá)，當(dāng)出現(xiàn)組織損傷、炎癥或腫瘤時其表達(dá)增強(qiáng)[6-8]。COX-2主要分布在核膜，故其產(chǎn)物更容易進(jìn)入核內(nèi)而調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄，它可被迅速誘導(dǎo)，且誘導(dǎo)生成的COX-2量隨細(xì)胞類型的不同而改變。本研究結(jié)果顯示，COX-2蛋白的陽性表達(dá)主要定位于胃腺癌細(xì)胞的胞質(zhì)和(或)胞膜中，呈彌漫狀分布。胃腺癌組織中COX-2的表達(dá)高于癌旁正常組織，且COX-2蛋白在高中分化、浸潤深肌層及有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃腺癌組織中的陽性表達(dá)率更高。提示COX-2與胃腺癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，且可能為其早期事件，COX-2在分化較好的胃腺癌組織中的異常高表達(dá)可能與其他旁分泌途徑有關(guān)。

一氧化氮(NO)是一種重要的內(nèi)源性調(diào)節(jié)因子，在哺乳動物體內(nèi)由一氧化氮合酶進(jìn)行催化，利用L-精氨酸-NO途徑生成。NO在生物體內(nèi)的功能依據(jù)部位及NOS的種類不同而存在差異，NOS的3種同工酶包括神經(jīng)型一氧化氮合酶、內(nèi)皮型一氧化氮合酶和iNOS。iNOS 在正常生理狀態(tài)不表達(dá),但在病理?xiàng)l件下通過催化NO因子來實(shí)現(xiàn)其病理性生物學(xué)過程，其中iNOS誘導(dǎo)生成的過量NO是其產(chǎn)生病理作用的基礎(chǔ)，且與炎癥及腫瘤形成等密切相關(guān)[9]。另有研究[10]證明,NO既能提高血管內(nèi)皮生長因子的生物學(xué)功能，又能激活COX-2而促進(jìn)前列腺素的生成，這兩種因子又可加速腫瘤新生血管及腫瘤的生長。本研究結(jié)果顯示，iNOS蛋白陽性表達(dá)主要位于胃腺癌細(xì)胞胞質(zhì)和(或)胞膜中，呈顆粒狀分布。胃腺癌組織中iNOS的表達(dá)高于癌旁組織，且浸潤深肌層及有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的表達(dá)更高。提示iNOS通過誘導(dǎo)生成NO而參與胃腺癌早期的形成，同時作為一種重要促侵襲轉(zhuǎn)移因子可加速胃腺癌的進(jìn)展。所以，其對胃腺癌的早期診斷及晚期預(yù)后判斷具有一定的臨床意義。

NF-κB為一種重要的多向性細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄因子，NF-κB被激活后進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)發(fā)揮其重要作用，并參與炎癥、免疫、腫瘤生成等過程。目前，NF-κB靶基因仍不十分清楚，但已知有炎癥性細(xì)胞因子(IL-6、TNF-α等)、趨化因子(IL-8、MCP-1等)、MCH-1、COX-2、iNOS等，它們均為其誘生物，其中COX-2、iNOS是啟動子含有NF-κB結(jié)合位點(diǎn)的兩種誘生酶，而在細(xì)胞核內(nèi)激活的NF-κBp65 又可促進(jìn)COX-2和iNOS的合成[11-12]。本研究結(jié)果顯示，NF-κBp65蛋白的陽性表達(dá)主要定位于胃腺癌細(xì)胞胞質(zhì)和(或)胞核中，呈彌漫狀分布。胃腺癌組織中NF-κBp65蛋白的表達(dá)高于癌旁組織，且浸潤深肌層及有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的更高。另外，COX-2、iNOS與NF-κBp65蛋白在胃腺癌組織中呈高表達(dá)狀態(tài)，且三者間存在正相關(guān)關(guān)系。提示NF-κBp65在刺激因素作用下被激活，從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核內(nèi)，然后與COX-2、iNOS啟動子區(qū)域的NF-κB結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合，啟動COX-2和iNOS基因轉(zhuǎn)錄并促進(jìn)其生成，兩者再通過不同途徑共同參與胃腺癌的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移的全過程。

綜上所述，COX-2、iNOS與NF-κBp65在胃腺癌細(xì)胞中的表達(dá)和分布具有相似性，且COX-2、iNOS與NF-κBp65表達(dá)存在正相關(guān)關(guān)系，COX-2和iNOS的表達(dá)調(diào)控可能與NF-κBp65有關(guān)。COX-2、iNOS與NF-κBp65共同參與了胃腺癌的形成，且與晚期胃腺癌的侵襲、轉(zhuǎn)移有關(guān)，影響預(yù)后。