宋旸，劉影

(齊齊哈爾大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，黑龍江 齊齊哈爾，161006)

大豆分離蛋白(soybean protein isolate，SPI)是許多食品配方中的重要成分，其氨基酸組成和比例平衡且合理，可以與動(dòng)物蛋白相媲美，能夠替代和拓展動(dòng)物蛋白在食品體系中的功能作用[1]。為了滿足工業(yè)上對(duì)專用功能型大豆分離蛋白的需求，常采用改性的手段來(lái)顯著改善大豆分離蛋白的某一功能特性。糖基化改性是通過(guò)美拉德反應(yīng)與糖進(jìn)行接枝改性,這種改性方式不需要催化劑，安全可靠。KATO等[2]在1988年研究表明了乳清蛋白的功能性質(zhì)可以通過(guò)與葡聚糖的糖基化反應(yīng)得到改善，從此利用蛋白質(zhì)的糖基化改性提高功能性特性逐漸成為人們研究的熱點(diǎn)[3-12]。

葫蘆巴是一種生長(zhǎng)在北非，地中海，西亞，北印度并且現(xiàn)在在加拿大也培育的豆科植物。葫蘆巴膠(fenugreek gum，F(xiàn)G)是一種半乳甘露聚糖，具有很好的表面活性，可以作為一種有效的水包油乳化液的穩(wěn)定劑[13]。在11種商業(yè)用膠和5種實(shí)驗(yàn)室制備膠中葫蘆巴膠在水包油乳狀液模型系統(tǒng)中表現(xiàn)出最好的穩(wěn)定性[14]。KASRAN等[15]研究了大豆乳清分離蛋白與葫蘆巴膠在干熱的條件下進(jìn)行美拉德共價(jià)交聯(lián)反應(yīng)，使乳化特性得到提高。但采用干法進(jìn)行糖基化改性普遍存在耗時(shí)長(zhǎng)、能耗大、不適合工業(yè)生產(chǎn)等缺點(diǎn)。本文利用微波輔助大豆分離蛋白與葫蘆巴膠的糖基化反應(yīng)，通過(guò)微波作用使大豆分離蛋白結(jié)構(gòu)變得更加松散，使內(nèi)部包埋的基團(tuán)暴露，加快糖基化反應(yīng)的進(jìn)程，大大縮短了糖基化反應(yīng)的時(shí)間。該文研究了不同的微波時(shí)間、大豆分離蛋白與葫蘆巴膠的質(zhì)量比、糖基化反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)溫度對(duì)大豆分離蛋白乳化性的影響，通過(guò)響應(yīng)面法優(yōu)化出最佳改性條件，考察了結(jié)合物乳化性的變化，使大豆分離蛋白能夠更好地應(yīng)用在工業(yè)生產(chǎn)之中。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆分離蛋白，河南萬(wàn)邦實(shí)業(yè)有限公司；葫蘆巴膠，中凱食品配制有限公司；十二烷基磺酸鈉，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；大豆油，九三集團(tuán)非轉(zhuǎn)基因大豆油；Na2HPO4和Na2HPO4，長(zhǎng)春化學(xué)試劑廠；KBr，天津市博迪化工有限公司；所有試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

海爾微波爐(MK-2485MG)，青島海爾微波制品有限公司；高速分散機(jī)(T18)，德國(guó)IKA公司；紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(UV-5100)，上海元析儀器有限公司；冷凍干燥機(jī)(FD5)，美國(guó)SIM公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 微波輔助糖基化SPI的乳化液制備

將SPI與FG以一定的質(zhì)量比均勻混合后，用水溶解調(diào)至6%，利用功率為850 W的微波爐進(jìn)行輻射加熱，為了防止升溫過(guò)快, 采用間歇式加熱, 即微波輻射3 min，冰浴3 min，使溫度降下來(lái)并停止反應(yīng)，再進(jìn)行微波輻射[16]；微波處理一定時(shí)間后于-20 ℃保存再冷凍干燥。將干燥后的粉狀物放置在底部含有飽和NaCl溶液的干燥器內(nèi)進(jìn)行反應(yīng),保持溫度60 ℃,相對(duì)濕度75%[15]。

1.3.2 大豆分離蛋白乳化性的測(cè)定[17]

