謝麗源,許瀛引,彭衛(wèi)紅,甘炳成

(四川農(nóng)業(yè)科學院土壤肥料研究所，四川 成都， 610066)

羊肚菌(Morchellaspp.)，隸屬子囊菌門(Ascomycota)、盤菌綱(Pezizomycetes)、羊肚菌科(Morchellaceae)，羊肚菌屬(Morchella)[1]，是一種珍稀名貴食(藥)用菌，由于其菌蓋表面有不規(guī)則多面凹陷皺褶似羊肚而得名。羊肚菌味道鮮美、營養(yǎng)豐富，含有多糖、生物酶類、鈣、鋅、鐵等多種礦物質[2-3]，具有調(diào)節(jié)機體免疫力、抗疲勞、抑制腫瘤、抗菌、抗病毒、降血脂、抗氧化等多種功效[4-12]。隨著羊肚菌馴化栽培技術的日趨成熟，羊肚菌種植區(qū)域越來越廣，而不同的生態(tài)條件、種植方式，以及不同的基因型品種等都是影響羊肚菌揮發(fā)性香氣成分的關鍵因素[13]，不同生態(tài)條件對揮發(fā)性香氣物質的影響在食用菌尤其羊肚菌中研究甚少。本研究采用頂空固相微萃取(headspace solid-phase microextraction,HS-SPME)-氣相色譜-質譜(gas chromatography-mass spectrometry,GC-MS)的方法檢測同一遺傳背景、相同配套栽培方式，在四川不同生態(tài)環(huán)境馴化栽培的羊肚菌樣品，分析不同產(chǎn)地羊肚菌揮發(fā)性物質組成種類和含量，并通過主成分分析和聚類分析表征生態(tài)環(huán)境對羊肚菌揮發(fā)性物質差異，旨在為不同產(chǎn)區(qū)樣品的辨別和評價提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

分別采集不同生態(tài)環(huán)境、相同遺傳背景以及相同栽培基質和培養(yǎng)條件的馴化栽培羊肚菌，來源如表1所示。羊肚菌采集后經(jīng)過挑選、烘干，粉碎后密封待用。

表1 樣品來源

1.2 儀器與設備

7890-5975氣相色譜-質譜聯(lián)用儀(GC-MS)，配有電子轟擊電離源(EI),美國Agilent公司；65 μmPDMS/DVB萃取纖維頭,美國Supelco公司；Teledyne Tekmar Atomx動態(tài)頂空自動進樣器,美國。

1.3 實驗方法

1.3.1 頂空固相微萃取

將粉碎后的樣品混合均勻，稱取2.00 g試樣放置在10 mL樣品瓶中，加入1.5 g NaCl和6 mL經(jīng)過煮沸冷卻的蒸餾水，搖勻，然后將溶液置于15 mL頂空瓶中，將老化后的萃取頭插入樣品瓶頂空部分，于50 ℃吸附30 min，吸附后的萃取頭取出后插入氣相色譜進樣口，于250 ℃解吸3 min，用于GC-MS分析檢測。

1.3.2 GC-MS條件

色譜柱DB-WAX 60 m×0.25 mm×0.50 μm；載氣為高純氦氣；載氣流速(恒流模式)1.0 mL/min；進樣口溫度230 ℃；進樣方式為分流進樣；分流比10 ∶1；升溫程序為35 ℃，以5 ℃/min速率升溫至220℃，保持10 min；離子源溫度230 ℃；掃描模式為scan掃描模式；掃描范圍為45～350m/z；接口溫度230 ℃；

1.3.3 主體揮發(fā)性香氣成分評定方法

采用相對氣味活度值(relative odor activity value, ROVE)評價各揮發(fā)性物質對樣品總體風味的貢獻[14-16]，定義對樣品風味貢獻最大的組分的ROAV=100，則其他揮發(fā)性成分的ROAV<100，其計算如公式(1)所示：

(1)

式中：Ci、Ti分別為揮發(fā)性成分的相對含量(%)和氣味閾值(μg/kg);Ct、Tt分別為對樣品整體風味貢獻最大組分的相對含量(%)和氣味閾值(μg/kg)。

ROAV≥1，說明該物質為樣品的主體風味成分，且在一定范圍內(nèi)，ROAV越大說明該物質對總體風味貢獻越大； 0.1≤ROAV<1，說明該物質對整體風味有修飾作用[17-18]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用IBM SPSS Statistics 22.0進行主成分分析和聚類分析。

