林永麗,李 艷,雷東春,楊 燦

1)駐馬店市中心醫(yī)院皮膚科 河南駐馬店 463000 2)鄭州市第三人民醫(yī)院腫瘤科 鄭州 450000 3)河南省人民醫(yī)院皮膚科 鄭州 450000

皮膚鱗狀細胞癌是常見的一種惡性腫瘤且具有較高的發(fā)病率及死亡率，目前臨床主要以手術(shù)治療為主，具有一定治療效果，但患者預(yù)后較差[1]。皮膚鱗狀細胞癌發(fā)病機制尚未闡明，因而探究其發(fā)生發(fā)展的分子機制有助于改善患者預(yù)后。miRNA可通過調(diào)控靶基因表達，參與細胞增殖、分化、凋亡等生物學(xué)過程，既往研究[2-4]顯示部分miRNA在皮膚鱗狀細胞癌中異常表達并可調(diào)控腫瘤細胞增殖及凋亡等過程,在皮膚鱗狀細胞癌發(fā)生過程中發(fā)揮重要作用[5-6]。miR-383-5p在乳腺癌、宮頸癌中表達下調(diào)，抑制miR-383-5p表達可促進腫瘤細胞增殖及侵襲[7-8]。生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示驅(qū)動蛋白家族成員3B(kinesin family member 3B，KIF3B)可能是miR-383-5p的靶基因。研究[9]表明KIF3B在大腸癌中高表達并可促進腫瘤進程。本研究首先分析了miR-383-5p與KIF3B在皮膚鱗狀細胞癌細胞系中的表達情況，探究二者之間的靶向關(guān)系，探討miR-383-5p與KIF3B對癌細胞增殖及凋亡的影響，以期為揭示皮膚鱗狀細胞癌發(fā)病機制奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1主要試劑及儀器DMEM、Opti-MEM減血清培養(yǎng)基購自美國Gibco公司,胎牛血清、lipofectamine2000、胰蛋白酶購自美國Thermo Fisher公司；RIPA裂解液購自北京全式金生物技術(shù)有限公司，Trizol購自美國Invitrogen公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量PCR試劑盒購自北京天根生化科技有限公司。miR-383-5p模擬物(miR-383-5p mimics)及其陰性對照(miR-NC)、KIF3B小干擾RNA(si-KIF3B)購自廣州銳博生物科技有限公司。pcDNA3.1購自上海遠慕生物科技有限公司。MTT購自美國RD公司，Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒購自美國Sigma公司。兔抗人KIF3B抗體購自美國CST公司，抗人細胞周期蛋白1(Cyclin D1)、活化的Caspase-3(Cleaved-Caspase-3)抗體購自美國Santa Cruz公司， HRP標記的山羊抗兔二抗購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.2細胞來源及培養(yǎng)人正常皮膚細胞株HaCaT,皮膚鱗狀細胞癌細胞SCC13、A431、HSC-5購自美國ATCC細胞庫，用含體積分數(shù)10%胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，于37 ℃、體積分數(shù)5%CO2條件下培養(yǎng)，待細胞生長融合度達到70%時進行傳代培養(yǎng)。

1.3HaCaT、SCC13、A431和HSC-5細胞中miR-383-5p和KIF3B表達的檢測

1.3.1 miR-383-5p和KIF3B mRNA的檢測 采用qRT-PCR法檢測細胞中miR-383-5p、KIF3B mRNA表達水平。miR-383-5p正向引物5’-AAGGTGATT GTGGCTTTGGG-3’，反向引物5’-ACGACTCA CAGCTAGCTACC-3’。KIF3B正向引物5’-TGAAATCGCCTCCACCTTCT-3’，反向引物5’-CAGGGCAGAAAAGGGAGGTA-3’。U6正向引物5’-GCTTCGGCAGCACATATACT-3’，反向引物5’-GTGCAGGGTCCGAGGTATTC-3’。β-actin正向引物5’-TGCTGTCCCTGTATGCCTCT-3’，反向引物5’-TGATGTCACGCACGATTTC-3’。引物由上海生工生物工程股份有限公司設(shè)計合成。PCR反應(yīng)體系：10×Buffer 2.5 μL，MgSO42.5 μL，dNTPs 2.5 μL，正、反向引物各0.5 μL，cDNA 2 μL，用無RNase的ddH2O補足體系至25 μL。反應(yīng)條件：95 ℃ 60 s；95 ℃ 60 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共36次循環(huán)。miR-383-5p以U6為內(nèi)參，KIF3B以β-actin為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計算目的mRNA相對表達量。

1.3.2 KIF3B蛋白的檢測 采用Western blot法檢測。收集細胞，加入適量RIPA裂解液，冰上裂解30 min，離心后提取細胞總蛋白，采用BCA法測定蛋白濃度。取蛋白樣品進行SDS-PAGE，轉(zhuǎn)膜，50 g/L脫脂奶粉封閉2 h，加一抗稀釋液(1∶1 000)4 ℃孵育過夜，TBST洗滌，加二抗稀釋液(1∶2 000)室溫條件下孵育1 h，暗室內(nèi)曝光顯影。應(yīng)用凝膠成像分析系統(tǒng)及Image J分析條帶灰度值。以目的條帶與內(nèi)參β-actin條帶灰度值的比值表示目的蛋白的表達水平。

