韓文靜，徐 嬌，朱楚然，隋 春，魏建和

（中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院&北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥用植物研究所/中草藥物質(zhì)基礎(chǔ)與資源利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/瀕危藥材繁育國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室 北京 100193）

傘形科柴胡屬多年生草本植物北柴胡（Bupleurum chinenseDC.)，是我國(guó)藥典規(guī)定的中藥柴胡的基原植物之一。柴胡皂苷是北柴胡的主要藥效成分之一，具有抗炎、保肝、提高免疫力等作用[1]。堿性亮氨酸拉鏈（basic leucine zipper，bZIP）轉(zhuǎn)錄因子，是真核生物轉(zhuǎn)錄因子中分布最廣泛的家族之一[2]，植物bZIP 轉(zhuǎn)錄因子能夠參與調(diào)節(jié)多種生理功能，包括調(diào)節(jié)生長(zhǎng)發(fā)育、調(diào)節(jié)次生代謝及生物與非生物脅迫的應(yīng)答反應(yīng)[3-4]。根據(jù)擬南芥堿性區(qū)域及其他保守區(qū)域的相似性78 個(gè)bZIP 轉(zhuǎn)錄因子可劃分為13個(gè)組（A-I，S，M，K，J），同一組bZIP轉(zhuǎn)錄因子往往具有相似的結(jié)構(gòu)特征及功能[5-6]。本研究在生物信息分析轉(zhuǎn)錄組轉(zhuǎn)錄因子基因[7]基礎(chǔ)上，從北柴胡中克隆了1 個(gè)編碼bZIP 轉(zhuǎn)錄因子的基因BcbZIP179，其氨基酸序列與胡蘿卜（Daucus carotaL.）中的類(lèi)bZIP53 蛋白同源性最高。利用qRT-PCR 對(duì)BcbZIP179的組織表達(dá)特性及受MeJA 誘導(dǎo)的表達(dá)特性進(jìn)行分析，BcbZIP179可能與植物次生代謝相關(guān)。利用原核表達(dá)系統(tǒng)摸索出BcbZIP179適宜表達(dá)條件，獲得體外表達(dá)的融合蛋白，為制備抗體、分離互作蛋白和調(diào)控靶基因奠定基礎(chǔ)，為進(jìn)一步研究其功能提供條件。

1 材料與方法

1.1 材料

所用北柴胡品種中柴2號(hào)種植于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所藥用植物栽培育種試驗(yàn)地。BL21（DE3）、Transetta（DE3）菌株和原核表達(dá)載體 pET-28a、pEASY-Blunt E1 購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司。

1.2 試劑

高 保 真 DNA 聚 合 酶（PrimeSTAR HS DNA Polymerase）、PrimeScript? RT Master Mix 反轉(zhuǎn)錄試劑于寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司購(gòu)買(mǎi)；RNA 提取試劑盒（Total RNA Purification Kit，LC Sciences，Houston，USA）、DNA 純化回收試劑盒（Universal DNA Purification Kit）、質(zhì)粒小提試劑盒（TIAN prep Mini Plasmid Kit）于天根生物科技有限公司購(gòu)買(mǎi)；BamHI 和EcoRI 內(nèi)切酶、T4 DNA 連接酶于 NEB 公司購(gòu)買(mǎi)[8]；異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）于北京康為世紀(jì)生物科技有限公司購(gòu)買(mǎi)；SDS-PAGE預(yù)制膠于Bio-Rad公司購(gòu)買(mǎi)。

1.3 RNA提取與cDNA合成

采集二年生盛花期北柴胡的根、莖、葉、花、果實(shí)，以單株為生物學(xué)重復(fù)，重復(fù)3 次，樣品在液氮中速凍后-80℃保存?zhèn)溆?。北柴胡不定根培養(yǎng)參照文獻(xiàn)報(bào)道[9]。將培養(yǎng)21 天的不定根剪成約0.5 cm 的小段，更換到含有 0（CK）和 200 μmol·L-1MeJA 的培養(yǎng)基中，24℃、100 r·min-1振蕩暗培養(yǎng)，分別于0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h、48 h、72 h 和 5 天時(shí)取樣，液氮速凍后-80℃保存?zhèn)溆?。RNA 提取和cDNA 第1 鏈的合成均按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物稀釋至100 ng·μL-1，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 BcbZIP179基因的全長(zhǎng)克隆及序列分析

根據(jù)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中的轉(zhuǎn)錄因子基因序列，設(shè)計(jì)特異性引物（表1），以反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA 為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，獲得BcbZIP179的全部基因編碼序列。利用在線軟件ExPASy-PROSITE 確定BcZIP179的特征性bZIP 區(qū)域位置，ProtComp9.0 進(jìn)行亞細(xì)胞定位，NLSMapper 進(jìn)行核定位信號(hào)預(yù)測(cè)，TMHMM Server v.2.0 進(jìn)行跨膜結(jié)構(gòu)分析，SOPMA 進(jìn)行蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)分析，氨基酸序列比對(duì)在NCBI 的蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行。利用MEGA X 構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，bootstrap 重復(fù)次數(shù)為1000次。

