王 偉，謝宵靚，姜國忠，燕迪迪，夏培苡，李文才，王麗萍

1)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院腫瘤科 鄭州 450052 2)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科 鄭州 450052

肺癌是全世界發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤，2018年全世界肺癌新發(fā)病例210萬，死亡病例180萬[1]。在中國，肺癌在惡性腫瘤中發(fā)病率及死亡率均居第一[2]。非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung carcinoma, NSCLC)占肺癌總發(fā)病數(shù)的87%，是最常見的肺癌亞型[3]。

依據(jù)NCCN治療指南[4]，晚期NSCLC患者推薦采取以全身治療為主的綜合治療。在NSCLC分子靶向治療中，手術(shù)或穿刺組織癌基因突變的檢測仍是“金標(biāo)準(zhǔn)”[5]。驅(qū)動(dòng)基因是與腫瘤發(fā)生發(fā)展相關(guān)的重要基因，驅(qū)動(dòng)基因的突變直接“驅(qū)動(dòng)”腫瘤細(xì)胞。NSCLC常見驅(qū)動(dòng)基因包括人表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)、間變性淋巴瘤激酶(anaplastic lymphoma kinase,ALK)、鼠類肉瘤病毒致癌基因(kirsten rat sarcoma viral oncogene,KRAS)、磷脂酰肌醇激酶-3催化亞基α(phosphatidylinositol 3-kinase catalytic subunit α,PIK3CA)、間質(zhì)上皮轉(zhuǎn)化因子(mesenchymal to epithelial transition factor,MET)等。由于腫瘤異質(zhì)性很強(qiáng)[6]，不同腫瘤位點(diǎn)，甚至同一腫瘤位點(diǎn)不同腫瘤細(xì)胞的變異情況都可能不同[7]，單一病灶的基因檢測結(jié)果不能反映體內(nèi)腫瘤的整體特征。循環(huán)腫瘤DNA(circulating tumor DNA, ctDNA)是釋放入血的凋亡腫瘤細(xì)胞攜帶的腫瘤特異性基因，能夠全面反映腫瘤組織的分子組成。Lebofsky等[8]在27例腫瘤匹配樣品中證實(shí)29個(gè)突變中的28個(gè)可以在ctDNA中發(fā)現(xiàn)。EGFR酪氨酸激酶抑制劑(EGFR-tyrosine kinase inhibitors, EGFR-TKIs)如吉非替尼可以顯著提高NSCLC患者的客觀緩解率(objective response rate, ORR)和無進(jìn)展生存期(progress free survival, PFS)[9-10]。攜帶EGFR敏感突變的NSCLC患者對(duì)EGFR-TKIs治療反應(yīng)較好，但大部分患者在接受治療后9～13個(gè)月產(chǎn)生耐藥[11]。隨著新的靶向藥物的產(chǎn)生和對(duì)耐藥機(jī)制的深入研究，需要更全面地了解患者癌基因的組成信息，以指導(dǎo)治療和評(píng)估療效。本研究分析了晚期NSCLC患者外周血中與治療相關(guān)的多種驅(qū)動(dòng)基因及抑癌基因TP53的檢測結(jié)果，探索基因突變狀態(tài)及主要突變驅(qū)動(dòng)基因ctDNA濃度與臨床病理指標(biāo)的關(guān)系，為晚期NSCLC的治療提供依據(jù)。

1 對(duì)象與方法

1.1研究對(duì)象對(duì)于2018年6月至2018年12月鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院收治的NSCLC患者，根據(jù)納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)病理或細(xì)胞學(xué)確診為NSCLC，多次治療后進(jìn)展。②EGFR、ALK等基因突變，靶向治療反應(yīng)性差。③預(yù)期壽命至少為3個(gè)月。④臨床分期Ⅲ～Ⅳ期，或同時(shí)經(jīng)影像學(xué)、病史、檢驗(yàn)等綜合評(píng)估后考慮為晚期肺癌，并排除患有其他惡性腫瘤的患者，共納入96例。96例中男51例，女45例；≤60歲47例，>60歲49例；23例有吸煙史，67例無吸煙史，6例吸煙史不詳；腺癌70例，鱗狀細(xì)胞癌(簡稱鱗癌)13例，其他(包括腺鱗癌、腺癌伴神經(jīng)內(nèi)分泌、未知等)13例；ⅢA期4例，ⅢB期15例，ⅢC期15例，Ⅳ期56例，不確定6例；ECOG評(píng)分1～2分35例，3～4分55例，不確定6例?；仡櫺苑治龌颊咄庵苎幕驒z測結(jié)果。研究經(jīng)我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者或家屬均知情同意。

