鄭文江 ，彭紫荊，嚴(yán) 倩，謝富淇，詹少鋒 ，楊柳柳，劉小虹，江 勇，莊轟發(fā)＊＊

（1. 廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院 廣州 510405；2. 廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院廣州 510405；3. 深圳市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院 深圳 518104）

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease,COPD)是一種常見慢性疾病，兩大特征是持續(xù)存在的呼吸道癥狀和氣流受限[1]。每年，COPD 導(dǎo)致全世界近300 萬人死亡，而在中國(guó)多達(dá)1 億人可能患有COPD[2]，約占全球COPD 病例總數(shù)的25%。雖然在癥狀的治療和急性加重的預(yù)防方面取得了進(jìn)展，但改善疾病進(jìn)展或影響死亡率的進(jìn)展很少，因此仍然需要對(duì)導(dǎo)致COPD 的復(fù)雜疾病機(jī)制有更好的了解[3]。在過去的10 年中，科學(xué)家們?yōu)閷ふ裔槍?duì)COPD 炎癥的新療法做了大量的工作，但效果并不明顯[4]，這可能與炎癥和相關(guān)臨床表型的復(fù)雜性密切相關(guān)，僅僅針對(duì)單個(gè)炎癥途徑或機(jī)制可能不足以持續(xù)抑制所有COPD 患者的炎癥[5]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和系統(tǒng)生物學(xué)可能有助于我們從整合信息的角度了解COPD 的臨床表現(xiàn)并確定新療法的分子靶標(biāo)[6]。

方劑的證候效應(yīng)及其多靶點(diǎn)作用的科學(xué)闡釋是目前方劑現(xiàn)代研究的關(guān)鍵問題[7]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)集合了高通量數(shù)據(jù)整合、數(shù)據(jù)挖掘、靶點(diǎn)預(yù)測(cè)、以及模擬實(shí)驗(yàn)室等研究手段，從整體分析中藥復(fù)方“多成分、多靶點(diǎn)”的作用機(jī)制[8]，也能呈現(xiàn)特定疾病相關(guān)的“活性成分-靶點(diǎn)-通路”，其系統(tǒng)性、整體性的特點(diǎn)與中醫(yī)中藥整體觀、辨證論治的原則和中藥復(fù)方治療疾病的手段等一脈相承[9]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)概念的提出[10]和中醫(yī)藥網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法為中醫(yī)從經(jīng)驗(yàn)醫(yī)學(xué)到循證醫(yī)學(xué)系統(tǒng)的轉(zhuǎn)化提供了新的研究范式[11]。

培土生金方是廣東省名中醫(yī)劉小虹教授及其團(tuán)隊(duì)發(fā)明的一種治療穩(wěn)定期慢性阻塞性肺疾病的中藥復(fù)方[12]，由五指毛桃、茯苓、白術(shù)、太子參、紫蘇子和苦杏仁組成，已經(jīng)獲得發(fā)明專利且開發(fā)為廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院院內(nèi)制劑，命名為肺康顆粒，該方以培土生金法為原則，宗四君之義，運(yùn)用嶺南地區(qū)道地藥材，用方精簡(jiǎn)，配伍精良，具有良好的健脾益肺、化痰平喘之功，多年來在臨床上廣泛運(yùn)用于COPD 穩(wěn)定期患者[13-14]，取得較好療效。本文基于所在課題組已有的實(shí)驗(yàn)研究和臨床研究成果，包括運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理技術(shù)識(shí)別培土生金法對(duì)COPD 水通道蛋白的機(jī)制研究、中醫(yī)藥強(qiáng)省醫(yī)院中藥制劑“肺康顆粒”建設(shè)項(xiàng)目等，對(duì)課題組研究成果進(jìn)行補(bǔ)充闡述，運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和生物信息學(xué)的方法，嘗試從中藥復(fù)方多靶點(diǎn)、多通路作用的角度，探討培土生金方對(duì)COPD潛在的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 收集潛在活性成分及其作用靶點(diǎn)