表1 實(shí)驗(yàn)用引物

1.5 BcbZIP179基因表達(dá)分析

以MeJA 處理的北柴胡不定根及北柴胡植株不同組織器官為材料，內(nèi)參基因?yàn)锳ctin和β-Tublin，qPCR反應(yīng)使用LightCycler 96 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀進(jìn)行。SYBR Premix Ex Taq II（2×）7.5 μL，cDNA（100 ng·μL-1）0.8 μL 作為 PCR 反應(yīng)體系（15 μL），上下游引物（10 mmol·L-1）各 0.2 μL，ddH2O 3.8 μL。PCR 擴(kuò)增程序：95℃預(yù)變性3 min；58℃，30 s，40 個(gè)循環(huán)。3 次技術(shù)重復(fù)。相對(duì)表達(dá)量采用2-ΔΔCt法計(jì)算。

1.6 原核表達(dá)載體構(gòu)建

將BcbZIP179編碼區(qū)分別插入表達(dá)載體pET-28a和pEASY-Blunt E1 Vector 中，菌液PCR 驗(yàn)證后選擇陽(yáng)性克隆測(cè)序，序列比對(duì)完全正確的克?。ǚ謩e命名為E2-BcbZIP179 和E1-BcbZIP179）用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3）和Transetta（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，同時(shí)轉(zhuǎn)化空載體作為對(duì)照。

1.7 原核表達(dá)條件摸索

將轉(zhuǎn)化的空載體、重組質(zhì)粒E1-BcbZIP179 和E2-BcbZIP179 的表達(dá)菌株單克隆接種于含Amp（氨芐青霉素50 mg·L-1）的 LB 液體培養(yǎng)基中，180 r·min-1，37℃條件下振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，再按照1∶50 比例在新的LB 培養(yǎng)基中培養(yǎng)至D600 nm 約為0.6，加入IPTG 至終濃度分別為 0.5 和 0.05 mmol·L-1，繼續(xù)培養(yǎng) 12-16 h，設(shè)置37℃和16℃誘導(dǎo)表達(dá)溫度，離心收集菌體，加上樣緩沖液沸水浴變性5 min后，10%SDS-PAGE電泳分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 北柴胡BcbZIP179的序列分析

根據(jù)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，設(shè)計(jì)一次性擴(kuò)增BcbZIP179編碼區(qū)的特異引物，經(jīng)PCR、PCR 產(chǎn)物電泳、目的片段回收、克隆和測(cè)序，獲得編碼序列長(zhǎng)435 bp 的BcbZIP179基因，推測(cè)編碼144 個(gè)氨基酸。NCBI BLASTx 結(jié)果顯示，BcbZIP179與不同物種中的 bZIP53 或類(lèi) bZIP53 蛋白序列一致性比較高，其中與胡蘿卜中的類(lèi)bZIP53蛋白序列一致性最高，為78.62%（圖1）。SMART 結(jié)構(gòu)域分析顯示，在BcbZIP179的第23-86 氨基酸位置為bZIP 特征結(jié)構(gòu)域，說(shuō)明屬于S 亞家族，在結(jié)構(gòu)上和S 亞家族的擬南芥具有相同的保守結(jié)構(gòu)域（圖2）。

利用ExPASy-PROSITE 分析結(jié)果顯示BcbZIP179其bZIP 結(jié)構(gòu)域在26-76 位氨基酸位置，利用ProtComp 9.0 在線軟件與NLS Mapper 分別預(yù)測(cè)出該轉(zhuǎn)錄因子具有核定位信號(hào)，和其核定位信號(hào)存在于該蛋白氨基酸序列的第3-32 位，說(shuō)明BcbZIP179具有轉(zhuǎn)錄因子特征。利用TMHMM Server v. 2.0 軟件預(yù)測(cè)顯示不存在跨膜結(jié)構(gòu)域，而根據(jù)SOPMA 軟件二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)表明該蛋白符合亮氨酸拉鏈主要由α-螺旋組成的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，預(yù)測(cè)結(jié)果顯示：氨基酸序列含有66.67%α-螺旋，且第20-110位氨基酸之間主要為α-螺旋。

2.2 BcbZIP179基因表達(dá)分析

2.2.1BcbZIP179基因在北柴胡不同組織中的表達(dá)分析

在北柴胡不同組織器官中，根據(jù)qRT-PCR方法檢測(cè)BcbZIP179基因的相對(duì)表達(dá)量，表明在北柴胡各器官中BcbZIP179均有表達(dá)，其中果實(shí)的表達(dá)量最高，其次是莖中的表達(dá)量高于根、葉和花（圖3）。

2.2.2BcbZIP179基因受MeJA誘導(dǎo)的表達(dá)分析

利用qRT-PCR 方法檢測(cè)BcbZIP179基因在MeJA處理的不定根中的表達(dá)，結(jié)果表明，BcbZIP179在MeJA 處理后的24 h 內(nèi)，表達(dá)量逐漸升高，隨后表達(dá)量降低（圖4），但仍高于對(duì)照。MeJA 誘導(dǎo)的基因通常與次生代謝相關(guān)，提示該轉(zhuǎn)錄因子可能參與調(diào)控柴胡次生代謝。