用0.2 mol/L pH 7.0的磷酸鹽緩沖溶液配制1 mg/mL大豆分離蛋白溶液，取30 mL樣品，加入10 mL大豆油以轉(zhuǎn)速為10 000 r/min在室溫下均質(zhì)1 min形成均勻的乳化液然后靜置。分別在靜置后的第0 min和第10 min從乳化液底部吸取100 μL，用5 mL 0.1%的十二烷基磺酸鈉(SDS)稀釋，在500 nm條件下測(cè)定吸光值。乳化活性(EA)用0 min的樣品吸光值A(chǔ)0表示，乳化穩(wěn)定性(ES)用乳化穩(wěn)定指數(shù)(ESI)表示為A0×Δt/ΔA,其中Δt為時(shí)間差10 min，ΔA為Δt內(nèi)的吸光值之差。

1.3.3 糖基化程度的測(cè)定

參考LERTITTIKULA等[18]的方法測(cè)定糖基化程度。將125 μL改性SPI溶液加入pH 8.2的2 mL 0.21 mol/L的磷酸鹽緩沖溶液中，與1 mL 0.01%的2,4,6-三硝基苯磺酸溶液混勻并充分振蕩，置于50 ℃水浴中避光反應(yīng)1 h，再將2 mL 0.1 mol/L Na2SO3溶液置于反應(yīng)液中，在室溫下冷卻30 min，在420 nm處測(cè)定吸光度At。然后在上述溶液中加入125 μL未經(jīng)水浴加熱的SPI溶液作為空白對(duì)照，于420 nm處測(cè)定其吸光度A0，根據(jù)公式(1)計(jì)算糖基化程度：

(1)

式中：A0表示未經(jīng)改性SPI吸光度；At表示改性SPI吸光度。

1.3.4 改性產(chǎn)物的表征

1.3.4.1 紅外光譜分析[19]

改性前后的樣品分別準(zhǔn)確稱取10 mg，將一定量的KBr加入其中，研磨成均勻粉末后，壓制成薄片，并用傅里葉變換紅外光譜儀測(cè)試。

1.3.4.2 紫外光譜分析[20]

用50 mmol/L、pH 7.0的Tris-HCl緩沖溶液配制樣品濃度為10 g/L，測(cè)量在不同波長(zhǎng)下的吸光度值。

1.3.5 單因素實(shí)驗(yàn)

1.3.5.1 微波時(shí)間對(duì)微波輔助糖基化SPI乳化性的影響

SPI與FG質(zhì)量比1∶3，反應(yīng)時(shí)間為30 min時(shí)，反應(yīng)溫度為60 ℃，考察微波時(shí)間為0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 min時(shí)對(duì)SPI糖基化程度及乳化性的影響。

1.3.5.2 SPI與FG質(zhì)量比對(duì)微波輔助糖基化SPI乳化性的影響

SPI與FG質(zhì)量比1∶3，微波時(shí)間3 min，反應(yīng)時(shí)間為30 min時(shí)，反應(yīng)溫度為60 ℃，考察SPI與FG質(zhì)量比分別為1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5時(shí)對(duì)SPI糖基化程度及乳化性的影響。

1.3.5.3 反應(yīng)時(shí)間對(duì)微波輔助糖基化SPI乳化性的影響

SPI與FG質(zhì)量比為1∶3，微波時(shí)間3 min，反應(yīng)溫度為60 ℃，考察干燥器反應(yīng)時(shí)間為0、5、10、30、50、70、90、110 min時(shí)對(duì)SPI糖基化程度及乳化性的影響。

1.3.5.4 反應(yīng)溫度對(duì)微波輔助糖基化SPI乳化性的影響

SPI與FG質(zhì)量比1∶3，微波時(shí)間3 min，反應(yīng)時(shí)間為30 min時(shí)，使其反應(yīng)溫度分別是40、50、60、70、80 ℃時(shí)對(duì)SPI糖基化程度及乳化性的影響。

1.3.6 響應(yīng)面分析法優(yōu)化工藝

依據(jù)上述單因素實(shí)驗(yàn)的討論，根據(jù)Box-Benhnken的中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理[21-22], 采用響應(yīng)面法[23]在3因素3水平上對(duì)微波輔助糖基化改性SPI條件進(jìn)行優(yōu)化。對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)結(jié)果采用Design Expert 8.0.6軟件進(jìn)行分析，因素和水平見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)面分析因素和水平表