口服生物利用度（OB）和類藥性（DL）是中藥化學(xué)成分的重要參數(shù)，在TCMSP[15](http://tcmspw.com/),TCMID(http://www.megabionet.org/tcmid)[16],TCMDatabase@Taiwan[17]和文獻(xiàn)數(shù)據(jù)庫(kù)中，根據(jù)OB＞30%、DL＞0.18的標(biāo)準(zhǔn)，使用ADME參數(shù)[18]篩選出可能的藥物小分子，基于TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)和Drugbank 數(shù)據(jù)庫(kù)[19](https://www.drugbank.ca/)，預(yù)測(cè)化學(xué)小分子對(duì)應(yīng)的靶蛋白，篩選培土生金中藥復(fù)方肺康顆粒（PTSJ）的潛在活性成分及其相應(yīng)的靶點(diǎn)信息。

1.2 篩選候選靶點(diǎn)

利用UniProt 數(shù)據(jù)庫(kù)[20]中UniProtKB 搜索功能將獲得的潛在活性成分對(duì)應(yīng)的蛋白靶點(diǎn)名稱轉(zhuǎn)換為基因靶點(diǎn)名稱。在CTD數(shù)據(jù)庫(kù)[20]的關(guān)鍵詞搜索功能中選擇Disease 并輸入 Chronic obstructive pulmonary disease，獲得疾病相關(guān)基因名稱，與上述經(jīng)Uniprot轉(zhuǎn)換的靶點(diǎn)基因名稱進(jìn)行互相映射，得到培土生金方肺康顆粒作用于COPD的候選靶點(diǎn)。

1.3 活性成分-靶點(diǎn)（C-T，Compound-Target）網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建及分析

將整理得的活性成分及其相應(yīng)的靶點(diǎn)對(duì)應(yīng)關(guān)系導(dǎo)入Cytoscape 3.7.0軟件[22]進(jìn)行活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建，并使用工具中的NetworkAnalysis[23]進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治?，將靶點(diǎn)的Degree 值進(jìn)行排序，得到潛在核心靶點(diǎn)。Cytoscape 是一款功能強(qiáng)大的網(wǎng)絡(luò)圖編輯軟件，采用圖形化顯示網(wǎng)絡(luò)方式進(jìn)行分析和編輯，主要功能包括構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)、設(shè)計(jì)和圖形繪制，支持TXT、SIF、GML 等多種網(wǎng)格描述格式，廣泛應(yīng)用于生物分析領(lǐng)域，將映射關(guān)系及數(shù)值對(duì)比可視化。在網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治鲋校?jié)點(diǎn)代表化合物或靶點(diǎn)，連接的線代表之間的反應(yīng)，其中，節(jié)點(diǎn)的度（Degree）是指網(wǎng)絡(luò)中直接與該節(jié)點(diǎn)相連的邊的數(shù)目，介數(shù)中心性（Betweenness centrality）是指一個(gè)節(jié)點(diǎn)的介數(shù)為網(wǎng)絡(luò)中所有最短路徑中經(jīng)過該點(diǎn)的數(shù)量比例，此二者皆為重要的拓?fù)鋮?shù)，數(shù)值越大，則表示該點(diǎn)在網(wǎng)絡(luò)中地位越重要。

1.4 蛋白質(zhì)相互作用（PPI，protein-protein interaction）網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建及分析

STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)（http://string-db.org）[24]是基因、蛋白質(zhì)相互作用關(guān)系數(shù)據(jù)庫(kù)，包括1100多個(gè)物種的5200多萬蛋白質(zhì)，可進(jìn)行已知蛋白質(zhì)和預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)之間的相互作用，在蛋白質(zhì)水平的研究上被廣泛應(yīng)用。利用STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)的Multiple proteins 功能，將獲得的蛋白互作關(guān)系保存，將候選作用靶點(diǎn)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用文件中的 node1、node2、combined score 導(dǎo)入Cytoscape 3.7.0 軟件構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)，進(jìn)行可視化處理，并使用工具中的NetworkAnalysis 進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治?，主要根?jù)結(jié)果中的Degree 值的大小篩選，與上一步合并，獲得核心靶點(diǎn)。

1.5 潛在靶點(diǎn)的基因注釋

使用R 語言及org.Hs.eg.db 數(shù)據(jù)包轉(zhuǎn)換核心靶點(diǎn)的 entrezID，再使用 ClusterProfiler 包[25]對(duì)靶點(diǎn)其 GO 功能[25]及KEGG 通路[27]進(jìn)行基因注釋的富集分析，得到核心靶點(diǎn)在基因功能及信號(hào)通路的注釋。