1.2外周血基因檢測抽取患者外周血10 mL，離心取血漿。參照QIAamp循環(huán)核酸試劑盒(凱杰生物技術(shù)有限公司)提取血漿游離DNA，采用cSMART技術(shù)[12]對(duì)EGFR、KRAS、ALK、RET、ROS1、ERBB2、BRAF、PIK3CA、MET和TP53共10種基因的常見變異進(jìn)行檢測，并檢測上述基因ctDNA的濃度。所有實(shí)驗(yàn)在我院與福建和瑞基因科技有限公司的共建實(shí)驗(yàn)室內(nèi)完成。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理使用SPSS 22.0處理數(shù)據(jù)。采用χ2檢驗(yàn)、Fisher確切概率法或兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)比較不同臨床病理特征的患者熱點(diǎn)基因突變檢出率以及EGFR ctDNA濃度的差異，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1NSCLC外周血熱點(diǎn)基因突變的檢出情況所有患者基因突變的檢出情況見圖1。96例患者中有64例檢出基因突變，占所有檢測樣本的66.7%，其中65.6%(42/64)突變發(fā)生在單個(gè)基因，其余34.4%(22/64)有2個(gè)基因以上發(fā)生突變。

57.1%(44/77)腺癌/腺癌伴神經(jīng)內(nèi)分泌癌和46.2%(6/13)鱗癌檢測到熱點(diǎn)基因突變，但兩者相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.544，P=0.461)。76.5%(26/34)Ⅲ期患者和92.9%(52/56)Ⅳ期患者檢測到熱點(diǎn)基因突變，但兩者相比，差異亦無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=3.600，P=0.058)。

在檢測的10個(gè)基因中，EGFR突變檢出率最高，達(dá)44.8%(43/96)，其后依次是TP53、KRAS和PIK3CA，分別是14.6%(14/96)、10.4%(10/96)和9.4%(9/96)。MET基因14外顯子跳躍突變檢出4(4.2%)例，并且該突變獨(dú)立于EGFR突變存在。ALK檢出2例突變和1例EMLA4-ALK融合，占3.1%(3/96)。ERBB2突變檢出2(2.0%)例，均為20號(hào)外顯子A775_G776insYVMA。ROS1檢出1(1.0%)例SLC34A2-ROS1融合。BRAF和RET基因突變未檢測出。

圖1 所有NSCLC患者外周血熱點(diǎn)基因突變的檢測結(jié)果

2.2不同臨床病理特征患者EGFR、KRAS、TP53和PIK3CA突變檢出率的比較結(jié)果見表1，可知不同年齡、性別，有無吸煙史，不同病理分型及分期，不同ECOG評(píng)分的NSCLC患者EGFR、KRAS、TP53、PIK3CA突變檢出率差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 EGFR、KRAS、TP53和PIK3CA突變檢出率與NSCLC患者臨床病理指標(biāo)的關(guān)系 例(%)

*：病例數(shù)有缺失；△：校正χ2檢驗(yàn)；#：確切概率

2.3EGFR基因突變患者藥敏情況分析43例EGFR突變患者中，E19del檢出率[58.1%(25/43)]最高，其次是T790M、L858R、L861Q、G719A和C797S，檢出率分別為39.5%(17/43)、34.9%(15/43)、7.0%(3/43)、4.7%(2/43)和2.3%(1/43)。除了1例為單獨(dú)突變之外，94.1%(16/17)T790M突變者同時(shí)檢出E19del和(或)L858R突變。

43例EGFR突變的患者中，28(65.1%)例只檢出EGFR突變，其中19例為單突變，9例有雙重或三重突變。雙重或三重突變中，L858R合并E19del 2例，E19del合并T790M 4例，L858R合并T790M 1例，L858R、19del和T790M 1例，19del、T790M和C797S 1例。除攜帶C797S的患者外，其他突變類型患者均對(duì)EGFR-TKIs治療敏感。