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)分析

2.1.1 微波時(shí)間對(duì)微波輔助糖基化SPI乳化性影響

由圖1、圖2可以看出，在SPI與FG質(zhì)量比1∶3、反應(yīng)時(shí)間30 min、糖基化反應(yīng)溫度60 ℃時(shí), 隨著微波時(shí)間的延長(zhǎng)，乳化活性、乳化穩(wěn)定性和糖基化程度都是先上升后下降的趨勢(shì)，在微波時(shí)間在3 min時(shí)均達(dá)到最高值。這是由于適當(dāng)?shù)奈⒉ㄌ幚鞸PI能夠減弱蛋白分子間和分子內(nèi)的非共價(jià)作用，SPI的結(jié)構(gòu)變得松散，暴露更多的糖基化反應(yīng)位點(diǎn)，從而促進(jìn)糖基化反應(yīng)的發(fā)生，同時(shí)引入更多含有親水羰基的糖鏈[24]。由于FG以共價(jià)鍵連接入SPI肽鏈中，增加了空間阻力，使得界面蛋白很難發(fā)生聚合，從而提高其乳化活性和乳化穩(wěn)定性。但過(guò)度的微波預(yù)處理，就會(huì)使得蛋白分子重新聚集，SPI糖基化反應(yīng)減弱，乳化活性和乳化穩(wěn)定性也隨之降低[25]。

圖1 微波時(shí)間對(duì)微波輔助糖基化SPI乳化性影響

圖2 微波時(shí)間對(duì)微波輔助糖基化SPI糖基化程度影響

2.1.2 SPI與FG質(zhì)量比對(duì)微波輔助糖基化SPI乳化性影響

由圖3、圖4可以看出，在微波3 min、反應(yīng)時(shí)間30 min、糖基化反應(yīng)溫度60 ℃時(shí)，隨著質(zhì)量比的增加，乳化活性、乳化穩(wěn)定性和糖基化程度都是先上升后下降的趨勢(shì)，在質(zhì)量比為1∶3時(shí)均達(dá)到最高值。當(dāng)FG的質(zhì)量增加時(shí)，單位體積內(nèi)與SPI分子接觸的糖分子數(shù)量就會(huì)變多，糖基化反應(yīng)的速率就會(huì)變大，乳化活性和乳化穩(wěn)定性呈上升趨勢(shì)；但隨著添加的葫蘆巴膠的量繼續(xù)增加，由于不適當(dāng)?shù)腟PI和FG比例導(dǎo)致加劇副反應(yīng)(焦糖化)的發(fā)生以及FG分子的空間位阻對(duì)糖基化反應(yīng)有阻礙，所以隨著FG的繼續(xù)添加，乳化活性和乳化穩(wěn)定性呈下降的趨勢(shì)[26]。

圖3 SPI與FG質(zhì)量比對(duì)微波輔助糖基化SPI乳化性影響

圖4 SPI與FG質(zhì)量比對(duì)微波輔助糖基化SPI糖基化程度影響

2.1.3 反應(yīng)時(shí)間對(duì)微波輔助糖基化SPI乳化性影響

由圖5、圖6可以看出，在SPI與FG質(zhì)量比1∶3、微波3 min、糖基化反應(yīng)溫度60 ℃時(shí)，隨著反應(yīng)時(shí)間的增大，乳化活性、乳化穩(wěn)定性都是先上升后下降，反應(yīng)時(shí)間在30 min時(shí)均達(dá)到最高值；糖基化程度呈逐漸增大的趨勢(shì)，在30 min后趨于平緩。微波輔助糖基化的反應(yīng)時(shí)間逐漸增大到30 min時(shí)，SPI和FG糖基化反應(yīng)程度逐漸加深，糖基化SPI降低了油水界面的張力，乳化能力有所提高[27]。隨著反應(yīng)時(shí)間的繼續(xù)延長(zhǎng)，過(guò)多的葫蘆巴膠接枝到SPI，體現(xiàn)出顯著的親水性，所以糖基化SPI的乳化性開(kāi)始呈下降的趨勢(shì)[28]。