1.6 GEO數(shù)據(jù)集靶點(diǎn)驗(yàn)證

下載GEO 數(shù)據(jù)庫(kù)芯片數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)集的編號(hào)為GSE76925[28]，該 數(shù) 據(jù) 集 151 例 樣 本 ，其 中 111 例 為COPD 患者樣本，40 例為控制對(duì)照組的樣本。下載編號(hào)為GSE76925 數(shù)據(jù)集的原始數(shù)據(jù)文件，使用R 語言軟 件 的 affy 包[29]（Version 3.9）進(jìn) 行 讀 取 ，以 RMA（robust multi-array average）方法進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化預(yù)處理，包括背景校正、標(biāo)準(zhǔn)化、歸一化等預(yù)處理，利用平臺(tái)注釋文件對(duì)探針進(jìn)行注釋，剔除沒有匹配到基因的探針；對(duì)于不同探針映射到同一基因，則選取不同探針的均值作為此基因的最終表達(dá)值。將樣本分為兩組，疾病組和健康組，對(duì)COPD 患者組（COPD）和健康對(duì)照組（HC）樣本的表達(dá)，利用limma包[30]（Version 3.9）計(jì)算基因表達(dá)差異的P值和表達(dá)Fold Change 值，進(jìn)而選取P ＜0.05 且|log2FC|＞1（2 倍關(guān)系）作為篩選顯著差異表達(dá)基因的閾值。

2 結(jié)果

2.1 培土生金方的潛在活性成分

通過 TCMSP、TCMDatabase@Taiwan、TCMID 和文獻(xiàn)數(shù)據(jù)庫(kù)檢索，分別查找肺康顆粒的化學(xué)成分，將上述3 個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)查到的化學(xué)成分匯總，并刪除重復(fù)化學(xué)成分，作為潛在活性成分（其中，五指毛桃為嶺南特色道地藥材，是肺康顆粒中藥復(fù)方的君藥，因此納入已經(jīng)報(bào)道的所有化學(xué)成分作為潛在活性成分），并收集所有靶點(diǎn)信息，共獲得83個(gè)潛在活性成分。

2.2 培土生金方的潛在候選靶點(diǎn)

利用UniProt 數(shù)據(jù)庫(kù)中UniProtKB 搜索功能，限定檢索靶點(diǎn)范圍為“Homo sapiens(Human)”，將靶點(diǎn)逐個(gè)輸入，轉(zhuǎn)換為規(guī)范名字，共有1112 個(gè)靶點(diǎn)信息，其中，太子參82個(gè)潛在靶點(diǎn)，茯苓26個(gè)潛在靶點(diǎn)，白術(shù)17個(gè)潛在靶點(diǎn)，紫蘇子156 個(gè)潛在靶點(diǎn)，苦杏仁178 個(gè)潛在靶點(diǎn)，五指毛桃653個(gè)潛在靶點(diǎn)，靶點(diǎn)數(shù)量及其具體分布見表1。在CTD 數(shù)據(jù)庫(kù)中，輸入“Chronic obstructive pulmonary disease”，收集目前已知的COPD 相關(guān)靶點(diǎn)，并將肺康顆粒有效活性成分中的基因靶點(diǎn)與其進(jìn)行比對(duì)匹配，篩選得出肺康顆粒有效活性成分中治療COPD的相關(guān)靶點(diǎn)，共獲得193個(gè)潛在候選靶點(diǎn)。

表1 培土生金方的潛在活性成分及其OB和DL值

續(xù)表

續(xù)表

圖1 活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

2.3 C-T網(wǎng)絡(luò)分析

將整理得的活性成分及其相應(yīng)的靶點(diǎn)對(duì)應(yīng)關(guān)系導(dǎo)入Cytoscape3.7.0 軟件進(jìn)行活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建，并使用工具中的NetworkAnalysis 進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治?，將靶點(diǎn)的Degree 值進(jìn)行排序，篩選Degree 值≥3的作為潛在核心靶點(diǎn)，得到83潛在核心靶點(diǎn)。網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治觯▓D1）中，含灰色環(huán)的圓形節(jié)點(diǎn)代表化合物，橙色矩形代表靶點(diǎn)，連接的線代表之間的反應(yīng)；同時(shí)具有兩種或兩種以上顏色的表示各中藥的共有成分；各節(jié)點(diǎn)的大小與度值大小呈正相關(guān)關(guān)系：靶點(diǎn)中圖形越小表示度值（Degree）越小，圖形越大表示度值越大，發(fā)生的反應(yīng)越多。連接的線的粗細(xì)與該邊線的介數(shù)中心性（Betweenness Centrality）呈正相關(guān)關(guān)系，數(shù)值越大，邊越粗，則表示該點(diǎn)在網(wǎng)絡(luò)中地位越重要。