2 結果與分析

2.1 不同生態(tài)環(huán)境羊肚菌干品GC-MS分析

通過GC-MS分析，揮發(fā)性物質組成及相對含量如表2所示。12個樣品共鑒定出33種揮發(fā)性物質，其中有10種醛類，8種酯類，5種醇類，6種烴類，2種酮類，1種呋喃，1種含硫化合物。從含量分析， 2-甲基丁醛、3-甲基丁醛、2-甲基丙醛、乙酸乙酯、正己醛相對含量較高；從組成分析，各樣品揮發(fā)性物質數(shù)量和含量有一定差異，其中共有物質13個，包括2-甲基丙醛、乙酸乙酯、3-甲基丁醛、2-甲基丁醛、正己醛、2-甲基丁酸乙酯、3-甲基丁酸乙酯、正己醇、己酸乙酯、苯甲醛、3,6-二甲基癸烷、萘、莰烷。研究還發(fā)現(xiàn)，有些揮發(fā)性物質具有一定生境特異性。如僅丘陵地區(qū)樣品含有硫化物；僅川西高原樣品含有二十烷；僅成都平原樣品含有1-辛烯-3-醇。

2.2 羊肚菌揮發(fā)性成分種類分析

由表3可知，不同生態(tài)環(huán)境樣品在揮發(fā)性物質種類和相對含量沒有明顯相關性，差異較大。醛類種類數(shù)量最多，相對含量占比最高，在37.95%～82.25%；酯、醇、烴、含硫化合物居第2大類，分別為7.31%～15.00%、3.72%～25.82%、4.08%～9.46%和9.48%～13.99%；酮、呋喃屬第3大類，分別為0.6%～1.62%和0.71%～3.29%。

表2 不同種類揮發(fā)性成分在羊肚菌中的相對含量

注：-表示未檢出(下同)

表3 羊肚菌樣品揮發(fā)性物質組成及相對含量

2.3 羊肚菌揮發(fā)性香氣成分分析

不同生態(tài)環(huán)境羊肚菌揮發(fā)性香氣成分的ROAV，如表4所示。12個樣品主體揮發(fā)香氣成分(ROAV≥1)相似，都包含有2-甲基丙醛、乙酸乙酯、2-甲基丁醛、正己醛、2-甲基丁酸乙酯、己酸乙酯，而其中風味貢獻的最大的組分為2-甲基丁醛。2-甲基丙醛具有巧克力，蜜桃味；乙酸乙酯具有果香及葡萄、櫻桃香；正己醛具有葉香、果香味；2-甲基丁醛具有果香、可可味；己酸乙酯具有強烈的甜的果香、菠蘿、香蕉香氣和酒香，這些香氣組成了羊肚菌特有的香氣。除此之外，不同生態(tài)環(huán)境樣品有特異性，如PY7、PY8和PY9主體揮發(fā)香氣成分還含有具有蘑菇香氣、青香、蔬菜香以及油膩的氣息的1-辛烯-3-醇， Q10、QL11和QL12含有具有蔬菜香的二甲基二硫化物。對整體風味起重要修飾作用的成分有一定差異。CX1、CX2、CX3、CD4、CD5、PY8對整體風味起重要修飾作用的成分(0.1≤ROAV<1)為萘，CD6和PY7對整體起重要修飾作用成分是萘、2-戊基呋喃和正戊醛，萘、2-戊基呋喃和丙酸乙酯對PY9的整體風味起修飾作用，QL10和QL11起修飾作用成分為萘、2-戊基呋喃、丙酸乙酯和正戊醛，QL12起修飾作用成分為萘、2-戊基呋喃、正戊醛、戊酸乙酯和正壬醛。

表4 羊肚菌樣品揮發(fā)性成分氣味貢獻表

注：NF表示無法查到該化合物的感覺閾值而未作分析

2.4 羊肚菌揮發(fā)性物質的PCA

由表5可知，特征值大于1的共7個主成分，總方差95.381%，其方差貢獻率依次為44.971%、18.388%、9.331%、7.106%、6.376%、5.650%、3.558%，說明7個主成分反映了原始變量的絕大部分信息，成功達到了降維目的。

表5 主成分的方差貢獻率

羊肚菌非揮發(fā)性物質的主成分載荷得分圖如圖1所示。

圖1 十二個羊肚菌樣品的33種揮發(fā)性物質的3D載荷得分圖

第一主成分(PC1)中載荷較高的揮發(fā)性物質有2-戊基呋喃、2-甲基丙醛、2-甲基丁醛、3-甲基丁醛、正己醛、正己醇、己酸乙酯、正戊醛、戊酸乙酯、壬醛等。主成分1差異主要集中在青香、果香的揮發(fā)性物質。