圖5 反應(yīng)時(shí)間對(duì)微波輔助糖基化SPI乳化性影響

圖6 反應(yīng)時(shí)間對(duì)微波輔助糖基化SPI糖基化程度影響

2.1.4 反應(yīng)溫度對(duì)微波輔助糖基化SPI乳化性影響

由圖7、圖8可以看出，在SPI與FG質(zhì)量比1∶3、微波3 min、反應(yīng)時(shí)間30 min時(shí)，隨著糖基化反應(yīng)溫度的增加，乳化活性、乳化穩(wěn)定性和糖基化程度都是先上升后下降的趨勢(shì)，在60 ℃均達(dá)到最高值。說(shuō)明溫度為60 ℃時(shí)，SPI糖基化反應(yīng)的效果較好，顯著地降低了油水界面的張力，提高了SPI的乳化性。但隨著溫度的繼續(xù)升高，大豆分離蛋白由于高溫容易發(fā)生熱變形，阻礙了糖基化反應(yīng)的進(jìn)行，所以糖基化的程度降低，乳化性也呈下降的趨勢(shì)[29]。

圖7 糖基化反應(yīng)溫度對(duì)微波輔助糖基化SPI乳化性影響

圖8 糖基化反應(yīng)溫度對(duì)微波輔助糖基化SPI糖基化程度的影響

2.2 微波輔助糖基化SPI乳化穩(wěn)定性的響應(yīng)面分析

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以反應(yīng)時(shí)間(A)、微波時(shí)間(B)、反應(yīng)溫度(C)為自變量，以乳化穩(wěn)定性(ES)為響應(yīng)值，進(jìn)行響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 響應(yīng)面所設(shè)計(jì)的方案和實(shí)驗(yàn)結(jié)果

利用Design Expert 8.0.6軟件設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)方案，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行二次回歸方程的分析，可以得出，SPI乳化穩(wěn)定性Y的二次回歸方程，并對(duì)它用方差的方法分析(見(jiàn)表3)可知。乳化穩(wěn)定性Y的標(biāo)準(zhǔn)回歸方程為：

Y=372.01-7.69A+8.15B+15.60C+8.30AB-20.36AC-13.40BC-164.83A2-135.49B2-109.26C2

模型的決定系數(shù)與調(diào)整決定系數(shù)分別為0.965 0、0.9200，說(shuō)明此模型與試驗(yàn)之間擬合程度較高，證明用此模型優(yōu)化反應(yīng)時(shí)間、微波時(shí)間和反應(yīng)溫度對(duì)微波輔助糖基化改性SPI影響具有可行性。由反應(yīng)時(shí)間、微波時(shí)間、反應(yīng)溫度對(duì)響應(yīng)值的影響可以得出，回歸方程Y中的A2、B2、C2對(duì)微波輔助糖基化SPI的乳化穩(wěn)定性都有明顯的影響，而其他因素影響不是很明顯，表明各影響因素對(duì)于微波輔助糖基化SPI的影響不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系。用中心標(biāo)準(zhǔn)化處理回歸方程，Y回歸方程一次項(xiàng)回歸系數(shù)的絕對(duì)值大小依次為C、B、A，因此，3個(gè)影響因素對(duì)乳化穩(wěn)定性影響順序?yàn)椋悍磻?yīng)溫度(C)>微波時(shí)間(B)>反應(yīng)時(shí)間(A)。

表3 乳化穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果的方差分析表

對(duì)模型中的反應(yīng)時(shí)間(A)、微波時(shí)間(B)、反應(yīng)溫度(C)其中的一個(gè)因素讓它在0水平不動(dòng)時(shí)，由此可知，另外2個(gè)影響因素相互交叉作用對(duì)乳化穩(wěn)定性Y的子模型，并根據(jù)子模型，分別繪制出a、b、c三個(gè)三維響應(yīng)曲面圖，見(jiàn)圖9。

圖9說(shuō)明了各因素對(duì)微波輔助糖基化SPI乳化穩(wěn)定性的影響。由圖9-a、9-b、9-c可以看出，3個(gè)因素與Y呈拋物線關(guān)系，隨著反應(yīng)時(shí)間、微波時(shí)間和反應(yīng)溫度的增加，乳化穩(wěn)定性先呈不同程度的上升趨勢(shì)，先達(dá)到最高點(diǎn)后，繼而隨著各影響因素值的增加，乳化穩(wěn)定性呈下降趨勢(shì)，這與單因素的實(shí)驗(yàn)結(jié)果不約而同。并且由圖9-a和圖9-b可以看出，與反應(yīng)溫度和微波時(shí)間相比，反應(yīng)時(shí)間對(duì)SPI乳化活性的影響相對(duì)較小。