2.4 PPI網(wǎng)絡(luò)分析

在STRING數(shù)據(jù)庫(kù)輸入83個(gè)潛在核心靶點(diǎn)的基因名稱，限定物種為“Homo sapiens”，對(duì)所有靶點(diǎn)進(jìn)行PPI 分析，獲得初始PPI 關(guān)系，調(diào)節(jié)可信度為7.0，獲得蛋白質(zhì)之間相互作用的評(píng)分及相關(guān)數(shù)據(jù)分析，最后把獲得的蛋白互作關(guān)系保存為TSV格式。

導(dǎo)出源文件后，將數(shù)據(jù)進(jìn)行整理后導(dǎo)入cytoscape3.7.0 軟件中，進(jìn)行進(jìn)一步網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治?，篩選Degree 值 ≥ 3 的靶點(diǎn)，與上一步NetworkAnalysis 網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治鼋Y(jié)果整合，獲得77 個(gè)核心靶點(diǎn)（表2），PPI可視化處理（圖2）。

表2 培土生金方的潛在核心靶點(diǎn)

續(xù)表

圖2 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)

2.5 潛在靶點(diǎn)的基因注釋結(jié)果

首先，是基因功能的注釋，把培土生金方有效活性成分中治療COPD 的193 個(gè)候選靶點(diǎn)分別通過ClusterProfiler（pV＜0.05，qV＜0.05）進(jìn)行 GO 富集分析。圖中，顏色從藍(lán)色到紅色表示P值從小到大，即越紅表示條目的顯著度越高。

結(jié)果顯示，對(duì)候選靶點(diǎn)的基因功能主要包括：對(duì)有毒物質(zhì)、細(xì)菌起源分子、脂多糖、異源生物刺激、細(xì)胞對(duì)藥物、細(xì)胞外刺激、營(yíng)養(yǎng)水平的反應(yīng)和活性氧代謝等生物學(xué)過程，包括突觸后膜、突觸前膜、小窩和膜區(qū)等細(xì)胞組分，包括核受體活性、銨離子結(jié)合、蛋白質(zhì)異二聚活性、腎上腺素受體活性、類固醇激素受體活性、G蛋白偶聯(lián)的胺受體活性、轉(zhuǎn)錄因子活性等分子功能（圖3）。

圖3 GO富集分析的生物過程、細(xì)胞組分和分子功能結(jié)果

圖4 KEGG富集分析的通路結(jié)果

然后，是基因通路的注釋，把培土生金方有效活性成分中治療COPD 的193 個(gè)候選靶點(diǎn)通過ClusterProfiler（pV＜0.05，qV＜0.05）進(jìn)行 KEGG 通路富集分析。

結(jié)果顯示，富集的信號(hào)通路主要涉及PI3K-Akt信號(hào)通路、MAPK 信號(hào)通路、TNFα信號(hào)通路、HIF-1 信號(hào)通路、小細(xì)胞肺癌和非小細(xì)胞肺癌等，其中富集了最多的靶點(diǎn)是PI3K-Akt 和MAPK 信號(hào)通路，分別是31個(gè)和28個(gè)（圖4）。

接著，為了進(jìn)一步探索培土生金方作用于COPD的靶點(diǎn)在相關(guān)通路中所發(fā)揮的作用及其間相互關(guān)系，把靶點(diǎn)名稱轉(zhuǎn)換成entrezID 后，通過KEGG 數(shù)據(jù)庫(kù)把靶點(diǎn)映射到信號(hào)通路上，其中紫色標(biāo)識(shí)即為輸入靶點(diǎn)。利用KEGG 數(shù)據(jù)庫(kù)中KEGG Mapper 獲取相關(guān)通路，挑選出上述核心基因進(jìn)行標(biāo)記，梳理反應(yīng)過程，同時(shí)進(jìn)行文獻(xiàn)檢索，結(jié)合專家意見，進(jìn)行科學(xué)的篩選與分析，最后進(jìn)行整合得到最終通路。主要信號(hào)通路涉及PI3-AKT、NF-κB、AMPK、Th17 CELL 等，其中PI3-AKT信號(hào)通路見圖5。

