齊保玉 ，孫 凱 ，2，銀 河 ＊＊，朱立國 ，2＊＊，金哲峰，陳 忻，楊博文，陳 琳

（1. 中國中醫(yī)科學(xué)院望京醫(yī)院 北京 100102；2. 中醫(yī)正骨技術(shù)北京市重點實驗室 北京 100007）

脊髓損傷（Spinal cord injury，SCI）是由各種因素所導(dǎo)致的中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷的疾病，分為原發(fā)性SCI和繼發(fā)性SCI，以損傷平面及以下軀體運動、感覺功能障礙為主要臨床表現(xiàn)，是目前困擾世界醫(yī)學(xué)的難題之一，治療難度大且具有損傷不可逆性的特點，是一種高致殘率、高病死率的疾病[1,2]。以慢性脊髓損傷造成的脊髓型頸椎?。–ervical Spondylotic Myelopathy，CSM）為例，據(jù)統(tǒng)計，脊髓型頸椎病的發(fā)病率為41/106，患病率為605/106，其發(fā)生率逐年升高呈現(xiàn)年輕化趨勢[3,4]。全球每年用于SCI 相關(guān)疾病治療和康復(fù)的費用數(shù)以億計，給社會和家庭帶來了沉重的經(jīng)濟負擔(dān)[5]。因此，開展脊髓損傷相關(guān)的機制及防治研究具有重要的現(xiàn)實意義。

目前，針對本病的治療手段十分有限，西醫(yī)主要采用手術(shù)減壓、糖皮質(zhì)激素和神經(jīng)節(jié)苷脂藥物治療、高壓氧治療等[6,7]。中醫(yī)藥是我國獨特的醫(yī)療資源，中醫(yī)將本病歸屬于“血痹”、“骨痹”、“痿證”等范疇，藥物治療主要以活血化瘀、益精填髓為主[8]。本研究的“益腎養(yǎng)髓方”是在古代經(jīng)典名方地黃飲子的基礎(chǔ)上凝練而成，在治療SCI方面具有一定的優(yōu)勢，尤其是用于治療手術(shù)指征不明顯的早中期CSM 患者已獲得較滿意的療效，一項臨床觀察研究表明，益腎養(yǎng)髓方治療總有效率達85.7%[9]。在另一項隨機對照安慰劑的研究中，益腎養(yǎng)髓方治療組的臨床療效顯效率為80.77%，顯著優(yōu)于對照組，并且在一定程度上能夠有效改善患者下肢運動功能和上肢感覺功能，進一步證實了其臨床療效[10]，但該方治療SCI 疾病的作用機制尚未闡明。隨著大數(shù)據(jù)時代的到來，建立在藥理學(xué)、生物信息學(xué)、計算機技術(shù)等多學(xué)科理論基礎(chǔ)上的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)應(yīng)運而生，其采用特定的算法對全球已構(gòu)建的藥物、疾病、基因等網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫進行虛擬篩選和綜合分析，為預(yù)測藥物作用于疾病的關(guān)鍵靶點和通路提供了可靠的研究平臺[11,12]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的提出和發(fā)展為中醫(yī)藥研究提供了強有力的理論依據(jù)和技術(shù)支撐，國內(nèi)諸多學(xué)者在網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究方面做了大量的工作，有力的推動了中醫(yī)藥的傳承與創(chuàng)新發(fā)展[13,14]。本文擬采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的技術(shù)方法預(yù)測“益腎養(yǎng)髓方”治療SCI相關(guān)疾病的關(guān)鍵靶點和可能作用機制，以期為該復(fù)方進一步研究提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 益腎養(yǎng)髓方活性成分及靶點篩選

通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫和分析平臺（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology，TCMSP ，http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）[15]、中藥綜合數(shù)據(jù)庫（Traditional Chinese Medicine Integrative Database ，TCMID，http://www.megabionet.org/tcmid/）[16]搜集益腎養(yǎng)髓方藥物的所有化學(xué)成分，藥物組成：巴戟天、熟地黃、丹參、鬼箭羽等9味藥組成，時間截止至2019 年 4 月 。 按 照 口 服 生 物 利 用 度（Oral bioavailability，OB）≥30%和類藥性指數(shù)（Drug-like index，DL）≥0.18的參考值對所有化學(xué)成分進行篩選，并通過數(shù)據(jù)庫檢索獲得的有效活性成分的潛在靶點。