43例EGFR突變患者中，還有15(34.9%)例為EGFR合并其他熱點(diǎn)基因突變，其中合并KRAS突變2例，合并PIK3CA突變6例，此類突變對(duì)EGFR-TKIs治療耐藥。EGFR合并TP53突變7例，此類患者對(duì)EGFR-TKIs治療的反應(yīng)時(shí)間較短，會(huì)在短時(shí)間內(nèi)出現(xiàn)耐藥。

2.4不同臨床病理特征患者外周血中EGFR ctDNA濃度的比較≤60歲年齡組外周血中EGFR ctDNA濃度高于>60歲年齡組，見表2。

表2 不同臨床病理特征患者外周血中EGFR ctDNA濃度的比較

*：病例數(shù)有缺失

3 討論

肺癌是我國發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤，它在基因組成上具有很高的異質(zhì)性[13]。隨著臨床靶向治療的開展，除一小部分患者本身就存在原發(fā)耐藥，絕大多數(shù)患者在靶向藥物治療過程中都會(huì)不可避免地出現(xiàn)耐藥。

研究[14]顯示，不同分期的NSCLC患者外周血中ctDNA濃度不同，分期越高，ctDNA濃度越高，熱點(diǎn)基因突變的檢出率越高。本研究發(fā)現(xiàn)，Ⅲ期和Ⅳ期NSCLC患者熱點(diǎn)基因突變率分別為76.5%和92.9%，與文獻(xiàn)[15]報(bào)道的Ⅳ期NSCLC的外周血中熱點(diǎn)基因突變率88%基本相符。

EGFR是一種跨膜酪氨酸激酶受體，參與細(xì)胞的凋亡、增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移[16]。著名的PIONEER試驗(yàn)[17]結(jié)果顯示亞裔肺腺癌患者EGFR突變率為51.4%。另外，眾多研究發(fā)現(xiàn)，性別、吸煙與否、組織學(xué)類型與EGFR突變頻率相關(guān)[17]，并且EGFR突變?cè)诓晃鼰煹呐曰颊咧懈Ｒ奫18]。本研究未觀察到EGFR、KRAS、TP53和PIK3CA基因突變與性別、吸煙與否、組織學(xué)分型等病理指標(biāo)的關(guān)系，這可能與入組的多為晚期患者，治療史可能比較復(fù)雜，而且腫瘤本身存在較高的異質(zhì)性有關(guān)。

研究[19]顯示，一代EGFR-TKIs的耐藥約50%是由EGFR基因T790M突變引起。另有研究[20]顯示，從未接受過EGFR-TKIs治療的患者中，大約1.38%可檢出EGFR基因T790M突變，約2.45%可檢出PIK3CA基因E545K突變，為原發(fā)耐藥突變。在本研究中，所檢測到的EGFR突變患者中有39.5%為T790M突變，而且此類患者同時(shí)存在其他EGFR突變，因此可以認(rèn)為T790M是既往治療誘導(dǎo)的耐藥突變。

KRAS突變也是常見的EGFR-TKIs耐藥機(jī)制，單純EGFR突變患者總生存期34個(gè)月，而KRAS突變患者只有16個(gè)月[21]。PIK3CA突變發(fā)生在EGFR-TKIs治療后耐藥或無使用EGFR-TKIs指征的患者中[22]。據(jù)報(bào)道，10%～26%未吸煙的NSCLC患者存在TP53突變，TP53突變會(huì)降低患者對(duì)EGFR-TKIs治療的反應(yīng)時(shí)間[23]。另外，MET擴(kuò)增或MET基因14號(hào)外顯子跳躍突變、HER2擴(kuò)增與突變、ROS1融合和ALK融合均是導(dǎo)致EGFR-TKIs耐藥的機(jī)制[19，24-25]。本研究中，所檢測到的EGFR突變患者中有34.9%伴隨其他基因突變，如KRAS、TP53等，而這種共突變與EGFR存在交互作用，與EGFR-TKIs耐藥的發(fā)生有關(guān)。

此外，本研究結(jié)果還顯示≤60歲年齡組EGFR ctDNA濃度高于>60歲年齡組，提示年輕患者腫瘤組織中攜帶EGFR突變的腫瘤細(xì)胞多，腫瘤惡性程度高，這與年輕肺癌患者較老年患者進(jìn)展更快相符。

綜上所述，晚期NSCLC患者EGFR敏感突變合并耐藥突變同時(shí)存在的比例較高，采取NSCLC相關(guān)的多基因聯(lián)合液體活檢，才能從整體上把握NSCLC患者的基因組成，找到最佳的治療方案。