2.6 作用靶點(diǎn)的驗(yàn)證結(jié)果

根據(jù)方法學(xué)部分所述，下載GSE76925 數(shù)據(jù)集，經(jīng)過篩選一共獲得差異基因771 個(gè)，其中上調(diào)基因49個(gè)，下調(diào)基因622個(gè)，差異基因的火山圖見圖6，將所獲得的差異表達(dá)基因與肺康顆粒對(duì)COPD 的潛在作用靶點(diǎn)互相映射，交叉驗(yàn)證靶蛋白取交集獲得8 個(gè)共有靶蛋白，分別是：PPP3CA、NCOA1、IKBKB、PLA2G4A、CAT、BCHE、HSPA5，可能為培土生金方主要活性成分重要成分治療COPD 的潛在關(guān)鍵靶蛋白；另外，差異表達(dá)基因排名前六位的基因分別是：AGR3、ESM1、SLC12A2、KLF5、EMP2、SUMO1，可作為COPD 的潛在標(biāo)靶。

3 討論

近年來的臨床研究表明，培土生金方在COPD 患者中具有一定療效，在減輕患者臨床癥狀、改善肺功能、減輕氣道重塑有一定作用[31]，改善COPD 穩(wěn)定期患者咳嗽、氣促、喘息、易感冒、自汗、食欲減退等COPD患者證候，可能與通過降低外周血IL-8水平而減輕氣道炎癥反應(yīng)有關(guān)[32]，培土生金法聯(lián)合西醫(yī)常規(guī)方案治療COPD 穩(wěn)定期肺脾氣虛證患者，在咳痰、納呆、腹脹等癥狀方面，療效優(yōu)于單純西醫(yī)治療，臨床癥狀改善可能與IL-4 水平下降相關(guān)[33]。此外，循證醫(yī)學(xué)系統(tǒng)評(píng)價(jià)和Meta分析的結(jié)果也表明，中醫(yī)理論培土生金法指導(dǎo)下的COPD 患者治療中，具有一定優(yōu)勢(shì)，能夠提高臨床治療COPD 總有效率[34]，改善COPD 穩(wěn)定期患者的肺功能，提高患者的生活質(zhì)量和營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)[34]，但此類循證醫(yī)學(xué)證據(jù)同時(shí)也指出現(xiàn)有研究質(zhì)量偏低，需開展更高質(zhì)量的RCT加以驗(yàn)證。

圖5 培土生金方在PI3-AKT信號(hào)通路中預(yù)測(cè)的作用靶點(diǎn)