2.3 BcbZIP179原核表達(dá)

為了獲得體外表達(dá)的BcbZIP179蛋白，用于后續(xù)BcbZIP179基因功能分析，采用2 種原核表達(dá)載體和2種表達(dá)菌株，在不同IPTG誘導(dǎo)濃度和誘導(dǎo)表達(dá)溫度條件下，進(jìn)行了BcbZIP179的原核表達(dá)分析。首先構(gòu)建原核表達(dá)載體，并能夠從重組載體上酶切到與預(yù)期片段大小一致的條帶。通過(guò)對(duì)較，采用Transetta（DE3）菌株比BL21（DE3）菌株的效果更好，低溫16℃的誘導(dǎo)效果優(yōu)于37℃。IPTG 的濃度對(duì)表達(dá)量的影響不大，0.05 mmol·L-1和 0.5 mmol·L-1條件下，表達(dá)量沒(méi)有明顯差異（圖5）。

圖1 BcbZIP179與其它物種bZIP53的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)

圖2 BcbZIP179與AtbZIP53(Arabidopsis)的氨基酸序列比對(duì)

圖3 BcbZIP179在北柴胡不同器官中的表達(dá)分析

圖4 BcbZIP179受MeJA誘導(dǎo)的表達(dá)分析

圖5 BcbZIP179重組蛋白的原核表達(dá)

3 討論

bZIP 轉(zhuǎn)錄因子廣泛存在于真核生物中，全基因組范圍的轉(zhuǎn)錄因子基因分析顯示，不同物種中bZIP 轉(zhuǎn)錄因子基因數(shù)目差異較大。擬南芥中有78 個(gè)bZIP 轉(zhuǎn)錄因子，水稻中有92 個(gè)，玉米中有125 個(gè)，油菜籽有247個(gè)[10]。bZIP 轉(zhuǎn)錄因子數(shù)量眾多，但只有少數(shù)bZIP 轉(zhuǎn)錄因子的功能在特定植物中得到解析[11-12]，更多bZIP 轉(zhuǎn)錄因子在不同物種中的表達(dá)調(diào)控機(jī)制還不清楚。目前已知bZIP 轉(zhuǎn)錄因子主要通過(guò)調(diào)節(jié)次生代謝產(chǎn)物的合成參與調(diào)節(jié)植物的生長(zhǎng)發(fā)育與環(huán)境變化的應(yīng)答反應(yīng)。bZIP 轉(zhuǎn)錄因子參與調(diào)控萜類(lèi)化合物、黃酮類(lèi)化合物及生物堿等多種化合物的合成，能夠增強(qiáng)植物的抗病性，適應(yīng)低溫脅迫，提高植物抵抗環(huán)境脅迫的能力。同時(shí)bZIP 轉(zhuǎn)錄因子通過(guò)調(diào)節(jié)次生代謝產(chǎn)物的合成調(diào)控植物的生長(zhǎng)、發(fā)育、開(kāi)花及結(jié)果。大量研究表明次生代謝產(chǎn)物是許多藥用植物的主要活性成分。bZIP轉(zhuǎn)錄因子不僅能夠提高植物的抗逆性，調(diào)節(jié)植物的生長(zhǎng)發(fā)育，還可以有效提高藥用植物中有效成分的含量[4]。本研究獲得了北柴胡中的1 個(gè)bZIP 轉(zhuǎn)錄因子基因BcbZIP179，并進(jìn)行了生物信息學(xué)分析。北柴胡BcbZIP179屬于類(lèi)bZIP53轉(zhuǎn)錄因子，擬南芥中的bZIP53研究較多，多與種子的成熟及幼苗形成有關(guān)[13-14]，也與擬南芥在逆境下的氨基酸代謝調(diào)控有關(guān)[15]。BcbZIP179在北柴胡各個(gè)組織器官中均有表達(dá)，但在果實(shí)中的表達(dá)高于其它組織器官，所以該基因可能與果實(shí)的成熟有關(guān)。BcbZIP179的表達(dá)還受MeJA 誘導(dǎo)，在處理的24 h時(shí)，表達(dá)量最高。MeJA 通常誘導(dǎo)脅迫條件下的次生代謝，所以該基因可能參與植物次生代謝的調(diào)節(jié)。BcbZIP179是否參與植物的次生代謝調(diào)節(jié)，具有與擬南芥bZIP53相似功能，有待進(jìn)一步探究。

bZIP53 屬于bZIP 家族中的S1 組，以往研究顯示S1 組成員往往與C 組成員相互作用，共同起調(diào)控功能[7]。為深入研究BcbZIP179的調(diào)控機(jī)制，有必要獲得北柴胡體內(nèi)與之相互作用的的蛋白及調(diào)控的靶基因，為此，本研究利用原核表達(dá)系統(tǒng)，獲得了體外表達(dá)的BcbZIP179融合蛋白，為后續(xù)制備抗體，篩選BcbZIP179調(diào)控的靶基因，深入開(kāi)展BcbZIP179的基因功能研究提供了條件。