1.2 SCI疾病相關(guān)靶點的收集

以“Spinal cord injury”為關(guān)鍵詞檢索，采用GeneCards（https://www.genecards.org/）[17]、TTD 數(shù) 據(jù) 庫（https://db.idrblab.org/）[18]、OMIM 數(shù) 據(jù) 庫（https://www.omim.org/）收集SCI 疾病相關(guān)的靶點。并通過Uniprot數(shù)據(jù)庫（https://www.uniprot.org/）[19]對靶點進行轉(zhuǎn)化。

1.3 益腎養(yǎng)髓方—SCI疾病靶點與PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將獲得的益腎養(yǎng)髓方藥物靶點與SCI疾病靶點導(dǎo)入Cytoscape3.5.1 軟件[20]，構(gòu)建中藥—成分—靶點—疾病的網(wǎng)絡(luò)圖。將藥物與疾病共有的靶點蛋白通過STRING 11.0（https://string-db.org/）[21]在線數(shù)據(jù)庫進行分析，構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)（protein-protein interaction，PPI），設(shè)置相互作用閾值＞0.99，獲取相應(yīng)的數(shù)據(jù)供后續(xù)分析。

1.4 GO功能富集分析和KEGG通路富集分析

將獲得的關(guān)鍵靶點進行基因本體論（Gene Ontology，GO）功能富集分析（P＜ 0.05），闡釋作用靶點的生物學(xué)功能。其次，將獲得的關(guān)鍵靶點進行京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路富集分析（P＜ 0.05），闡明益腎養(yǎng)髓方治療SCI 的相關(guān)信號通路。研究流程圖見圖1。

2 結(jié)果

2.1 益腎養(yǎng)髓方活性成分及靶點篩選

通過檢索共獲得益腎養(yǎng)髓方化學(xué)成分1071個，根據(jù)OB ≥ 30%，DL ≥ 0.18 閾值篩選，并刪除重復(fù)后共獲得益腎養(yǎng)髓方有效活性成分139 個（表1）。篩選獲得有效活性成分的靶點共1597 個，刪除重復(fù)后共獲得217個藥物靶點。

2.2 SCI疾病相關(guān)靶點的收集與中藥—成分—靶點—疾病的網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建

通過 GeneCards、TTD 數(shù)據(jù)庫、OMIM 數(shù)據(jù)庫分別檢索到SCI的相關(guān)靶點1518個、3個、7個，刪除重復(fù)后共獲得SCI 疾病相關(guān)靶點1524 個。隨后通過Cytoscape3.5.1 軟件構(gòu)建中藥—成分—靶點—疾病的網(wǎng)絡(luò)圖（圖2）。并獲得益腎養(yǎng)髓方藥物治療SCI 共有靶點118個。

2.3 益腎養(yǎng)髓方治療SCI的PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將共同靶點通過STRING 11.0在線數(shù)據(jù)庫（https://string-db.org/）構(gòu)建PPI互作網(wǎng)絡(luò)，將物種定義為人，設(shè)置最高置信度蛋白質(zhì)參數(shù)評分值＞0.99，其他設(shè)置不變，獲取相應(yīng)的蛋白相互作用信息，獲得關(guān)鍵靶點蛋白 107 個（圖 3）。根據(jù) Count 值列舉前 30 的關(guān)鍵靶點（圖4）。

圖1 益腎養(yǎng)髓方治療SCI的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究流程圖

表1 益腎養(yǎng)髓方主要有效活性成分

續(xù)表

續(xù)表

續(xù)表

續(xù)表

圖2 中藥—成分—靶點—疾病的網(wǎng)絡(luò)圖

圖3 益腎養(yǎng)髓方治療SCI疾病PPI網(wǎng)絡(luò)

