朱蘭， 俞丹， 劉煥章*

(1. 大連海洋大學(xué)，遼寧大連116023； 2. 中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所，水生生物多樣性與保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢430072)

1 材料與方法

1.1 研究材料

在遼寧省朝陽市朝陽縣、朝陽市北票市和錦州市義縣的大凌河水系和河南省洛陽市黃河流域的伊河和洛河水系中(圖1)中共采集標(biāo)本170尾，用10%福爾馬林固定，分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)材料取自新鮮標(biāo)本右側(cè)背部的肌肉組織，保存于75%酒精中，統(tǒng)一保存于中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所。標(biāo)本的測(cè)量使用數(shù)顯游標(biāo)卡尺，由同一人對(duì)樣本的形態(tài)學(xué)特征進(jìn)行詳細(xì)的測(cè)量，從標(biāo)本的左側(cè)進(jìn)行，精確到0.1 mm，使用SPSS 25.0處理數(shù)據(jù)，計(jì)算平均值和標(biāo)準(zhǔn)差。形態(tài)計(jì)數(shù)和測(cè)量方法參照Hubbs和Lagler(2004)，其中，背鰭和臀鰭最后一根在基部的分枝的鰭條計(jì)為“1”，側(cè)線鱗的計(jì)數(shù)是從鰓蓋后方第一片有孔鱗數(shù)到尾鰭基部最后一片有孔鱗。并且對(duì)新種的同屬物種進(jìn)行檢視，檢視標(biāo)本為寬鰭：IHB 197607001和197607002，2尾，體長(zhǎng)93.3和100.1 mm，日本：琵琶湖，保存于中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所。棘頰：BMNH 1901.3.6.10～1901.3.6.15，6尾，體長(zhǎng) 87.2～130.0 mm，全模標(biāo)本，中國(guó)：浙江：甬江，保存于英國(guó)自然歷史博物館；IHB 201808102～201808113，12 尾，體長(zhǎng)63.4～95.1 mm，中國(guó)：浙江：甬江，保存于中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所。

1.2 基因組DNA的提取和PCR擴(kuò)增、測(cè)序

基因組DNA的提取采用高鹽濃度抽提法，參照Tang等(2009)的方法，并稍作改動(dòng)。cytb基因的擴(kuò)增及測(cè)序引物為正向引物L(fēng)14724(5’-GACTTGAAAAACCACCGTTG-3’)和反向引物H15915(5’-CTCCGATCTCCGGATTACAAGAC-3’)(Xiaoetal.，2001)。PCR反應(yīng)的總體積為30 μL：3 μL DNA模板，反應(yīng)體系包括：10×Buffer 3 μL，dNTPs 1.5 μL(10 mmol·L-1)，引物各1 μL(10 μmol·L-1)，Taq DNA聚合酶0.25 μL，加滅菌雙蒸水至30 μL。PCR反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性45 s，54 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，送測(cè)序公司雙向測(cè)序，測(cè)序引物與PCR擴(kuò)增引物相同。

圖1 中華Zacco sinensis sp. nov.采樣點(diǎn)Fig. 1 The sampling sites of Zacco sinensis sp. nov.

1. 遼寧省朝陽市朝陽縣柳城街下洼子村(120°37′62″E， 41°48′74″N)； 2. 遼寧省朝陽市北票市章吉營(yíng)鄉(xiāng)章吉營(yíng)村(120°62′83″E， 41°60′20″N)； 3. 遼寧省錦州市義縣九道嶺鎮(zhèn)四方臺(tái)村(121°31′58″E， 41°55′19″N)； 4. 河南省洛陽市伊川縣河濱街(112°47′39″E， 34°52′55″N)； 5. 河南省洛陽市洛龍區(qū)凌波大橋(112°38′57″E， 34°59′91″N)

1. Xiawazi village， Liucheng street， Chaoyang county， Chaoyang city， Liaoning province (120°37′62″E， 41°48′74″N)； 2. Zhangjiying village， Zhangjiying town， Beipiao city， Chaoyang city， Liaoning province (120°62′83″E， 41°60′20″N)； 3. Sifangtai village， Jiudaoling town， Yi county， Jinzhou city， Liaoning province (121°31′58″E， 41°55′19″N)； 4. Hebin street， Yichuan county， Luoyang city， Henan province (112°47′39″E， 34°52′55″N)； 5. Lingbo bridge， Luolong district， Luoyang city， Henan province (112°38′57″E， 34°59′91″N)