圖6 差異表達(dá)基因的火山圖

3.1 培土生金方具有多個(gè)潛在活性成分

通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法，發(fā)現(xiàn)培土生金方中多個(gè)活性成分可以作用于同一靶點(diǎn)，單個(gè)活性成分也可以作用于多個(gè)靶點(diǎn)，通過多條信號(hào)通路協(xié)同發(fā)揮作用。其中，五指毛桃（Ficus hirta Vahl）是嶺南地區(qū)常見的藥用植物，有較高的藥用價(jià)值，其性平味甘，具有健脾補(bǔ)肺、行氣利濕、舒筋活絡(luò)、止咳平喘等功效，臨床主用于治療脾虛浮腫、食少無力、肺癆咳嗽、病后體弱、風(fēng)濕痹痛等病證。五指毛桃含有補(bǔ)骨脂素（Psoralen）、木犀草素（Luteolin）、芹菜素（Apigenin）、異補(bǔ)骨脂內(nèi)酯（Ispsoralen）等化學(xué)成分，這些物質(zhì)都具有較強(qiáng)的清除自由基能力，有較好的抗氧化應(yīng)激活性[36]，具有多種呼吸系統(tǒng)疾病的保護(hù)作用。補(bǔ)骨脂素（Psoralen）能夠抑制NF-κB 的活化，減少促炎因子及趨化因子的分泌[36]，補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素還能夠下調(diào)TGF-β1；佛手柑內(nèi)酯（Bergapten）顯著抑制中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞向損傷部位的募集，并促進(jìn)中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞從傷口部位的清除，具有潛在抗炎和促分解活性[38]，其抗炎特性[38]，可能是炎癥治療的潛在小分子藥物；NF-κB信號(hào)通路主要參與免疫和炎癥反應(yīng)相關(guān)信號(hào)通路，傘形花內(nèi)酯（Umbelliferone）抑制MAPK/NF-κB 通路分子的表達(dá)[40]，減弱肺組織中炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)，并減少脂多糖（LPS）誘導(dǎo)的炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生，抑制TLR4/MyD88/NF-κB 途徑的激活，對(duì) LPS 誘導(dǎo)的 ALI 發(fā)揮了重要的保護(hù)作用[41]；柚皮素（Narigenin）減少了LPS 處理的正常人支氣管上皮中NF-κB 和MAPK 信號(hào)通路的激活，從而降低了TNF-α和IL-6的分泌以及mRNA表達(dá)，對(duì)支氣管上皮的損傷具有保護(hù)作用[42]；芹菜素對(duì)百草枯誘導(dǎo)的急性肺損傷和免疫毒性具有保護(hù)作用[43]；木犀草素通過下調(diào)miR-132 減輕LPS 誘導(dǎo)的NF-κB 信號(hào)通路的激活，對(duì)支氣管肺炎的炎癥性損傷具有保護(hù)作用[44]。大黃素（Emodin）通過抑制NF-κB、p38 MAPK 等通路的活性，來抑制TNF-α、IL-6、IL-1β和基質(zhì)金屬蛋白酶-9的表達(dá)，從而發(fā)揮抗炎作用[45]。

太子參（Pseudostellariae Radix）的多糖成分被認(rèn)為是主要的活性成分，具有免疫調(diào)節(jié)和抗疲勞作用[46]；茯苓（Poria cocos）主要含有的化學(xué)成分是多糖類、三萜類、甾醇類等，具有抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、抗炎、抗氧化等藥理作用[47]；白術(shù)（Atractylodes macrocephala）含有揮發(fā)油、多糖和內(nèi)酯類成分等活性成分，具有抗腫瘤、抗炎、調(diào)節(jié)胃腸功能等藥理作用，抑制細(xì)胞中TNF-α、IFN-γ和 IL-1β的表達(dá)，對(duì)慢性支氣管炎、過敏性鼻炎和哮喘具有免疫調(diào)節(jié)作用[48]；苦杏仁（apricot kernel）的主要化學(xué)成分有苦杏仁苷、脂肪油、多種維生素及礦物質(zhì)元素等，具有鎮(zhèn)咳平喘、抗炎止痛的藥理作用，苦杏仁苷還能通過抑制NF-κB 和NLRP3 信號(hào)通路對(duì)LPS 誘導(dǎo)的急性肺損傷起到保護(hù)作用[48]；紫蘇子（Perilla seeds）中的β-胡蘿卜素通過抑制巨噬細(xì)胞中的 NF-κB，JAK2/STAT3 和JNK/p38 MAPK 信號(hào)通路來減輕LPS誘導(dǎo)的炎癥[50]。