圖4 益腎養(yǎng)髓方治療SCI疾病PPI網(wǎng)絡(luò)關(guān)鍵靶點（排名前30）

2.4 關(guān)鍵靶點的GO功能富集分析

利用Cytoscape 軟件功能對118 個關(guān)鍵靶點的功能進行富集分析，確定了158 個GO 條目，主要涉及到細胞因子受體結(jié)合、磷酸酶結(jié)合、跨膜受體蛋白激酶活性、生長因子結(jié)合等各方面，GO 功能富集分析排名靠前的條目主要是細胞因子受體結(jié)合（GO:0005126 cytokine receptor binding）、轉(zhuǎn)錄因子活性，RNA 聚合酶II 近端啟動子序列特異性DNA 結(jié)合（GO:0000982 transcription factor activity, RNA polymerase II proximal promoter sequence-specific DNA binding）、受體配體活性（GO:0048018 receptor ligand activity）、轉(zhuǎn)錄激活因子活性，RNA聚合酶II轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)序列特異性DNA結(jié)合（GO: 0001228 transcriptional activator activity, RNA polymerase II transcription regulatory region sequencespecific DNA binding）、細胞因子活性（GO:0005125 cytokine activity）等，列舉了前20個條目（表2，圖5）。

2.5 關(guān)鍵靶點的KEGG通路富集分析

在KEGG 通路富集分析中，確定了142 條信號傳導(dǎo)通路，涉及到細胞炎癥、凋亡、衰老等通路，通路富集分析的條目主要是糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號通路（hsa04933 AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications）、PI3K-Akt 信號通路（hsa04151 PI3K-Akt signaling pathway）、卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染（hsa05167 Kaposi sarcoma-associated herpesvirus infection）、人巨細胞病毒感染（hsa05163 Human cytomegalovirus infection）、IL-17 信號通路（hsa04657 IL-17 signaling pathway）等，列舉了前20 個條目（表3、圖6）。

3 討論

脊髓損傷是脊柱相關(guān)最嚴重的疾病或并發(fā)癥之一，其治療一直是國內(nèi)外學(xué)者研究的重點與難點。中醫(yī)認為，脊髓損傷主要由墜墮打仆等外因和筋脈失養(yǎng)等內(nèi)因造成，與督脈、任脈、沖脈密切相聯(lián)，病因病機十分復(fù)雜，治療原則視脊髓損傷不同的階段和表現(xiàn)而定，急性早期損傷以實為主，宜活血行氣、化瘀通絡(luò)，慢性長期損傷以虛為主，宜養(yǎng)血補氣，填精生髓[22,23]。《靈樞經(jīng)·寒熱病論》中記載：“身有所傷，血出多，及中風(fēng)寒。若有所墮墜，四肢懈惰不收，名曰體惰。”這與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對于脊髓損傷的認識大同小異。譚明生教授[24]提出了“病證結(jié)合，從督論治”脊髓損傷的思路，王明新[25]等認為急性期脊髓損傷藥物治療必須以“祛瘀通督”為指導(dǎo)。實踐表明在中醫(yī)經(jīng)理論指導(dǎo)下的方藥，如補陽還五湯[26]、益腎養(yǎng)髓方[9,10]等均可以有效改善輕、中度脊髓壓迫和損傷的患者的癥狀，臨床療效確切，但其內(nèi)在分子機制卻尚未明確。