1.4SCC13細胞的轉(zhuǎn)染取對數(shù)生長期的SCC13細胞，2.5 g/L胰蛋白酶消化，制備細胞懸液，調(diào)整細胞密度為1×104個/mL，接種于6孔板(200 μL/孔)，待細胞生長融合度達到70%時更換培養(yǎng)基為Opti-MEM減血清培養(yǎng)基。按照lipofectamine2000說明書分別將miR-NC、miR-383-5p mimics、anti-miR-NC、anti-miR-383-5p、si-KIF3B、miR-383-5p mimics+pcDNA-NC、miR-383-5p mimics+pcDNA-KIF3B轉(zhuǎn)染至SCC13細胞中。轉(zhuǎn)染6 h后更換為含體積分數(shù)10%胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h。收集對數(shù)期細胞進行后續(xù)研究。

1.5miR-383-5p與KIF3B靶向關(guān)系的預(yù)測和驗證采用Starbase預(yù)測miR-383-5p與KIF3B的靶向關(guān)系，并應(yīng)用雙熒光素酶報告實驗驗證。分別將含有結(jié)合位點與突變位點的KIF3B-3’UTR插入熒光素酶報告基因載體，構(gòu)建載體WT-KIF3B與MUT-KIF3B。利用lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑分別將WT-KIF3B或MUT-KIF3B與miR-NC或miR-383-5p mimics共轉(zhuǎn)染至SCC13細胞，轉(zhuǎn)染48 h后檢測細胞中熒光素酶活性。

1.6過表達miR-383-5p的SCC13細胞增殖、克隆形成和凋亡能力的變化

1.6.1 實驗分組 收集miR-383-5p組、miR-NC組細胞，qRT-PCR法檢測細胞中miR-383-5p的表達，方法同1.3.1。以未轉(zhuǎn)染細胞作為空白對照。

1.6.2 細胞增殖率的檢測 取3組細胞接種至96孔板，每組3個復(fù)孔，用含體積分數(shù)10%胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h后，每孔加入MTT溶液20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄上清，每孔加入150 μL DMSO，室溫避光振蕩孵育10 min，應(yīng)用酶標儀檢測490 nm處的吸光度值。細胞增殖率=實驗組吸光度/空白孔吸光度×100%。實驗重復(fù)3次。

1.6.3 平板克隆形成實驗 將3組細胞接種于48孔板(100 μL/孔)，每組3個復(fù)孔，培養(yǎng)36 h后收集細胞，PBS洗滌，加入含體積分數(shù)10%胎牛血清且不含抗生素的培養(yǎng)液。調(diào)整細胞密度為3×104個/mL，接種于12孔板(100個/孔)，置于37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每3 d更換一次培養(yǎng)液，共培養(yǎng)2周。計數(shù)肉眼可見的克隆數(shù)。

1.6.4 細胞凋亡率的檢測 收集3組細胞，1 000 r/min離心6 min，預(yù)冷PBS洗滌，加入500 μL結(jié)合緩沖液重懸細胞，加入5 μL Annexin V-FITC與5 μL PI，室溫振蕩孵育10 min，上流式細胞儀檢測，應(yīng)用Cellauest軟件計算細胞凋亡率。

1.6.5 Cyclin D1、Cleaved-Caspase-3蛋白的檢測 采用Western blot法檢測，方法同前。

1.7抑制KIF3B表達后SCC13細胞增殖、克隆形成和凋亡能力的變化收集未轉(zhuǎn)染組、si-KIF3B組細胞，Western blot法檢測KIF3B、Cyclin D1、Cleaved-Caspase-3蛋白的表達；按1.6方法檢測細胞增殖率、克隆形成能力和凋亡率。

1.8過表達KIF3B和miR-383-5p后SCC13細胞增殖、克隆形成和凋亡能力的變化收集miR-383-5p+pcDNA-NC組、miR-383-5p+pcDNA-KIF3B組細胞，Western blot法檢測KIF3B、Cyclin D1、Cleaved-Caspase-3蛋白的表達；按1.6方法檢測細胞增殖率、克隆形成能力和凋亡率。

1.9統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS21.0分析數(shù)據(jù)。多組細胞中miR-383-5p和KIF3B表達水平，細胞增殖、克隆形成和凋亡能力，Cyclin D1和Cleaved-Caspase-3蛋白表達水平的比較采用單因素方差分析和SNK-q檢驗，或兩獨立樣本的t檢驗；熒光素酶活性的比較采用兩獨立樣本的t檢驗；檢驗水準α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 4種皮膚細胞中miR-383-5p和KIF3B 表達的比較見圖1、表1。與HaCaT細胞相比，SCC13、A431、HSC-5中miR-383-5p表達水平降低，KIF3B mRNA及蛋白表達水平升高(P<0.05)。SCC13細胞中miR-383-5p的表達水平最低，因而選用SCC13進行后續(xù)研究。