第二主成分(PC2)中載荷較高的揮發(fā)性物質有二甲基丁酸乙酯和2-甲基-1-丁醇等。主成分2的差異主要集中在水果香、無香型的揮發(fā)性物質。

第三主成分(PC3)中載荷較高的揮發(fā)性物質有1-辛烯-3-醇和香葉基丙酮等。主成分3的差異主要集中在水果香、蔬菜香的揮發(fā)性物質。

如圖2所示，12個羊肚菌樣品可區(qū)分為三類，其中樣品Q10、Q11、Q12歸為1個集群，樣品PY7、PY8、PY9歸為1個集群，樣品CX1、CX2、CX3、CD4、CD5、CD6歸為1個集群。同一個集群樣品的揮發(fā)性物質相似，有相似的香氣成分。

圖2 十二個羊肚菌樣品的主成分3D得分圖

2.5 羊肚菌揮發(fā)性物質的CA

采用系統(tǒng)聚類分析法，以33個羊肚菌揮發(fā)性物質作為變量進行聚類分析。由圖3可知，當刻度為10時，12個羊肚菌樣品可分為2個集群，樣品QL10、QL11、QL12聚為1個集群，剩下的9個樣品歸為1個集群；刻度為5時，9個樣品又可分為2個集群，樣品PY8、PY9、PY7為1個集群，樣品CX1、CX2、CD4、CD6、CX3、CD5歸為1個集群。CA與PCA在刻度為5時的結果一致，說明二者均可對羊肚菌樣品進行分類。通過分類結果可見，相同生境馴化栽培的樣品聚為一類，如成都平原樣品和丘陵地區(qū)樣品分別聚為一類，川西高原和川東山區(qū)樣品較為相似，聚為一類。該研究結果可為后期的樣品采集提供理論依據(jù)，從而指導后期生產(chǎn)加工。

圖3 羊肚菌樣品聚類分析樹狀圖

3 討論

生態(tài)環(huán)境是決定樣品代謝特征的重要因素，而揮發(fā)性香氣成分是蘑菇致香物質的主體，是影響食用菌風味的主要因素之一[23-28]。目前羊肚菌種植區(qū)域范圍廣，各產(chǎn)地氣候、土壤等生態(tài)環(huán)境差異大，使得香氣風格特征表現(xiàn)形式多樣化，體現(xiàn)在香氣成分主要組成的含量和比例不盡相同，尤其是某些揮發(fā)性物質具有一定的生境特異性，如川西高原樣品CX1、CX2、CX3含有二十烷；成都平原樣品PY7、PY8、PY9含有1-辛烯-3-醇；丘陵地區(qū)樣品QL10、QL11、QL12含二硫化合物。這是由于在遺傳背景一致情況下，氣候、土壤、水質等環(huán)境條件會影響揮發(fā)性物質的初級和次級代謝，使得積累的代謝產(chǎn)物在種類和含量存在一定差異。

揮發(fā)性化合物對香氣的貢獻是由含量和氣味閾值共同決定，相對含量高的化合物不一定對香氣的貢獻就高。不同生態(tài)環(huán)境羊肚菌樣品主體揮發(fā)性物質2-甲基丙醛、乙酸乙酯、2-甲基丁醛、正己醛、2-甲基丁酸乙酯、己酸乙酯相同情況下，不同生境條件樣品有特異性香氣，PY7、PY8、PY9因含有1-辛烯-3-醇，具有蘑菇香氣，Q10、QL11和QL12因含有二硫化合物而具有蔬菜香。除此之外，對整體風味起重要修飾作用的成分主要集中在萘、2-戊基呋喃、正戊醛、丙酸乙酯、戊酸乙酯和正壬醛，但不同生境間存在一定差異。由此可知，栽培環(huán)境條件不僅影響初級和次級代謝產(chǎn)物種類和含量，還會在一定程度上影響主體揮發(fā)香氣成分和對整體風味起重要修飾的成分，從而影響樣品整體風味。

從揮發(fā)性香氣成分的種類含量和主體香氣成分分析，不同生境羊肚菌樣品存在一定差異，但是無法直接通過這些數(shù)據(jù)對相似樣品進行判定、區(qū)分和聚集。進一步通過PCA和CA統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)，相同生境馴化栽培樣品可以聚為1類，聚集一起的樣品香氣相似。由此說明PCA和CA可用于表征不同生境栽培馴化樣品揮發(fā)性香氣成分的差異，且2種方法可以相互檢驗。該研究結果為羊肚菌品種選育、質量評估及后期生產(chǎn)加工提供理論依據(jù)。