3.2 培土生金方涉及多個(gè)潛在核心標(biāo)靶及信號(hào)通路

結(jié)合圖1 和表2 可知，培土生金方潛在核心標(biāo)靶排名前 10 位的是：AKT1、IL6、TP53、VEGFA、JUN、MAPK1、CASP3、TNF、ESR1、NOS3，富集的信號(hào)通路主要涉及PI3K-Ak、MAPK、TNFα、HIF-1、NF-κB 及小細(xì)胞肺癌和非小細(xì)胞肺癌等。其中，①血管生成因子可激活PI3K/AKT/mTOR 的靶標(biāo)啟動(dòng)血管生成過程，白細(xì)胞介素6（IL6）是間接促進(jìn)血管生成的細(xì)胞因子，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）是直接促進(jìn)血管生成的細(xì)胞因子，其在缺氧條件下作為缺氧誘導(dǎo)因子（HIF-1α）的作用而釋放，HIF-1α還可通過激活EGFR/PI3K/AKT途徑上調(diào)炎癥因子的表達(dá)，促進(jìn)COPD 的炎癥反應(yīng)[51]，并引起支氣管細(xì)胞的重新調(diào)節(jié)和炎癥，細(xì)胞的重新調(diào)節(jié)和炎癥導(dǎo)致例如COPD、哮喘、纖維化和肺癌等各種肺部疾病的發(fā)展[52]，表明VEGF 的過表達(dá)與肺部疾病之間存在相關(guān)性，培土生金方可能通過減少VEGF 的過表達(dá)而對(duì)COPD 起到治療作用，抑制PI3K/AKT 的信號(hào)傳導(dǎo)還可能有助于COPD 肺泡損傷得以修復(fù)[53]。②氣道粘液分泌是保護(hù)宿主的重要先天免疫反應(yīng)，但是主要由MUC5AC 組成的粘液分泌過多和分泌過多是COPD 的重要危險(xiǎn)因素，通過抑制NF-κB 信號(hào)通路的轉(zhuǎn)錄活性及其上游效應(yīng)子的磷酸化，還可能降低TNF-α誘導(dǎo)的 MUC5AC mRNA 和蛋白的表達(dá)水平[53]，培土生金方的多個(gè)主要成分涉及調(diào)控NF-κB 信號(hào)通路，可能是其對(duì)COPD 作用的機(jī)理之一。③TNFα通過誘導(dǎo)炎性細(xì)胞積聚，刺激炎性介質(zhì)的產(chǎn)生，引起氧化和亞硝化應(yīng)激，氣道高反應(yīng)性和組織重塑，在COPD 的病理過程中發(fā)揮多種作用[55]，干預(yù)TNFα的靶向劑可能成為COPD 炎癥的治療標(biāo)靶。④培土生金方還在癌癥方面顯示出一定的潛力，富集到肺癌相關(guān)信號(hào)通路，如五指毛桃的主要成分之一木犀草素被發(fā)現(xiàn)具有抗癌作用，通過抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，免受致癌性刺激和激活細(xì)胞周期阻滯，通過不同的信號(hào)傳導(dǎo)途徑誘導(dǎo)凋亡，從而在體內(nèi)外阻斷癌癥的發(fā)展[55]，木犀草素和槲皮素還能促進(jìn)癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移[57]。

為了進(jìn)一步探討和驗(yàn)證靶點(diǎn)預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性，從基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫(kù)（GEO）下載COPD 相關(guān)的基因芯片數(shù)據(jù)集，篩選COPD 患者和健康對(duì)照組之間的差異表達(dá)基因：AGR3、ESM1、SLC12A2、KLF5、EMP2、SUMO1，可作為COPD 的潛在標(biāo)靶，之后與網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究結(jié)果比對(duì)，獲得8 個(gè)共有靶蛋白：PPP3CA、NCOA1、IKBKB、PLA2G4A、CAT、BCHE、HSPA5；其中，研究發(fā)現(xiàn)COPD患者的小氣道和肺血管中（Krüppel-like factor 5）KLF5的表達(dá)上調(diào)[57]，并且可能參與了COPD 的組織重塑；研究發(fā)現(xiàn)，與健康受試者相比，診斷為COPD 患者的血漿中（丁酰膽堿酯酶）BCHE 的活性大大降低[59]，BCHE 活性的改變可能與COPD 患者的氧化和炎癥過程有關(guān)，從而使這些酶成為COPD 疾病的標(biāo)志物[60]，這些潛在靶點(diǎn)可能為培土生金方主要活性成分治療COPD 的潛在關(guān)鍵靶蛋白。

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究表明，培土生金方復(fù)方活性成分干預(yù)COPD 大鼠，在其肺泡結(jié)構(gòu)方面，降低IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-17 的含量，可能通過TLR4/NF-κB 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路干預(yù)炎癥基因的表達(dá)，減輕COPD 大鼠的炎癥反應(yīng)[61]；增加COPD大鼠的Treg細(xì)胞表達(dá)，降低Th17相關(guān)細(xì)胞因子IL-17、IL-23 表達(dá)，進(jìn)而平衡外周血中Th17/Treg 比率，減輕COPD 大鼠炎癥反應(yīng)[62]。臨床研究表明，培土生金方復(fù)方還能降低COPD 患者誘導(dǎo)痰中炎癥因子IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-17 的水平，一定程度改善患者肺功能、改善患者生存質(zhì)量和減少急性發(fā)作次數(shù)[63]。