通過(guò)所得到的模型，可預(yù)測(cè)采用微波輔助糖基化法提高SPI乳化穩(wěn)定性的最好的工藝條件為：反應(yīng)時(shí)間41 min、微波時(shí)間3 min、反應(yīng)溫度58 ℃。在此條件下，微波輔助糖基化法SPI乳化穩(wěn)定性(OD500)在理論上可達(dá)371.156 min。

2.3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

根據(jù)上述結(jié)果進(jìn)行近似驗(yàn)證試驗(yàn)，檢測(cè)真實(shí)值是否與試驗(yàn)結(jié)果相一致。在最佳工藝條件下進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，測(cè)得微波輔助糖基化SPI的乳化穩(wěn)定性(OD500)為370.38 min，與理論值相比，相對(duì)誤差在±1%以內(nèi)，而且重復(fù)性好，說(shuō)明優(yōu)化結(jié)果是準(zhǔn)確可靠的。

a-反應(yīng)時(shí)間和微波時(shí)間對(duì)乳化穩(wěn)定性影響的響應(yīng)面圖;b-反應(yīng)時(shí)間和反應(yīng)溫度對(duì)乳化穩(wěn)定性影響的響應(yīng)面圖;c-微波時(shí)間和反應(yīng)溫度對(duì)乳化穩(wěn)定性影響的響應(yīng)面圖

2.4 未改性SPI、微波改性SPI與微波輔助糖基化SPI乳化性的對(duì)比

由圖10可以看出，在最佳的微波輔助糖基化改性條件下，將未改性的SPI、微波改性SPI和微波輔助糖基化SPI的乳化性進(jìn)行對(duì)比，未改性SPI的乳化活性和乳化穩(wěn)定性數(shù)值最小，微波輔助糖基化SPI的乳化活性和乳化穩(wěn)定性數(shù)值最大，微波改性SPI的乳化活性和乳化穩(wěn)定性數(shù)值處于二者之間。由此，可知微波輔助糖基化可以顯著提高SPI的乳化性。

圖10 未改性SPI、微波改性SPI與微波輔助糖基化SPI乳化性的對(duì)比

2.5 紅外光譜分析

圖11 微波輔助糖基化改性SPI樣品的紅外光譜圖

2.6 紫外光譜分析

紫外光譜是研究蛋白質(zhì)構(gòu)象的一種方法，主要體現(xiàn)在芳香族氨基酸。由圖12可知，蛋白吸收峰有所變化。微波改性的SPI吸收峰高于未改性的SPI，在270 nm附近處的吸光值也高于未改性SPI，這可能是因?yàn)槲⒉ㄟ^(guò)程中使蛋白質(zhì)疏水性生色基團(tuán)露出從而使吸光值變大。微波輔助糖基化改性后的SPI在280 nm附近的吸收峰弱于未改性的SPI，并向短波方向移動(dòng)，說(shuō)明了SPI與FG發(fā)生了共價(jià)交聯(lián)[31]，使蛋白分子空間結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化，導(dǎo)致酪氨酸和色氨酸對(duì)紫外線的吸收降低。

圖12 微波輔助糖基化改性SPI樣品的紫外光譜圖

3 結(jié)論

在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，并通過(guò)對(duì)顯著影響因素反應(yīng)時(shí)間、微波時(shí)間和反應(yīng)溫度做響應(yīng)面分析，確定微波輔助糖基化的最佳工藝條件為反應(yīng)時(shí)間41 min、微波時(shí)間3 min、SPI與FG質(zhì)量比1∶3和反應(yīng)溫度58 ℃。其制備的微波輔助糖基化SPI的乳化穩(wěn)定性(OD500)為370.38 min，與理論值相比差異不顯著。

在最佳工藝下制備的微波輔助糖基化SPI乳化穩(wěn)定性有較大的提高,與微波改性的SPI相比，微波輔助糖基化SPI乳化活性提高了51.33%，乳化穩(wěn)定性提高了294.14%；與未改性的SPI對(duì)比，微波輔助糖基化SPI乳化活性提高了88.67%，乳化穩(wěn)定性提高了788.84%。

紅外光譜和紫外光譜分析得知，改性前后SPI的各吸收峰強(qiáng)度均有不同程度的變化，因此表明SPI與FG之間發(fā)生了共價(jià)交聯(lián)，改變了蛋白分子空間結(jié)構(gòu)。