姚 靜，夏丹豪，楊凌飛，孫亞娟，劉 晗，滕軍放

1)鄭州大學第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 鄭州 450052 2)河南省高等學校臨床醫(yī)學重點學科開放實驗室 鄭州 450052

脊髓小腦共濟失調(diào)3型(spinocerebellar ataxia type 3, SCA3)是一種常見的常染色體顯性遺傳性疾病，是多聚谷氨酰胺病之一,臨床普遍表現(xiàn)為進行性小腦共濟失調(diào)[1]。遺傳學研究[2-4]顯示SCA3患者突變基因位于14號染色體，稱為MJD1基因，該基因中的CAG三核苷酸重復片段擴展,使得其編碼的Ataxin-3蛋白突變并出現(xiàn)功能異常。神經(jīng)病理研究[5-6]顯示SCA3患者氨基丁酸能神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)存在神經(jīng)元丟失，齒狀核存在γ-氨基丁酸(γ-amino-butylic acid, GABA)A受體丟失。目前，SCA3的發(fā)病機制尚未完全明確。有學者[7]提出谷氨酸(glutamate，Glu)在SCA3中起興奮性毒性作用，但是目前尚無相關神經(jīng)遞質(zhì)的定量研究。本研究應用超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法檢測了SCA3患者腦脊液及血漿中神經(jīng)遞質(zhì)GABA和Glu的水平，評估其在SCA3疾病發(fā)生中的作用，探索SCA3潛在的治療策略。

1 對象與方法

1.1研究對象募集2017年1月至2019年8月在鄭州大學第一附屬醫(yī)院就診、符合Harding診斷標準[8]，且經(jīng)基因檢測明確診斷的SCA3患者24例(SCA3組)，男9例，女15例，年齡28～62(45.8±10.9)歲，CAG重復次數(shù)60～80。所有入組患者均進行國際共濟失調(diào)評定量表(International Cooperative Ataxia Rating Scale, ICARS)評分[9-10]。同時進行詳細問診以獲取相關病史、家族史信息。

正常對照組9例，男3例，女6例，年齡37～64(51.3±8.2)歲，為同期來我院體檢的健康志愿者，無神經(jīng)系統(tǒng)、精神系統(tǒng)異常癥狀及退行性疾病家族史。本研究獲我院倫理委員會批準。

1.2血漿及腦脊液中GABA、Glu水平檢測SCA3組患者治療前晨起空腹取血3 mL，肝素抗凝，靜置1～2 h，4 ℃、3 000 r/min離心15 min，取上清。正常對照組空腹取血，同上處理。腰椎穿刺由神經(jīng)內(nèi)科醫(yī)師操作，術前均告知具體操作及注意事項，并簽署腰椎穿刺知情同意書。抽取腦脊液1 mL，迅速放入液氮冷凍儲存。采用蛋白沉淀法處理樣品。將冷凍的樣品融化取100 μL，并與體積分數(shù)75%乙腈、體積分數(shù)25%甲醇混合。將該混合物在4 ℃下放置20 min，13 000 r/min離心10 min，取上清，待測。采用超高效液相色譜儀三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜儀(沃特世公司)批量測定血漿及腦脊液中GABA、Glu水平。

1.3統(tǒng)計學處理使用GraphPad Prism 8進行統(tǒng)計分析。采用兩獨立樣本t檢驗比較2組間血漿及腦脊液中GABA、Glu水平的差異，使用Pearson相關分析判別SCA3組血漿及腦脊液中GABA、Glu水平與年齡、CAG重復數(shù)及ICARS評分的關系。檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 2組腦脊液及血漿中GABA、Glu水平比較與正常對照組比較，SCA3組腦脊液與血漿中GABA水平較低,Glu水平較高，見表1。

表1 2組腦脊液及血漿中GABA、Glu水平比較 μg/L

2.2SCA3患者腦脊液和血漿中GABA、Glu水平與年齡、CAG重復數(shù)及ICARS評分的關系結果見表2。SCA3組CAG重復數(shù)為(70.17±5.89)，ICARS評分為(39.1±8.9)。由表2可知，SCA3患者腦脊液中GABA水平與ICARS評分呈負相關，腦脊液和血漿中Glu水平均與CAG重復數(shù)呈正相關(P<0.05)。