本研究搜集中藥化學(xué)成分主要基于TCMSP 數(shù)據(jù)庫[15]及華東師范大學(xué)研發(fā)的TCMID 數(shù)據(jù)庫[16]，其中TCMSP 數(shù)據(jù)庫是西北農(nóng)林科技大學(xué)王永華教授團隊研發(fā)的，包括中國藥典注冊的499種中藥，含29,384種成分，3,311 個靶標和837 個相關(guān)疾病，是目前中藥網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究較為全面和公認的數(shù)據(jù)庫。從網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的角度證實，益腎養(yǎng)髓方中9 味藥物存在1 個藥物作用于多個靶點與1 個靶點對應(yīng)多個藥物的情況，是多靶點、多途徑共同發(fā)揮效應(yīng)的。方中betasitosterol、isoprincepin、sclareol 等活性成分涉及到抗炎、止痛、調(diào)節(jié)免疫、消腫、抗氧化、抗細胞調(diào)亡、利尿等現(xiàn)代藥理作用[27,28]，生物學(xué)功能與轉(zhuǎn)錄因子活性、細胞因子受體結(jié)合、磷酸酶結(jié)合、跨膜受體蛋白激酶活性等密切相關(guān)。研究表明，方中有效成分黃芪多糖能延緩SCI后的病理進程，改善大鼠BBB評分，促進脊髓功能修復(fù)[29]。方中有效成分丹參酮IIA 磺酸鈉可能通過炎癥相關(guān)途徑，抑制NF-κB 的活性，降低CX3CR1、TNF-αmRNA 的表達水平，從而減輕大鼠神經(jīng)病理性痛[30]。根據(jù)PPI 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)的結(jié)果得出，益腎養(yǎng)髓方治療 SCI 疾病最相關(guān)的基因有：STAT3（40）、AKT1（31）、JUN（30）、MAPK1（30）、IL6（26）、RELA（24）等，STAT3 是信號傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子蛋白家族中的重要成員，Herrmann JE[31]等研究表明 STAT3 是 SCI 后星形膠質(zhì)細胞增生和瘢痕形成的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。STAT3和SOCS3在SCI后的NG2細胞增殖和分化中發(fā)揮重要的調(diào)控作用[32]，而丹參酮IIA 能夠作用于此信號通路[33]。AKT1是SCI后修復(fù)的重要靶點。研究發(fā)現(xiàn)，通過激活A(yù)kt/ mTOR，減少自噬，能夠起到對神經(jīng)元的保護作用[34]。劉楊[35,36]等研究證實激活PI3K/Akt/mTOR信號途徑，有助于SCI早期神經(jīng)功能的修復(fù)，丹參注射液能夠顯著提高PI3K、Akt 及mTOR 的轉(zhuǎn)錄水平促進SCI 功能修復(fù)，而 Chen 等認為抑制 PI3K/Akt/mTOR 通路有利于減輕SCI 后膠質(zhì)瘢痕的形成[37]。在本研究KEGG 通路富集分析中顯示，PI3K/Akt 信號通路是預(yù)測作用的重要信號通路之一，但益腎養(yǎng)髓方治療SCI作用機制是否與調(diào)控Akt 靶蛋白表達及其磷酸化水平，影響Akt/mTOR 信號通路及調(diào)節(jié)細胞自噬水平有關(guān)，這可以作為今后研究探討的重要方向之一（圖7）。

表2 益腎養(yǎng)髓方治療SCI的GO功能富集分析

圖5 關(guān)鍵靶點GO功能富集分析情況（排名前20）

表3 益腎養(yǎng)髓方治療SCI關(guān)鍵靶點KEGG分析

圖6 關(guān)鍵靶點KEGG通路富集分析（排名前20）

圖7 PI3K/Akt/mTOR通路

隨著技術(shù)的飛速發(fā)展，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，在轉(zhuǎn)錄組水平上，microRNA 已成為SCI 后復(fù)雜的病理生理過程中重要的參與者和調(diào)控者，如miRNA-21等，在炎癥反應(yīng)、細胞增殖和凋亡和神經(jīng)再生與修復(fù)等方面發(fā)揮重要作用[38,39]。如何將有效復(fù)方作用機制或中藥單體與SCI 前沿?zé)狳c研究相結(jié)合，是值得我們深入思考的問題。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)已廣泛應(yīng)用于中藥復(fù)方及其配伍的研究，其可以有效預(yù)測中藥復(fù)方中的作用靶點及網(wǎng)絡(luò)，有利于復(fù)方的更深入研究和發(fā)現(xiàn)新適應(yīng)癥[40]。本文主要從網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的角度初步探討了益腎養(yǎng)髓方治療脊髓損傷的作用機制，初步揭示了其關(guān)鍵靶點、生物學(xué)途徑及相關(guān)的信號通路。盡管網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的整體性、系統(tǒng)性的特點與中醫(yī)藥整體觀、辨證論治、組方配伍的原則不謀而合[41]。但單純的成分—靶點—通路的分析未必能全面反應(yīng)中藥協(xié)同配伍調(diào)節(jié)的作用，且研究尚未對網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)篩選出的關(guān)鍵靶點和通路進行實驗的驗證，這也是本文存在的局限性。課題組前期通過初步實驗研究表明益腎養(yǎng)髓方具有促進受損脊髓組織內(nèi)神經(jīng)細胞的修復(fù)作用[10]。今后將基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)提供的信息，進一步通過細胞和動物水平對關(guān)鍵的靶點和通路進行驗證，為益腎養(yǎng)髓方治療CSM提供更加充分的依據(jù)。