1.3 遺傳變異與系統(tǒng)發(fā)育分析

DNA序列的比對(duì)使用Clustal X (Thompsonetal.，1997)，并在SEAVIEW中進(jìn)行手工校正(Galtieretal.，1996)。采用MEGA 6.0 分析序列中各堿基含量及變異情況(Tamuraetal.，2013)，并基于Kimura雙參數(shù)(Kimura 2-parameter，K2P)模型計(jì)算轉(zhuǎn)換/顛換比率與物種間遺傳距離等參數(shù)(Kimura，1980；Kondoetal.，2016)。在jModeltest 2 中基于AIC值選擇最適堿基替代模型(Darribaetal.，2012)。

馬口魚類系統(tǒng)發(fā)育樹重建使用鄰接法(neighbor-joining，NJ)、貝葉斯法(Bayesian inferences，BI)和最大似然法(maximum likelihood，ML)。鄰接法使用MEGA 6.0基于K2P模型，系統(tǒng)樹分支置信度采用自引導(dǎo)法(bootstrap analysis)，進(jìn)行1 000次重復(fù)抽樣檢測(cè)。BI樹的重建使用MrBayes 3(Huelsenbeck & Ronquist，2001)，替代模型根據(jù)篩選結(jié)果設(shè)定為：nst=6，rates=gamma；起始樹設(shè)置為隨機(jī)樹，馬爾科夫鏈的蒙特卡洛方法(Markov chain Monte Carlo process，MCMC)設(shè)置為4條鏈同時(shí)運(yùn)行4×106代，3條熱鏈1條冷鏈。每100代對(duì)系統(tǒng)樹進(jìn)行抽樣，最終得到40 001棵系統(tǒng)發(fā)育樹，初始的10 000作為老化樣本舍棄，剩余的樣本構(gòu)建一致樹并計(jì)算后驗(yàn)概率。最大似然法分析使用RaxML 8.0(Stamatakis，2014)，替代模型為GRT+I+G，替代數(shù)設(shè)置為6，設(shè)置1 000次自舉檢驗(yàn)來計(jì)算各分支的置信度。

表1 研究所用樣本及來源Table 1 Samples and their localities in the present study

注：*新測(cè)序列

Note：*sequences in this study

2 結(jié)果

正模標(biāo)本IHB 180407020，雄，體長(zhǎng)79.8 mm；2018年4月采自遼寧省朝陽市朝陽縣柳城街道下洼子村(大凌河水系)(120°37′62″E，41°48′74″N)；采集人：胡華明、倪述。

副模標(biāo)本IHB 180407021～180407035，15尾，體長(zhǎng)69.3～92.4 mm；2018年4月采自遼寧省錦州市義縣九道嶺鎮(zhèn)四方臺(tái)村(大凌河水系)(121°31′58″E，41°55′19″N)、遼寧省朝陽市北票市章吉營(yíng)鄉(xiāng)章吉營(yíng)村(大凌河水系)(120°62′83″E，41°60′20″N)、遼寧省朝陽市朝陽縣柳城街道下洼子村(大凌河水系)(120°37′62″E，41°48′74″N)；采集人：胡華明、倪述。

IHB 171101001～171101010，10尾，體長(zhǎng)61.1～89.1 mm；2017年10月采自河南省洛陽市伊川縣河濱街(伊河水系)(112°47′39″E，34°52′55″N)、河南省洛陽市洛龍區(qū)凌波大橋(洛河水系)(112°38′57″E，34°59′91″N)；采集人：邱寧。

形態(tài)描述測(cè)量新種標(biāo)本26尾，全長(zhǎng)72.7～112.4 mm，體長(zhǎng)61.1～92.4 mm。相關(guān)可量、可數(shù)性狀見表2。新種體長(zhǎng)而側(cè)扁，腹圓，頭長(zhǎng)略大于體高。唇較薄，光滑。口端位，口裂較小，稍向上傾斜，上頜稍長(zhǎng)于下頜，上、下頜平整無缺口，向后延伸未到或剛到達(dá)眼前緣下方。眼較大，位于頭側(cè)中上方。鼻孔較大，位于眼前方。圍尾柄鱗13～17，鰓耙排列疏松，第一鰓弓外側(cè)鰓耙10～12，內(nèi)側(cè)12～17，末端成鉤狀。