表2 SCA3患者腦脊液和血漿神經(jīng)遞質(zhì)水平與臨床有關因素的相關系數(shù)

*：P<0.05

3 討論

SCA3突變基因MJD1(染色體14.q32.12;OMIM 109150)基因產(chǎn)物為異常延長的聚谷氨酰胺，過長的聚谷氨酰胺可致Ataxin-3錯誤折疊，含有錯誤折疊Ataxin-3神經(jīng)元的包涵體是SCA3的病理標志物[7]。遺傳學及動物研究[11]表明錯誤折疊的Ataxin-3或其蛋白水解片段對神經(jīng)纖維蛋白有毒性作用，從而引起病變。SCA3患者的黑質(zhì)和小腦齒狀核受損，腦干中運動核的病變可引起眼球運動和舌無力的復雜紊亂，腦橋萎縮常見，并且在腦橋灰質(zhì)中最容易發(fā)現(xiàn)聚谷氨酰胺陽性神經(jīng)元核內(nèi)包涵體；也可見多變的基底神經(jīng)節(jié)、丘腦、脊髓、背根神經(jīng)節(jié)和感覺周圍神經(jīng)的異常[6]。雖然過長的聚谷氨酰胺延伸導致的Ataxin-3錯誤折疊是SCA3發(fā)病的關鍵因素，但是，該包涵體的存在與組織破壞程度并無明顯直接關系，該疾病神經(jīng)病理學的復雜性仍然在很大程度上無法解釋。

GABA是一種主要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，其可以激動GABAA、GABAB和GABAC受體。病理學研究[5-6]顯示SCA3患者氨基丁酸能神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)有神經(jīng)元丟失和GABAA受體丟失。SCA3患者小腦齒狀核、小腦上腳、小腦中腳存在萎縮改變，其中浦肯野細胞萎縮明顯，其神經(jīng)元周圍有葡萄狀簇形成，且免疫組化證據(jù)支持GABA能突觸末端呈增殖改變[6,12]，可能為代償性增殖。此外，有研究[13]顯示應用GABA轉運體抑制劑可導致癲癇患者出現(xiàn)共濟失調(diào)，小腦中GABA能神經(jīng)元的消融也會導致共濟失調(diào)。本研究結果顯示，SCA3患者血漿及腦脊液中GABA水平較正常對照低，表明SCA3患者共濟失調(diào)的部分原因可能是GABA水平下降。

Glu是人腦內(nèi)最豐富的游離氨基酸并參與多種代謝途徑，其對神經(jīng)細胞具有興奮作用，是哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)中主要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)。它可作用于腦細胞表面存在的谷氨酸受體，激發(fā)細胞死亡。但是正常情況下，體內(nèi)強大的攝取系統(tǒng)(谷氨酸轉運蛋白)可通過從大腦細胞外液中連續(xù)去除谷氨酸，防止這些受體的過度活化[14]。進一步研究[7]顯示，Glu左旋體可誘導Ataxin-3形成難溶性聚集體，進一步導致相關病理改變。本研究結果顯示，SCA3患者血漿及腦脊液中Glu水平較正常對照高，為Glu的興奮性毒性作用提供了證據(jù)。

ICARS是對姿勢和姿勢障礙、肢體共濟失調(diào)、構音障礙以及動眼障礙的定量評估，該量表可評估SCA3病情的嚴重程度[10]。本研究發(fā)現(xiàn)SCA3患者腦脊液中GABA水平與ICARS評分呈負相關，表明SCA3患者腦脊液中GABA水平可反映患者共濟失調(diào)嚴重程度。此外，本研究中SCA3患者腦脊液與血漿中Glu水平與CAG重復數(shù)呈正相關，推測CAG重復長度可在一定程度上影響患者體內(nèi)Glu的水平。

綜上所述，SCA3患者腦脊液及血漿中GABA水平降低，Glu水平升高；腦脊液中GABA可反映SCA3患者病情嚴重程度。提高患者體內(nèi)GABA或者降低Glu水平或可能作為SCA3治療的研究方向。限于本研究樣本量較小，GABA和Glu水平改變及其臨床意義有待擴大樣本量進一步研究。