圖1 4種細胞中KIF3B蛋白的表達

表1 4種細胞中miR-383-5p和KIF3B 表達的比較

*：與HaCaT比較，P<0.05

2.2miR-383-5p與KIF3B靶向關(guān)系的驗證Starbase預(yù)測結(jié)果顯示miR-383-5p與KIF3B存在結(jié)合位點，見圖2。雙熒光素酶報告實驗結(jié)果(表2)顯示， WT-KIF3B和miR-383-5p共轉(zhuǎn)染組細胞熒光素酶活性低于WT-KIF3B和miR-NC共轉(zhuǎn)染組(P<0.05)； MUT-KIF3B和miR-383-5p共轉(zhuǎn)染組與MUT-KIF3B和miR-NC共轉(zhuǎn)染組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

2.3過表達miR-383-5p對SCC13細胞增殖、克隆形成能力和凋亡的影響指標檢測結(jié)果見表3。與未轉(zhuǎn)染組和miR-NC組相比，miR-383-5p組細胞增殖率和克隆形成數(shù)降低，細胞凋亡率升高，Cyclin D1表達水平降低，Cleaved-Caspase-3表達水平升高(P<0.05)。

圖2 miR-383-5p與KIF3B 結(jié)合位點示意圖

表2 雙熒光素酶報告實驗結(jié)果(n=9)

表3 未轉(zhuǎn)染組、miR-NC和miR-383-5p組細胞增殖、克隆形成和凋亡檢測結(jié)果(n=9)

*：與空白組和miR-NC組比較，P<0.05

2.4抑制KIF3B對SCC13細胞增殖、克隆形成能力和凋亡的影響指標檢測結(jié)果見表4。與未轉(zhuǎn)染組相比，si-KIF3B組細胞增殖率、克隆形成數(shù)降低，細胞凋亡率升高，Cyclin D1蛋白表達水平降低，Cleaved-Caspase-3蛋白表達水平升高(P<0.05)。

表4 未轉(zhuǎn)染組、si-KIF3B組細胞增殖、克隆形成和凋亡檢測結(jié)果(n=9)

2.5過表達KIF3B和miR-383-5p對SCC13細胞增殖、克隆形成能力和凋亡的影響指標檢測結(jié)果見表5。與miR-383-5p+pcDNA-NC組比較，miR-383-5p+pcDNA-KIF3B 細胞增殖率、克隆形成數(shù)、Cyclin D1蛋白表達水平增加，細胞凋亡率、Cleaved-Caspase-3蛋白表達水平降低(P<0.05)。

表5 miR-383-5p+pcDNA-NC組和miR-383-5p+pcDNA-KIF3B組細胞增殖、克隆形成和凋亡檢測結(jié)果(n=9)

3 討論

研究[10]表明miR-383-5p在胃癌細胞中表達下調(diào)，其低表達可促進胃癌細胞的增殖及遷移。miR-383-5p表達降低還可通過靶向MAL2促進口腔鱗狀細胞癌的發(fā)展[11]。miR-383-5p過表達可通過靶向TRIM27抑制卵巢癌細胞的增殖[12]。本研究通過熒光素酶報告實驗證實KIF3B與miR-383-5p存在靶向關(guān)系。KIF3B在胰腺癌、肝細胞癌、前列腺癌中表達上調(diào)，抑制KIF3B表達可抑制腫瘤細胞的增殖及轉(zhuǎn)移[13-15]。

Cyclin D1可正向調(diào)控細胞周期，促進細胞周期由G1期進入S期，促進細胞增殖[16]。Caspase-3在細胞凋亡過程中發(fā)揮重要調(diào)控作用，其級聯(lián)反應(yīng)被激活后，Cleaved-Caspase-3表達升高，反映細胞凋亡增加[17]。本研究發(fā)現(xiàn)，皮膚鱗狀細胞癌細胞中miR-383-5p表達下調(diào)，KIF3B表達上調(diào)；miR-383-5p過表達后皮膚鱗狀細胞癌SCC13細胞增殖率和克隆形成能力降低，凋亡率增加，同時Cyclin D1表達降低，Cleaved-Caspase-3表達增強；抑制KIF3B表達后SCC13細胞增殖能力減弱，細胞凋亡率升高，Cyclin D1表達降低，Cleaved-Caspase-3表達升高；進一步分析顯示KIF3B過表達可逆轉(zhuǎn)miR-383-5p過表達對SCC13細胞增殖、克隆形成及凋亡的影響。本研究結(jié)果提示，miR-383-5p在皮膚鱗狀細胞癌中可能發(fā)揮抑癌基因的作用，而KIF3B可能發(fā)揮癌基因作用，miR-383-5p可能通過靶向KIF3B，下調(diào)Cyclin D1表達，從而誘導(dǎo)SCC13細胞凋亡，抑制其增殖。

綜上所述，皮膚鱗狀細胞癌細胞中miR-383-5p表達下調(diào)，KIF3B表達上調(diào)，miR-383-5p可靶向干擾KIF3B表達，發(fā)揮抗皮膚鱗狀細胞癌增殖的作用，miR-383-5p可能成為皮膚鱗狀細胞癌靶向治療的潛在靶點。