祖國(guó)醫(yī)學(xué)理論體系五行學(xué)說認(rèn)為，五臟相生相克，脾為肺之母，肺為脾之子，培脾土以生肺金。培土生金方以肺脾相關(guān)理論為指導(dǎo)，充分發(fā)揮中醫(yī)藥調(diào)治慢性疾病的優(yōu)勢(shì)，以中醫(yī)培土生金大法為指導(dǎo)，根據(jù)按照中醫(yī)君、臣、佐、使組方原理和臨床經(jīng)驗(yàn)方，逐漸篩選出五指毛桃、茯苓、白術(shù)、太子參、紫蘇子和苦杏仁的六味藥物組方。方中太子參補(bǔ)益脾胃中焦之氣，五指毛桃益氣通絡(luò)，兩者共為君藥；茯苓健脾補(bǔ)中，寧心安神，白術(shù)補(bǔ)脾益氣，燥濕固表共為臣藥；杏仁泄肺降氣，蘇子降氣平喘共為佐使之藥；諸藥合用，補(bǔ)益中焦脾胃，使肺脾之氣充旺，達(dá)到平喘止咳的治療目的，臨床實(shí)踐表明，該方具有多元化治療穩(wěn)定期COPD 的特點(diǎn)，可減輕COPD 患者的癥狀，改善其活動(dòng)能力，提高生存質(zhì)量。

從中藥復(fù)方君臣佐使的角度分析，君臣佐使表明方中藥物在方中的位置和治療中的主次和協(xié)同拮抗關(guān)系，是藥物配伍的基本原則，君藥起主要治療作用，臣藥就是輔助君藥加強(qiáng)治療作用，因此，從理論上講，君藥的作用靶點(diǎn)最多，臣藥次之，本文依據(jù)作用靶點(diǎn)的多少和君臣佐使的對(duì)應(yīng)關(guān)系，進(jìn)一步闡釋中藥方劑的配伍作用。培土生金方中君藥五指毛桃預(yù)測(cè)出653個(gè)潛在靶點(diǎn)，太子參82個(gè)潛在靶點(diǎn)，兩者靶點(diǎn)總共735個(gè)，占該復(fù)方總靶點(diǎn)的60%以上，據(jù)此推測(cè)是對(duì)COPD起到主要作用的藥物組合；茯苓預(yù)測(cè)出26 個(gè)潛在靶點(diǎn)，白術(shù)預(yù)測(cè)出17 個(gè)潛在靶點(diǎn)，兩者靶點(diǎn)總共43 個(gè)，茯苓白術(shù)共為臣藥；苦杏仁潛在靶點(diǎn)178個(gè)，紫蘇子潛在靶點(diǎn)156 個(gè)，兩者靶點(diǎn)總共334 個(gè)，共為佐使藥，靶點(diǎn)占復(fù)方總靶點(diǎn)30%，雖名義為佐使藥，但是靶點(diǎn)數(shù)量仍較多，這與COPD 患者以咳嗽氣喘為主證的臨床特點(diǎn)相符，杏仁泄肺降氣、蘇子降氣平喘，符合COPD的診治特點(diǎn)，與中醫(yī)理論藥物配伍原則相一致。

本文采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析中藥復(fù)方起效的作用機(jī)制，存在以下局限性：中藥復(fù)方的作用是整體調(diào)節(jié)，本文采用單純的各個(gè)成分的分析，且未將藥物劑量考慮在內(nèi)，未對(duì)復(fù)方配伍中的劑量關(guān)系層次進(jìn)行探討，難以綜合評(píng)價(jià)中藥方劑的配伍作用，有待進(jìn)一步深入研究。

綜上所述，培土生金方的多個(gè)潛在活性成分，可能通過AKT1、IL6、VEGFA、MAPK1、TNF 等多個(gè)核心靶點(diǎn)在PI3K-Akt、MAPK、TNFα、HIF-1、NF-κB 等多個(gè)信號(hào)通路，起到對(duì)COPD的治療作用。本研究結(jié)論可為下一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證提供線索和思路，培土生金方對(duì)COPD的作用機(jī)制還需進(jìn)一步的動(dòng)物和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)來證實(shí)。