背鰭無硬刺，位于體中部，外緣呈弧形；胸鰭末端尖，未到達(dá)腹鰭基部，背鰭略長(zhǎng)于胸鰭；腹鰭小，外緣呈弧形，未到達(dá)肛門，腹鰭起點(diǎn)與背鰭起點(diǎn)相對(duì)；臀鰭基部長(zhǎng)，臀鰭第二、三根分枝鰭條最長(zhǎng)，可到達(dá)尾鰭基部。尾鰭分叉，上下葉幾乎等長(zhǎng)。肛門離臀鰭起點(diǎn)很近，臀鰭基長(zhǎng)較背鰭基長(zhǎng)長(zhǎng)。體側(cè)鱗片中等大小；側(cè)線完全，且在胸鰭后方向下彎曲，然后再向上延伸到尾柄中部。胸部與腹部均有鱗片覆蓋，胸部及腹中線的鱗片埋于皮下，不甚明顯。

體色生活時(shí)鮮艷，雄魚比雌魚明顯。眼睛上邊緣橘紅色，背部灰色帶橘黃色，腹部銀白色，體側(cè)胸鰭到臀鰭起點(diǎn)之間具有3～8條不規(guī)則的灰綠色條紋，雄魚體側(cè)條紋明顯，雌魚體色條紋不明顯。背鰭分枝鰭條分為三部分：基部鰭條邊緣黑色，鰭間膜夾雜黑色顆粒，中部鰭條透明，鰭間膜黑色條紋，外緣各鰭邊緣黑色，鰭間膜透明。胸鰭灰白色或橘黃色，腹鰭灰白色，臀鰭灰白色或淺黃色。福爾馬林固定的樣本背部灰黑色，腹部灰白色，背鰭基部黑色，尾鰭分叉，邊緣黑色。

地理分布該種目前僅知分布于大凌河水系和黃河流域。

詞源新種種名源自拉丁文“sinensis”，意為“中國(guó)的”，指的是該物種的產(chǎn)地。

圖2 中華， ♂ (正模標(biāo)本， IHB 180407020， 體長(zhǎng)79.8 mm)Fig. 2 Zacco sinensis sp. nov， male (holotype， IHB 180407020， 79.8 mm standard length)

表2 中華的可數(shù)性狀和測(cè)量比例性狀Table 2 Meristic characters and proportional measurements of Zacco sinensis sp. nov.

3 分子系統(tǒng)發(fā)育分析

本研究中，使用18種馬口魚類的線粒體cytb基因序列共44條，另外采用2條細(xì)鯽屬Aphyocypris魚類的cytb序列作為外類群。所有序列經(jīng)比對(duì)分析后，得到單條全長(zhǎng)為1 140 bp的序列集。序列中無堿基的插入或缺失，該片段A、T、G、C的堿基含量平均值分別為(不含外群)25.7%、30.1%、16.4%、27.8%。A+T含量(55.8%)高于G+C含量(44.2%)，與魚類線粒體基因A、T含量高，G、C含量低的特點(diǎn)基本一致。1 140個(gè)位點(diǎn)中，保守位點(diǎn)708個(gè)，占總位點(diǎn)數(shù)的62.1%；變異位點(diǎn)432個(gè)，占37.9%；單突變位點(diǎn)27個(gè)，占2.4%；簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)405個(gè)，占35.5%。所有序列轉(zhuǎn)換顛換比平均值為5.08。

圖3 基于cyt b基因序列構(gòu)建的馬口魚類鄰接樹， 節(jié)點(diǎn)處數(shù)值為NJ/BI/ML分析中所得的支持率(僅顯示大于50/0.5)Fig. 3 Phylogenetic relationships of opsariichthine derived from NJ tree based on cyt b gene sequences， values at thenodes correspond to the support values for NJ/BI/ML methods (above 50/0.5 are shown)

4 討論

表3 中華與2個(gè)同屬近似物種的主要鑒別特征Table 3 Principal diagnostic characters for Zacco sinensis sp. nov. and its 2 related congeners

致謝：感謝中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所胡華明老師、倪述、邱寧在野外采集標(biāo)本方面提供的諸多幫助，感謝張旭在地圖制作上提供的幫助，感謝張智、沈中源、王雪在軟件使用上提供的幫助。